熱反應紅燒風味豬肉香精酶解工藝的優(yōu)化

周晨晨，肖雋霏*，黃巖，蒲丹丹，張玉玉，楊肖*

（1.北京市食品風味化學重點實驗室，北京 100048；2.食品質量與安全北京實驗室，北京 100048）

中國是豬肉消費大國，我國人均購買量占比達到全球購買量的65.98%，超越了世界的平均水準[1-2]，在2020年對我國居民進行肉類消費情況的調查中，84.7%的居民以豬肉作為最常消費的肉類，超過6成的居民日均消費豬肉量在25 g以上[3]。豬肉具有高能量、高脂肪的特點，具有豐富的蛋白質、維生素等營養(yǎng)物質，是人們日常飲食的重要組成部分，其肉質柔軟，脂肪層次多且結締組織較少，經烹飪后滋味鮮美，受到廣大消費者的喜愛[4-5]。紅燒肉作為一道傳統(tǒng)中式菜肴也廣受歡迎[6]，而如今快節(jié)奏的生活對于美味的肉制品又增添了快捷便利的要求。

第三代肉味香精是先采用多種蛋白酶將肉類酶解成小分子物質（如小分子肽，氨基酸等），再將肉酶解液與還原糖以及其它配料發(fā)生熱反應，最后經過質構等工藝所制備而成[7-8]。例如喬凱娜等[9]利用電子舌、電子鼻與感官評價結合的方式，得到了制備紅燒風味香精的最佳復合酶配比：加酶量0.3%，木瓜蛋白酶∶風味蛋白酶∶菠蘿蛋白酶=2∶3∶1（質量比）；肖雋霏等[10]利用電子鼻與感官評價相結合，得到了制備排骨風味香精的最佳復合酶配比為木瓜蛋白酶∶菠蘿蛋白酶=2 ∶1（質量比），加酶量 0.2%；Cai等[11]利用中國蝦的下腳料水解產物在115℃，pH 8.0，加熱60 min的條件下得到的反應物具備肉香及海鮮風味，并且隨著加熱時間增長形成的美拉德反應產物積累產生誘人紅褐色，可用于具有強烈誘人風味和顏色的調味香精的生產；王艷榮[12]利用生物酶解技術確定臘肉香精最佳酶解條件：中性蛋白酶與風味酶配比為1∶2、加酶量0.35%、料液比 1∶2（g/mL）、酶解溫度 47℃，酶解時間 5 h；盧文靜[13]利用響應面分析方法，研究了反應溫度、反應時間和反應pH值3個因素對熱反應雞肉香精風味的影響，得到熱反應最佳工藝為：反應溫度90.64℃、反應時間101.40 min、反應pH 4.87。其中感官評價和電子舌傳感器能夠對食物的滋味進行評價或者能夠進行分類處理[14]，例如曹榮等[15]對不同采收期紫菜中游離氨基酸、呈味核苷酸等呈味物質的含量進行了測定，并利用電子舌進行滋味分析，得到電子舌可以作為快速評定不同采收期紫菜的技術手段；Ismail等[16]研究溫度-時間組合對通過電子舌測試的牛肉半腱肌的非揮發(fā)性成分和口味特征的影響，得出鮮味氨基酸和核苷酸化合物之間的協(xié)同作用與電子舌所感知的鮮味具有良好的相關性；Zhang等[17]利用感官評價進行了口味增添和缺失實驗對河豚關鍵滋味成分進行了分析，找出了關鍵物質 Gly-Thr-Pro-Pro-Pro-Phe-Val；Németh等[18]使用電子舌對綠色和橙色哈密瓜進行了區(qū)分和預測，準確率高達100%。而目前基于不同酶解條件對于紅燒風味豬肉香精滋味的影響的研究較少。

