網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究三七治療關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

韓 倩，陳 勇，王竟靜，魏江存，黃周艷，陳良妮

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心∕藥學(xué)院，南寧 530200；2.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530201）

中藥三七為五加科植物三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］的干燥根和根莖，具有散瘀止血，消腫定痛的功效，主要用于治療出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等病癥［1］，三七含有黃酮類、揮發(fā)油、多糖、皂苷類化合物。三七的黃酮類成分大部分以黃酮類醇的形式存在，從三七中分離到槲皮素、槲皮素苷、山柰酚、山奈酸以及山柰酚-3-O-β-D-半乳糖（2→1）葡萄糖苷等化合物。三七的黃酮類成分在莖葉、花蕾中含量稍微比根莖中高，為節(jié)約藥物資源，三七黃酮僅作為輔助開發(fā)。在主根中的揮發(fā)油類化合物有γ-依蘭油烯和莎草烯，而花中的揮發(fā)油含量最高，如β-欖香烯，可能對(duì)癌細(xì)胞也有抑制作用。三七多糖可干預(yù)炎癥反應(yīng)，對(duì)白細(xì)胞活化因子有下調(diào)作用，其發(fā)酵液能夠抗衰老［2-9］。研究表明，三七及其提取物成分能夠抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、活血止血等。三七的主要成分對(duì)于治療關(guān)節(jié)炎有顯著作用，三七治療血瘀型和風(fēng)濕熱癥或兼血瘀型的關(guān)節(jié)炎效果明顯，且可改善臨床癥狀［10，11］。

通過運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究三七主要成分治療關(guān)節(jié)炎的相關(guān)靶點(diǎn)和通路具有重要的意義，以此闡述三七治療關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在大數(shù)據(jù)時(shí)代的背景下產(chǎn)生的一種新興技術(shù)，最早由英國學(xué)者提出，以系統(tǒng)生物學(xué)、多項(xiàng)藥理學(xué)和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，運(yùn)用多種數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)計(jì)算平臺(tái)對(duì)藥物、成分、靶標(biāo)、通路、疾病等數(shù)據(jù)加以整合分析，最后呈現(xiàn)出可視化的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型，從而能夠闡明以整體性為特點(diǎn)的中藥或中成藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制［12-14］。鑒于此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”的多維網(wǎng)絡(luò)，探究三七治療關(guān)節(jié)炎的分子作用機(jī)制，為下一步從基因?qū)用骊U明生物學(xué)內(nèi)涵提供一定的理論依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)來源

1.1 三七主要活性成分收集及篩選

口服生物利用度（OB）是描述藥物口服后經(jīng)肝臟而到達(dá)體循環(huán)血液中藥量占口服劑量的百分比，這也是衡量藥物發(fā)揮療效的指標(biāo)，OB＞30%則可認(rèn)為該藥物具有較好的利用度［15，16］；藥物相似性（DL）則代表了中藥中的某種成分與西藥的相似程度，該成分在機(jī)體內(nèi)是否產(chǎn)生與相似西藥的活性，當(dāng)DL＞0.18 則認(rèn)為藥物相似性較高，溶解度較好［17，18］。

三七主要化學(xué)成分是運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：∕lsp.nwu.edu.cn∕，Version 2.3）進(jìn)行收集，再以口服生物利用度（OB）＞30%和藥物相似性（DL）＞0.18 為條件，最后篩得 8 個(gè)活性成分。

1.2 三七活性成分作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步預(yù)測(cè)活性成分相應(yīng)的靶點(diǎn)，其中一些成分沒有查詢到相應(yīng)靶點(diǎn)，用DrugBank 數(shù)據(jù)庫收集并補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)信息，刪除沒有靶點(diǎn)的化學(xué)成分 1 個(gè)，使用 UniProt 數(shù)據(jù)庫（http：∕∕www.uniprot.org∕）將7 個(gè)主要活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（以人類作為物種限定標(biāo)準(zhǔn)）。

1.3 三七治療關(guān)節(jié)炎潛在相關(guān)基因的篩選

GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫可以提供現(xiàn)有的基因 信 息 ，在 GeneCards（http：∕www. genecards.org∕，Version 4.5.0）、OMIM（http：∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕omim）數(shù)據(jù)庫中分別以“arthritis”進(jìn)行檢索，合并檢索結(jié)果得到關(guān)節(jié)炎基因。取三七活性成分預(yù)測(cè)的相關(guān)靶點(diǎn)和關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的Veen 圖交集部分則是三七主要活性成分治療關(guān)節(jié)炎的作用靶點(diǎn)。

