原位光化學(xué)衍生快速檢測黃曲霉毒素熒光強度

（廣東省科學(xué)院廣東省分析測試研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省食品營養(yǎng)與安全快速檢測儀器工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070）

黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）可以由曲霉菌黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和偽溜曲霉4種真菌產(chǎn)生，其基本結(jié)構(gòu)是二呋喃環(huán)和香豆素。黃曲霉毒素廣泛存在于自然界中，目前已確定結(jié)構(gòu)的黃曲霉毒素達20余種，主要分為B族、G族及衍生物[1]。食品和中藥材在采集、加工、運輸和貯藏過程中如保存不當極易發(fā)生霉變，造成黃曲霉毒素污染。其中黃曲霉毒素B1（aflatoxins B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（aflatoxins B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxins G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxins G2，AFG2）較為常見[2-3]。1993 年國際癌癥研究機構(gòu)將AF確定為Ⅰ類致癌物[4]。AF對人體健康具有急性、慢性、致癌、免疫抑制等多種毒性危害作用。自然條件下產(chǎn)生的 AFB1、AFB2、AFG1、AFG24 種毒素殘留對人體的毒性往往具有協(xié)同和加和效應(yīng)，黃曲霉毒素總量（total aflatoxins，TAFs）檢測已成為當前食品質(zhì)量安全檢測領(lǐng)域發(fā)展的必然趨勢[5]。目前，我國只對食品中的黃曲霉毒素B1規(guī)定了限量要求，其中特殊膳食用食品限量0.5 mg/kg，其它食品限量 5 mg/kg～20 mg/kg[6]。而2020《中國藥典》對蓮子、薏苡仁等中藥材中黃曲霉毒素的限量規(guī)定為“每1 000 g含AFB1不得過5 mg，AFG2、AFG1、AFB2和 AFB1的總量不得超過 10 mg”[7]。

黃曲霉毒素具有熒光特性，在365 nm波長紫外光激發(fā)下，B族黃曲霉毒素發(fā)射波長為425 nm藍色熒光，G族黃曲霉毒素為450 nm黃綠色熒光[8-9]，這也是檢測黃曲霉毒素的基本原理之一。根據(jù)其熒光特性，主要的檢測方法包括薄層色譜法[10-11]、微柱篩選法[12]、熒光分光光度法[13-14]、高效液相色譜法[10]。熒光分光光度法/高效液相色譜法的靈敏度比薄層色譜法和微柱篩選法高，但是需要大型精密儀器，成本高，時間長，對檢測人員專業(yè)性要求高，難以滿足現(xiàn)場快速檢測需求。而黃曲霉毒素的熒光特性受溶劑的影響很大，容易發(fā)生熒光淬滅，熒光值減弱，因此需要進行衍生增強其熒光強度。目前常用的衍生方法包括：三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）衍生、碘衍生、溴衍生、光化學(xué)衍生、電化學(xué)衍生等[15]。其中光化學(xué)衍生具有操作簡單，重復(fù)性好、靈敏度高、衍生過程不引入化學(xué)試劑污染等優(yōu)勢。朱鵬飛等[16]、蔣孟圓等[17]、趙磊等[18]利用光化學(xué)衍生進行樣品前處理后測定其中黃曲霉毒素，結(jié)果均準確穩(wěn)定，基線平穩(wěn)，具有較高的性價比。本文以光化學(xué)衍生的方法增強黃曲霉毒素熒光強度，并優(yōu)化有機溶劑種類（乙腈、80%乙腈、甲醇和70%甲醇）和光化學(xué)衍生時間，利用黃曲霉毒素原位衍生熒光檢測儀實現(xiàn)操作簡易、成本低廉的黃曲霉毒素快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1標準品（≥99%）、黃曲霉毒素B2標準品（≥99%）、黃曲霉毒素G1標準品（≥99%）、黃曲霉毒素G2標準品（≥99%）：青島普瑞邦生物工程有限公司；甲醇（分析純）、乙腈（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

黃曲霉毒素原位衍生熒光檢測儀（以下簡稱原位衍生熒光檢測儀）：中國廣州分析測試中心自制（專利號：CN202010573958.5）；吸收和三維熒光掃描光譜儀（AqualogR）：日本 HOR IBA 公司；離心機（TD5G）：上海盧湘離心機儀器公司；BT分析天平（BT25S）：北京賽多利斯科學(xué)儀器公司；石英比色皿（10 mm）：宜興市晶科光學(xué)儀器有限公司。

1.3 標準溶液配制

標準儲備溶液（10 μg/mL）：分別精確稱取 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標準品各 1 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，在-20℃下避光保存，備用。

標準工作溶液（100 ng/mL）：分別準確移取標準儲備溶液（1.0 μg/mL）1.0 mL 至 100 mL 容量瓶中，用有機溶劑定容。此溶液密封后避光-20℃下保存，3個月內(nèi)有效。

標準系列工作溶液：準確移取黃曲霉毒素標準工作液（100 ng/mL）0.025、0.125、0.50、1.25、2.50、5.00 mL于25 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度，配制 濃度點為 0.10、0.50、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL的黃曲霉毒素系列標準溶液。