本文結合感官評價通過單因素試驗及正交試驗對酶解工藝進行優(yōu)化，考察酶解時間、酶解溫度以及酶解料液比三因素對酶解液中游離氨基酸含量的影響。通過對香精的滋味以及酶解液中的游離氨基酸進行分析，探究酶解工藝對紅燒風味豬肉香精風味的影響。旨在為傳統(tǒng)菜肴紅燒肉類的工業(yè)化、標準化進程提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精品豬后尖、精品豬五花、大蔥、生姜、花椒、八角、小茴香：北京市永輝超市；風味蛋白酶（10萬U/g）、木瓜蛋白酶（10萬 U/g）、菠蘿蛋白酶（10萬 U/g）：廣西南寧龐博生物有限公司；D-葡萄糖、D-木糖、L-半胱氨酸、硫胺素（VB1）、呈味核苷酸二鈉（I+G）：河南興源化工產品有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：飛賽爾科技（中國）有限公司；Durashell AA分析試劑盒：天津博納艾杰爾科技有限公司。其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

絞肉機（QSJ-B03H2）：廣東小熊電器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：鞏義市予華儀器有限責任公司；精密定時電動攪拌器（JJ-1）：金壇市榮華儀器制造有限公司；臺式高速冷凍離心機（TGL16M）：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；高效液相色譜儀（Agilent 1260）：安捷倫科技有限公司；電子舌（AstreeⅡ）：法國Alpha M.O.S公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解液的制備

酶解所使用的復合蛋白酶比例及用量參考喬凱娜等的文獻[9]。將豬后尖肉去除脂肪絞成肉泥，和飲用水按一定比例混勻，加熱攪拌，升溫至一定溫度后加入0.3%（占肉質量）的復合蛋白酶[木瓜蛋白酶∶風味蛋白酶 ∶菠蘿蛋白酶=2∶3∶1（質量比）]，恒溫酶解一段時間。酶解反應結束后立刻升溫至90℃，恒溫10 min進行滅酶活后得到豬肉酶解液，降至25℃?zhèn)溆?，重復試?次。

1.3.2 紅燒風味豬肉香精的制備

根據前期試驗研究結果，將豬肉酶解液30.00 g、葡萄糖1.50 g、木糖4.50 g、半胱氨酸0.70 g、VB10.30 g、I+G 0.20 g、豬油6.00 g、酵母膏 2.00 g、醬油 7.00 g、八角粉 0.03 g、花椒粉 0.03 g、小茴香粉0.03 g、生姜0.30 g、大蔥0.30 g，放入250 mL四口燒瓶中，在95℃條件下反應60 min，冷卻至25℃得到紅燒風味豬肉香精，重復試驗3次。

1.3.3 酶解工藝優(yōu)化

對以下因素進行單因素優(yōu)化：酶解溫度45、50、55、60、65 ℃，酶解時間 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，酶解料液比 3 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3（g/mL）。根據單因素試驗得到最佳酶解溫度、酶解時間及酶解料液比，在此基礎上，對于這3個因素進行正交試驗，得到制備紅燒風味豬肉香精的最優(yōu)酶解工藝。正交試驗因素水平見表1。

表1 紅燒風味豬肉香精酶解工藝正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design of the thermal reaction braised pork flavoring

1.3.4 感官評價方法

按照以下方法制備品評樣品：105.0 g香精稀釋液（香精與飲用水質量比=1∶6）加200.0 g五花肉（1.5 cm×2.0 cm左右的肉塊在170℃下油炸30 s后刷上飽和糖漿）以及0.4 g復合香料隔水燉煮2.0 h。

評價指標參考喬凱娜等[9]的文獻，鮮味（0.3）、紅燒肉特征風味（0.4）、和整體可接受度（0.3），其中 0.3、0.4、0.3為權重系數。鮮味的參照物為質量分數0.5%的味精溶液（10分）；紅燒肉特征風味以自制紅燒肉作為參照物（10分）。在之前研究中的方法上改動進行紅燒肉的制備[19]：將 1 000.0 g五花肉、20.0 g 蔥、20.0 g姜放入80.0 g食用油中大火炒制15 min左右，加入25.0 g紅燒醬油、100.0 g料酒、60.0 g冰糖炒制上色，后加入8.0 g食鹽和500.0 g水，小火燜60 min后收汁出鍋。