1.4 三七-有效活性成分-靶基因-關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

把7 個(gè)三七主要有效活性成分（已排除重復(fù)和假陽性）與關(guān)節(jié)炎作用靶點(diǎn)，先建立關(guān)系列表，后導(dǎo)入Cytoscape Version 3.6.0 軟件繪制三七有效活性成分-治療關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，并分析計(jì)算各作用靶標(biāo)間的連接度（Degree），該值代表某個(gè)靶標(biāo)與其他靶標(biāo)間的相互作用，數(shù)值越高，代表該靶標(biāo)可能在三七治療關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮的作用越大。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）繪制與分析

將三七治療關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)全部導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https：∕string-db.org∕，Version 10.5）后，得到蛋白互作關(guān)系圖，使用R 語言對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作連接度進(jìn)行計(jì)算，最后得到核心基因。

1.6 生物過程和重要信號(hào)通路的分析

為探究三七治療關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)在功能基因中的作用和信號(hào)調(diào)控通路，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫得到三七治療關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)ID，以R 語言的Cluster Profiler 和pathway 包為工具得到基因本體（GO）和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析結(jié)果。選擇P＜0.05 的GO 功能富集和KEGG 通路，在從多到少的基因數(shù)中選取前20 個(gè)，結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七活性成分篩選

在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中以O(shè)B＞30% 和DL＞0.18 作為篩選條件得到8 種化學(xué)成分（表1），表中還列出了細(xì)胞滲透性（Caco-2）和分子質(zhì)量（MW），藥物穿過腸上皮屏障與 Caco-2 有關(guān)聯(lián)［16］，而 MW 在 180～500 kD，則可認(rèn)為藥物有良好的給藥性［19］。

在8 種活性成分中，根據(jù)stigmasterol（豆甾醇）、ginsenoside rh2（人參皂苷rh2）、β-sitosterol（β-谷甾醇）、quercetin（槲皮素）的4 個(gè)指標(biāo)值綜合情況推測(cè)，這4 種成分的藥物特性較好，可能是三七發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵成分。

表1 三七中活性成分信息

2.2 三七活性成分-治療關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

三七的7 個(gè)活性成分中通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫、DrugBank 數(shù)據(jù)庫得到相應(yīng)靶點(diǎn)共163 個(gè)；利用Gene-Cards、OMIN 數(shù)據(jù)庫檢索得到5 536 個(gè)關(guān)節(jié)炎作用靶點(diǎn)，得到三七活性成分和關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)Veen 圖，最后得到三七藥物活性成分-關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)131 個(gè)（圖1、表2）。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)維恩圖

2.3 三七-有效活性成分-靶基因-關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將三七的7 個(gè)有效活性成分與其治療關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)連接，運(yùn)用Cytoscape Version 3.6.0 軟件繪制三七-有效活性成分-靶基因-關(guān)節(jié)炎的中藥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖（圖2）。能夠在三七治療關(guān)節(jié)炎中起比較關(guān)鍵的調(diào)控作用可能就是靶點(diǎn)連接較多的活性成分：quercetin（槲皮素）、β-sitosterol（β-谷甾醇）、stigmasterol（豆甾醇）等。圖2 左邊中心點(diǎn)表示中藥三七，外圍7 個(gè)是三七活性成分；右邊中心表示關(guān)節(jié)炎，外圍表示三七治療關(guān)節(jié)炎潛在的131 個(gè)靶點(diǎn)；靶點(diǎn)與成分依靠邊線連接；圖中總共包含140 個(gè)節(jié)點(diǎn)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將三七治療關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)全部導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫后（默認(rèn)限定物種為人），得到蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖3），圖中靶標(biāo)表示蛋白，邊線表示靶標(biāo)間的相互關(guān)聯(lián)；最后使用R 語言對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作連接度進(jìn)行計(jì)算，最后得到蛋白激酶（AKT1）、JUN 蛋白（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、RELA、白介素-6（IL-6）、CXCL-8、表皮生長因子受體（EGFR）等前30 個(gè)基因蛋白柱狀圖（圖4）。從圖4 可以看出，前7 個(gè)連接度較高的靶標(biāo)可以影響多個(gè)靶標(biāo)，由此可以說明，三七治療關(guān)節(jié)炎是通過多個(gè)靶標(biāo)相互作用產(chǎn)生復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制的過程。