1.4 方法

1.4.1 儀器工作條件

原位衍生熒光檢測儀：激發(fā)波長365 nm，電壓3.10 V，門控 10 ms，測試時間 10 s。

熒光掃描光譜儀：激發(fā)波長365nm，增量3.54 nm。

1.4.2 原位衍生熒光檢測儀原理

原位衍生熒光檢測儀包括檢測室、激發(fā)光源、熒光檢測器和光化學(xué)衍生模塊[19]，如圖1所示。

檢測室上設(shè)有發(fā)射熒光的單色器和單光子計數(shù)器探頭，樣品放入檢測室后經(jīng)光化學(xué)衍生模塊進行原位光化學(xué)衍生，增強黃曲霉毒素的熒光效應(yīng)，提高檢測靈敏度。再由激發(fā)光源提供365 nm波長紫外光激發(fā)樣品后產(chǎn)生發(fā)射熒光，發(fā)射熒光經(jīng)單色器截止背景散射光后產(chǎn)生400 nm～500 nm波段熒光，經(jīng)單光子計數(shù)器探頭檢測并輸入電信號至熒光檢測器進行檢測。

圖1 原位衍生熒光檢測儀的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of insitu derivatization fluorescence detector

1.4.3 不同溶劑對黃曲霉毒素熒光增強的影響

分別用4種有機溶劑：乙腈、80%乙腈溶液、甲醇、70%甲醇溶液按照 1.3.2的方法配制 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標準工作溶液（100 ng/mL），吸取 2.5 mL標準工作溶液于石英比色皿中，然后將石英比色皿放置原位衍生熒光檢測儀中進行光化學(xué)衍生4 min后，再按1.4.1的工作條件測定熒光強度。

1.4.4 光化學(xué)衍生時間對AFB1和AFG1熒光強度的影響

吸取2.5 mL70%甲醇溶液配制的5、10、20 ng/mL的AFB1、AFG1標準溶液于石英比色皿中，使用原位衍生熒光檢測儀分別按 0、1、2、3、4、5、6、7、10、15 min 進行光化學(xué)衍生，按1.4.1的工作條件測定熒光強度，并計算其光化學(xué)衍生前和后熒光強度的增加量（即熒光增量）。

1.4.5 黃曲霉毒素線性范圍和檢測限（limit of detection，LOD）

吸取2.5 mL黃曲霉毒素系列標準溶液，進行光化學(xué)衍生4 min后，按1.4.1的工作條件測定熒光強度。

方法檢測限的計算公式如式（1）[20]所示。

式中：δ為測定空白值的偏差；S為標準曲線的斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 原位衍生熒光檢測儀測定黃曲霉毒素的熒光增強效果

光化學(xué)衍生前后黃曲霉毒素熒光增強情況見表1。

由表1可知，光化學(xué)衍生前AFB1和AFG1的熒光值比AFB2和AFG2要弱，相差一個數(shù)量級。但是經(jīng)過光化學(xué)衍生后，AFB1的熒光強度增強了約7.6倍，AFG1的熒光強度增強了約5.5倍，極大地提高了AFB1和AFG1熒光信號，分別與AFB2和AFG2處于同一數(shù)量級中。而AFB2和AFG2熒光信號較強，光化學(xué)衍生對其無增強作用，反而隨著檢測時間的延長熒光信號有所衰減，但前后差異不大。因此，使用光化學(xué)衍生的方法可以對黃曲霉毒素總量（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）的熒光強度進行整體提升，提高其檢測靈敏度。

表1 光化學(xué)衍生前后黃曲霉毒素熒光增強情況Table 1 Fluorescence enhancement of aflatoxin before and after photochemical derivatization

原位衍生熒光檢測儀測定的熒光信號如圖2所示。

圖2 原位衍生熒光檢測儀測定黃曲霉毒素熒光信號圖Fig.2 Determination of aflatoxin fluorescence signal by insitu derivatization fluorescence detector

黃曲霉毒素熒光信號強，基線平穩(wěn)，且儀器檢測時間為10 s。該儀器將光化學(xué)衍生模塊與檢測器集成，在儀器內(nèi)對黃曲霉毒素進行原位光化學(xué)衍生，極大地簡化了檢測步驟，縮短了檢測時間。

2.2 不同溶劑對黃曲霉毒素熒光增強的影響

原位衍生熒光檢測儀測定黃曲霉毒素在不同溶劑中熒光強度如圖3所示。

圖3 原位衍生熒光檢測儀測定黃曲霉毒素在不同溶劑中熒光強度Fig.3 Determination of fluorescence intensity of aflatoxin in different solvents by insitu derivatization fluorescence detector