選取10名經驗豐富者對品評樣品進行感官評價，感官小組評價成員為年齡在22歲～35歲之間的5男5女，并接受基本五味、紅燒肉特征風味培訓，每次培訓重復打分3次，每次打分之間相差1 h，通過對10個感官品評人員培訓結果的統(tǒng)計分析，這10個評價人員對基本五味及紅燒肉特征滋味評分的相對標準偏差（relative standard deviation；RSD）值＜20%，培訓合格。每項指標評價分為5個等級，根據指標評價程度進行打分，打分標準為0～3分（不強）、4分～6分（輕微強）、7分～9分（較強）、10分～12分（強）、13分～15分（很強）[20]，最終根據加權總分大小判斷樣品風味。

1.3.5 游離氨基酸測定方法

酶解液中游離氨基酸的測定，使用高效液相色譜法進行分析。樣品前處理方法為：取6 g豬肉酶解液加入6 mL質量分數為20%的磺基水楊酸水溶液，在4℃、10 000 r/min下離心15 min，取上清液，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至 25 mL，連續(xù)過尼龍濾膜（0.45、0.22 μm）后加入內標（正纈氨酸和肌氨酸），待儀器檢測。每個樣品平行進樣3次，結果以“平均值±標準偏差”表示。測定條件[9]：色譜柱為 Durashell AA（4.6 mm×150 mm×3 μm）；流動相A（緩沖鹽溶液，磷酸氫二鈉和四硼酸鈉濃度均為0.025 mol/L，pH值為8.2）和流動相B[有機溶劑，甲醇和乙腈體積占比均為45%]洗脫梯度及流速如表2所示；柱溫45℃；進樣量2 μL；檢測波長分別為338 nm和262 nm。

表2 流動相洗脫梯度及流速Table 2 Elution gradient and flow rate of mobile phase

通過內標法定量，計算公式如下：

式中：Ci為某氨基酸在酶解液中的含量，mg/100 g；A0′為內標物在標品色譜圖中的峰面積，mAU×s；A0為內標物在酶解液色譜圖中的峰面積，mAU×s；Ai為某氨基酸在酶解液色譜圖中的峰面積，mAU×s；Ci′為某氨基酸在混標中的含量，μg/mL；Ai′為該氨基酸標品在混標色譜圖中的峰面積，mAU×s。

1.3.6 電子舌測定滋味

采用電子舌對紅燒風味香精進行滋味分析。將4.50 g香精樣品稀釋6倍后在4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，去除上層油脂后取上清液于電子舌進樣杯內待測。電子舌進樣條件：測樣時間120 s，清洗時間為10 s，每個樣品平行進樣6次。儀器軟件取第120 s測量值的響應信號作為穩(wěn)定數據區(qū)域的輸出值。取后3次測量數據進行統(tǒng)計分析。

1.4 數據處理

采用SPSS Statistics 17.0軟件、Excel根據4 d檢驗法[21]舍去離異值，對感官評價數據進行顯著性分析，采用電子舌配套軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 制備紅燒風味豬肉香精酶解工藝優(yōu)化試驗結果

2.1.1 最佳酶解溫度單因素試驗結果

不同酶解溫度制備的紅燒風味豬肉香精感官評價得分結果如圖1所示。

圖1 不同酶解溫度對制備紅燒風味豬肉香精感官評價的影響Fig.1 The effect of different enzymatic hydrolysis temperature on the sensory evaluation of thermal reaction braised pork flavor

由圖1可看出，感官評價得分在酶解溫度60℃時最高且與其他樣品的感官評分存在顯著性差異。蛋白酶的活性與溫度有關[22]，在45℃～55℃時隨著溫度的上升感官評價得分緩慢增加，在55℃～60℃增幅較大且在60℃評分最高，溫度超過60℃感官評分明顯下降，可能是由于蛋白酶在不同溫度下活性不同，酶解后釋放出的小分子物質含量存在差異，導致感官評分不同。該變化趨勢與常詩潔等對利用風味蛋白酶酶解雙孢蘑菇的工藝優(yōu)化中酶解溫度對感官評分影響先上升后下降的規(guī)律一致[23]。因此，選取溫度為60℃作為最佳酶解溫度。