結(jié)果表明：未衍生前AFB1在4種溶劑中熒光強度差異不大，經(jīng)過光化學(xué)衍生后熒光強度在不同溶劑中依次遞增：乙腈＜80%乙腈＜甲醇＜70%甲醇溶劑，熒光增強效果顯著；未衍生前AFB2在70%甲醇溶劑中熒光強度最大，但是經(jīng)過光化學(xué)衍生后熒光強度都有微弱降低；未衍生前AFG1在乙腈中熒光強度最大，經(jīng)過光化學(xué)衍生后80%乙腈＜乙腈＜甲醇＜70%甲醇溶劑；未衍生前AFG2在4種溶劑中熒光強度差異不大，但是經(jīng)過光化學(xué)衍生后熒光強度都有微弱降低。

熒光掃描光譜儀測定黃曲霉毒素在不同溶劑中熒光強度如圖4所示。

結(jié)果表明，使用熒光掃描光譜儀測定黃曲霉毒素在不同溶劑中熒光強度結(jié)果與原位熒光檢測儀結(jié)果一致。4種溶劑中的AFB1和AFB2熒光峰值都在425 nm左右，AFG2的熒光峰值在450 nm左右，與Büchi等[8]和居乃琥[9]報道一致。而AFG2在乙腈溶劑中未衍生時熒光峰值為445 nm左右，但衍生后熒光峰值偏移至430 nm處，且熒光強度減弱，有可能是乙腈溶劑中AFG2紫外光作用下降解并生成了熒光強度較弱的物質(zhì)。

圖4 熒光掃描光譜儀測定黃曲霉毒素在不同溶劑中熒光強度Fig.4 Determination of fluorescence intensity of aflatoxin in different solvents by fluorescence scanning spectrometer

綜上所述，AFB2和AFG2的熒光信號較強，AFB1和AFG1的熒光信號弱，需要進行光化學(xué)衍生來增強熒光。在70%甲醇溶劑中AFB1、AFG1的光化學(xué)衍生熒光增強效果最顯著，優(yōu)于甲醇和乙腈。AFB1和AFG1在紫外光和水的作用下，被氫化，雙鍵打開后在環(huán)上引入羥基，生成熒光特性更強、更穩(wěn)定的AFB2和AFG2[21-22]，解決了AFB1和AFG1容易產(chǎn)生熒光猝滅的問題，提高了檢測靈敏度，同時也能降低檢測過程中基質(zhì)對結(jié)果的干擾。而AFB2和AFG2在70%甲醇溶劑中的熒光強度大且穩(wěn)定，因此選擇70%甲醇作為黃曲霉毒素的提取溶劑為最優(yōu)。

2.3 光化學(xué)衍生時間對AFB1和AFG1熒光強度的影響

將光化學(xué)衍生前后熒光增量歸一化后觀察不同衍生時間對AFB1和AFG1熒光強度的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同衍生時間下AFB1和AFG1熒光強度的變化Fig.5 Changes of fluorescence intensity of AFB1and AFG1under different derivatization time

3種不同濃度的AFB1和AFG1標準溶液的熒光增量趨勢基本一致，AFB1隨光化學(xué)衍生時間的加長其熒光增量先增大，3 min～4 min時達到峰值后逐漸減弱；而AFG1在5 min～7 min時達到峰值后趨于平緩。4種黃曲霉毒素中以AFB1的污染情況最為嚴重，AFB1的檢出率遠大于AFG1[23]，GB 2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》也只規(guī)定了AFB1的限量指標，同時考慮快速檢測對檢測時長的要求，因此選擇4 min為黃曲霉毒素的光化學(xué)衍生時間。

2.4 方法線性范圍和檢測限

以熒光強度為縱坐標，黃曲霉毒素濃度為橫坐標，建立 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的濃度標準曲線如圖 6所示，其回歸方程、R2、線性范圍、檢測限見表2。

圖6 原位衍生熒光檢測儀測定黃曲霉毒素濃度標準曲線Fig.6 Determination of aflatoxin concentration standard curve by insitu derivatization fluorescence detector

表2 黃曲霉毒素的回歸方程、R2、線性范圍、檢測限Table 2 Regression equation，R2，linear range，detection limit of aflatoxin

結(jié)果表明，該方法在0.1ng/mL～20.0ng/mL線性關(guān)系良好，R2為 0.998 4～0.999 8，方法檢測限在 0.15 ng/mL～0.37ng/mL之間，可以滿足快速檢測黃曲霉毒素的要求。

3 結(jié)論

通過對有機溶劑種類（乙腈、80%乙腈、甲醇和70%甲醇）和光化學(xué)衍生時間的優(yōu)化，建立了原位光化學(xué)衍生快速檢測黃曲霉毒素熒光強度的方法。該方法對AFB1和AFG1的熒光增強效果顯著，且AFB2和AFG2熒光強度強且穩(wěn)定，在0.1 ng/mL～20.0 ng/mL線性關(guān)系良好，R2為0.9984～0.9998，檢測限在0.15ng/mL～0.37 ng/mL，滿足快速檢測黃曲霉毒素的要求。同時該方法將光化學(xué)衍生與熒光檢測一體化，檢測時間短，操作簡單方便，在基層快速檢測人員和監(jiān)管部門快速篩查中具有廣泛的應(yīng)用前景。