2.1.2 最佳酶解時間單因素試驗結果

不同酶解時間制備的紅燒風味豬肉香精感官評價得分如圖2所示。

從圖2可得，隨著酶解時間的增加紅燒香精感官評價得分先上升后下降，在3.0 h條件下樣品的評分最高。而在3.0 h～5.0 h，隨著酶解時間的增加紅燒風味豬肉香精感官評價得分下降，可能是由于酶解時間過長導致氨基酸等物質進一步分解產生其它不良滋味。其中3.0 h條件下的感官評價得分最高且與其它樣品之間存在顯著性差異。因此，選取3.0 h為最優(yōu)酶解時間。

圖2 不同酶解時間對制備紅燒風味豬肉香精感官評價的影響Fig.2 The effect of different enzymatic hydrolysis time on the sensory evaluation of thermal reaction braised pork flavor

2.1.3 最佳酶解料液比單因素試驗結果

不同酶解料液比制備的紅燒風味豬肉香精感官評價得分如圖3所示。

圖3 不同酶解料液比對制備紅燒風味豬肉香精感官評價的影響Fig.3 The effect of different enzymatic hydrolysis material liquid ratio on the sensory evaluation of thermal reaction braised pork flavor

從圖3可看出，在料液比2∶1（g/mL）條件下，樣品感官評分最高且與其它組存在顯著差異。這一先增后減的趨勢與姜淼等在制備海參腸調味料產品時對酶解工藝中酶解料液比優(yōu)化的感官評價結果相符合[24]。料液比越大，體系水分不足導致底物的流動性差，酶不能與底物充分結合；而料液比越小，底物濃度越少導致酶解產物減少。合適的料液比既可以使蛋白酶分散均勻，又能使其與底物充分接觸，酶解充分[25]。因此，選取料液比2∶1（g/mL）為最佳酶解料液比，并進行下一步正交優(yōu)化試驗。

2.1.4 豬肉酶解工藝正交優(yōu)化試驗結果

豬肉酶解工藝正交優(yōu)化試驗結果及分析如表3、表4、表5所示。

表3 紅燒風味豬肉香精酶解工藝正交試驗結果Table 3 The results and analysis of orthogonal experiment of the thermal reaction braised pork flavoring

由表3可知，對3個因素的極差對比后發(fā)現R酶解時間＞R酶解料液比＞R酶解溫度，即各因素對紅燒風味豬肉香精的風味影響大小順序為：酶解時間＞酶解料液比＞酶解溫度。根據k值選出最優(yōu)組合為：A1B1C1，即最佳方案為酶解溫度55℃，酶解時間2.0 h，料液比3∶1（g/mL）。根據表4、表5發(fā)現，A1B1C1與除A2B1C2以外的組均存在顯著性差異。在綜合9組試驗的感官評價得分，選定得分最高組A1B1C1為最佳酶解工藝。故確定制備紅燒風味豬肉香精的最佳酶解工藝為：酶解溫度55℃，酶解時間 2.0 h，酶解料液比 3 ∶1（g/mL）。

表4 紅燒風味豬肉香精酶解工藝正交試驗方差分析多重比較結果Table 4 Multi-comparison results of analysis of variance by orthogonal experiment of the thermal reaction braised pork flavor

表5 紅燒風味豬肉香精酶解工藝正交試驗方差分析結果Table 5 The variance analysis of orthogonal experiment of the thermal reaction braised pork flavor

2.2 酶解工藝優(yōu)化對紅燒風味豬肉香精滋味的影響

2.2.1 酶解溫度對紅燒風味豬肉香精滋味的影響

2.2.1.1 香精滋味輪廓分析結果

不同酶解溫度的酶解液制備紅燒風味豬肉香精的電子舌主成分分析如圖4所示。

圖4 不同溫度下紅燒風味豬肉香精電子舌PCA分析Fig.4 Principal component analysis of thermal reaction braised pork flavor under different enzymatic hydrolysis temperature factors

經PCA分析后得到的區(qū)別指數（discrimination index，DI）是判斷電子舌是否能區(qū)分樣品的重要指標，一般當DI值大于80時，認為對樣品具有良好的區(qū)分度。各樣品第一主成分和第二主成分的累積方差貢獻率為99.59%，表明2個主成分包含樣品大部分信息，可以反映不同酶解溫度處理的5個樣品的滋味整體信息。不同酶解溫度下DI值為95，說明不同的紅燒香精樣品在滋味上有明顯差異，可以利用電子舌進行有效區(qū)分。

從圖4上看，數據點較為集中的為65℃和60℃的樣品，前兩者與45、50℃和55℃的樣品間距較遠，說明酶解溫度為65℃和60℃制備的紅燒香精滋味相似，二者與酶解溫度為45、50℃和55℃制備的紅燒香精滋味上存在明顯差異。綜上可知，酶解溫度對紅燒風味香精滋味上的影響較大。

2.2.1.2 酶解液中游離氨基酸含量分析結果

對不同酶解溫度處理得到的酶解液游離氨基酸進行測定，其結果如表6所示。

表6 不同酶解溫度下酶解液中游離氨基酸含量Table 6 Free amino acid content in enzymolysis solution at different enzymolysis temperature

從表6看出，55℃和60℃時游離氨基酸總含量較多，55℃時總含量最大為205.64 mg/100 g。整體呈現隨溫度升高先升后降趨勢，亮氨酸在所有組中均含量最多，其次為天門冬氨酸。其中55℃時亮氨酸含量最高，為50.49 mg/100 g，天門冬氨酸為20.20 mg/100 g和精氨酸為17.80 mg/100 g。而許勁在研究扇貝裙邊酶解過程中呈味組分的變化規(guī)律時發(fā)現，隨著酶解溫度升高，氨基酸的轉化率先增加后減少，也驗證了這一變化規(guī)律[26]。前人研究顯示，氨基酸的含量會因為溫度對蛋白酶的影響而變化[27]，因此選用55℃為最適酶解溫度。

2.2.2 酶解時間對紅燒風味豬肉香精滋味的影響

2.2.2.1 香精滋味輪廓分析結果

不同酶解時間的酶解液制備紅燒風味香精的電子舌主成分分析如圖5所示。

各樣品第一主成分和第二主成分的累積方差貢獻率為96.94%，表明2個主成分包含樣品大部分信息，可以反映5個不同酶解時間制備的紅燒風味香精整體信息。經電子舌PCA分析后的DI值為93，說明不同酶解時間下的紅燒香精滋味上具有顯著差異，利用電子舌能有效區(qū)分不同酶解時間制備的紅燒風味香精。劉樹萍[28]對不同熬制時間的排骨湯進行電子舌測定后也發(fā)現，4種不同熬煮時間的數據點均能較好分開，說明樣品間滋味差異明顯。從圖5上看，不同酶解時間的紅燒香精之間滋味均存在差異。數據點較接近的1.0 h和2.0 h處理樣品，表明二者在滋味上較為相似。綜上所述，可知酶解時間對紅燒香精滋味上的影響較大。

2.2.2.2 酶解液中游離氨基酸含量分析結果

對不同酶解時間制備的紅燒風味豬肉香精所對應酶解液中游離氨基酸測定結果如表7所示。

圖5 不同時間下紅燒風味豬肉香精電子舌PCA分析Fig.5 Principal component analysis of thermal reaction braised pork flavor under different enzymatic hydrolysis time

表7 不同酶解時間下酶解液中游離氨基酸含量Table 7 Free amino acid content in enzymolysis solution at different enzymolysis time

從表7中可看出，游離氨基酸總含量在3.0 h時達到最大值，且和其他組差異顯著，3.0 h后游離氨基酸含量開始下降，可能是由于酶解底物減少，酶解產物增多起到抑制作用有關[29]。其次鮮味氨基酸天門冬氨酸隨酶解時間的增加呈現先增加后減少，在3.0 h最高為49.40 mg/100 g。李心芯[30]在研究乳蛋白呈味肽的酶解工藝對于酶解時間的優(yōu)化結果中發(fā)現，鮮味物質也呈現先增后減的趨勢，與不同酶解時間酶解液中的鮮味氨基酸變化趨勢一致。在5組樣品中，苦味氨基酸亮氨酸含量均最高，其次是天門冬氨酸和精氨酸。結合圖2酶解時間為3.0 h的樣品具有最高紅燒香精感官評價得分，可能與其酶解液中總游離氨基酸（360.20 mg/100 g）、鮮味氨基酸（62.22 mg/100 g）、甜味氨基酸（47.09 mg/100 g）均為最高有關。

2.2.3 酶解料液比對紅燒風味豬肉香精滋味的影響

2.2.3.1 香精滋味輪廓分析結果

不同酶解料液比的酶解液制備紅燒風味香精的電子舌主成分分析如圖6所示。

圖6 不同酶解料液比下紅燒風味豬肉香精電子舌PCA分析Fig.6 Principal component analysis of thermal reaction braised pork flavor under different material liquid ratio of enzymatic hydrolysis

各樣品第一主成分和第二主成分的累積方差貢獻率為82.19%，表明2個主成分包含樣品大部分信息，可以反映5組不同料液比制備的紅燒香精整體信息。經電子舌PCA分析后的DI值為87，表明不同酶解料液比制備的紅燒香精滋味差異明顯，可以利用電子舌對其進行有效區(qū)分。從圖6上看，不同酶解料液比的紅燒風味香精之間滋味均存在差異。因此，可知酶解料液比對紅燒風味香精的滋味具有較大影響。

2.2.3.2 分析酶解液中游離氨基酸結果

對不同酶解料液比制備的紅燒風味豬肉香精所對應酶解液中游離氨基酸的測定結果如表8所示。

表8 不同酶解料液比下酶解液中游離氨基酸含量Table 8 Free amino acid content in enzymolysis solution at different hydrolysis solid-liquid ratio

從表8可看出，隨著酶解體系中水量的增加，酶解液中的大多數游離氨基酸含量總體呈現先增后降趨勢。這與鐘機在研究料液比對藍圓鲹魚肉蛋白酶解液的影響中的發(fā)現，當其它因素不變時，料液比升高水解度增大，達到最高點后料液比升高水解度下降的現象一致[31]。料液比為3∶1（g/mL）時酶解液中總游離氨基酸最高，為772.93 mg/100 g，其中含量最多的3個為：苦味氨基酸亮氨酸187.70 mg/100 g，精氨酸73.61 mg/100 g，鮮味氨基酸天門冬氨酸含71.32 mg/100 g，與其它組樣品之間存在顯著性差異。另外在5組不同底物濃度的酶解液中，苦味氨基酸含量均最高，占總游離氨基酸含量的69.04%～74.39%。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗對酶解溫度、酶解時間、酶解料液比3個因素進行考察，以感官評價得分為指標，確定熱反應紅燒風味豬肉香精制備的最優(yōu)酶解工藝為：加酶量0.3%，木瓜蛋白酶∶風味蛋白酶∶菠蘿蛋白酶=2∶3∶1（質量比），酶解料液比 3∶1（g/mL），酶解溫度55℃，酶解時間2.0 h。對正交試驗結果的極差分析得，影響紅燒風味豬肉香精的主次順序為：酶解時間＞酶解料液比＞酶解溫度。對各酶解液中游離氨基酸的定量結果進行分析，發(fā)現鮮味氨基酸含量較高，其中天門冬氨酸含量最高，隨著溫度、時間、料液比的變化，酶解液中的游離氨基酸含量均存在一定的變化趨勢，除料液比之外，隨酶解溫度和酶解時間的增加，酶解液的游離氨基酸含量均存在先升高后降低的趨勢，此外亮氨酸、天門冬氨酸以及精氨酸含量占比最大。通過對制備的紅燒豬肉風味香精電子舌的PCA分析圖可知，電子舌可實現對不同酶解工藝制備出的紅燒豬肉風味香精樣品的有效區(qū)分，對于指導和改善紅燒風味豬肉香精及紅燒類產品工業(yè)化生產提供理論依據。