2.5 生物過程和重要信號(hào)通路的分析

為探究三七治療關(guān)節(jié)炎潛在的靶點(diǎn)在生物過程中和信號(hào)調(diào)控通路，以R 語言的Cluster Profiler 和pathway 包為工具進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，GO 分析得出生物過程氣泡圖（圖5），氣泡越大，基因占比大，則說明這個(gè)生物過程對(duì)治療關(guān)節(jié)炎具有重要意義；KEGG 分析得出信號(hào)通路富集結(jié)果（圖6），基因數(shù)目越多，提示該信號(hào)通路在該病中是重要的通路；選擇閾值P＜0.05，共富集到134 條生物過程，152條重要信號(hào)通路，再結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行分析。

2.5.1 GO 富集分析 將三七治療關(guān)節(jié)炎潛在的131 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)主要涉及到：蛋白質(zhì)異二聚活性（protein heterodimerization activity）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA 聚合酶 II 特異性（DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合（proximal promoter sequence-specific DNA binding）、RNA 聚合酶Ⅱ近端啟動(dòng)子序列特異性DNA 結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ proximal promoter sequencespecific DNA binding）等134 條生物過程（圖5）。

2.5.2 KEGG 通路分析 通過對(duì)預(yù)測(cè)三七治療關(guān)節(jié)炎的131 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 分析，在對(duì)其進(jìn)行顯著性通路富集后，得到152 條信號(hào)通路，取前20 條通路的柱狀圖（圖6）。最后發(fā)現(xiàn)，三七治療關(guān)節(jié)炎的機(jī)制包括：糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號(hào)通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complication）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人巨細(xì)胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、丙型

肝炎（Hepatitis C）、甲型流感（Influenza A）等通路。在眾多通路中，相關(guān)度居高的5 條，可能就是在所有通路中具有重要調(diào)控作用的信號(hào)通路，列舉腫瘤壞死因子信號(hào)通路（圖7），紅色表示三七靶基因在TNF 信號(hào)通路上的作用部位。AKT、IL-6、IL-8、EGF、VEGF、NF-kB 這些靶基因在多條通路中均有參與并發(fā)揮作用，說明三七治療關(guān)節(jié)炎是多靶點(diǎn)-多通路共同調(diào)控，從而治療關(guān)節(jié)炎。

表2 三七潛在治療關(guān)節(jié)炎作用靶點(diǎn)

圖2 三七有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 三七治療關(guān)節(jié)炎潛在作用靶點(diǎn)之間的互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 三七治療關(guān)節(jié)炎作用核心靶點(diǎn)

圖5 潛在靶點(diǎn)生物學(xué)的GO 分析氣泡圖

圖6 KEGG 通路富集分析結(jié)果

3 討論

圖7 腫瘤壞死因子信號(hào)通路

三七又名田七、三漆、滇三七等，在中國有600多年的藥用歷史，400 年的栽培歷史［20］，是中國名貴中藥之一，也是常見中成藥丹七片、復(fù)方丹參滴丸等的組分之一，因其有活血止血、散瘀止痛等功效被歷代醫(yī)家所推崇，至今三七用于治療心腦血管疾病、跌打損傷及出血等病癥。關(guān)節(jié)炎泛指發(fā)生在關(guān)節(jié)及其周圍組織，由炎癥、感染或其他因素引起的炎性疾病，主要表現(xiàn)為腫脹、畸變等；關(guān)節(jié)炎又分為骨關(guān)節(jié)炎（OA）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、化膿性關(guān)節(jié)炎等。有藥理研究表明，三七可能通過增加轉(zhuǎn)錄因子GAF 和熱休克蛋白70 的表達(dá)，可以明顯改善萎縮性胃炎大鼠胃黏膜狀態(tài)［21］；三七總皂苷可以調(diào)節(jié)大鼠關(guān)節(jié)炎的IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達(dá)，從而抑制組織腫脹［22，23］；三七抑制 NF-kB 的表達(dá)改善大鼠關(guān)節(jié)滑膜炎癥或抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子而起到治療效果［24，25］。研究表明，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療中，三七對(duì) CCP∕AST 增殖及 IFN-γ 分泌的抑制可能發(fā)揮重要作用［26］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過在模型網(wǎng)絡(luò)中，建立起成分-靶點(diǎn)-通路的多維互作網(wǎng)絡(luò)，探究藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)，為后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法檢索得到三七主要活性成分8 個(gè)，通過OB、DL、細(xì)胞滲透性和MW 4 個(gè)指標(biāo)綜合比較，發(fā)現(xiàn)豆甾醇、人參皂苷rh2、β-谷甾醇、槲皮素可能是發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵成分。相關(guān)研究表明，β-谷甾醇和豆甾醇可以改善DDS 引起的小鼠結(jié)腸炎［27］，β-谷甾醇還能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，抑制促炎因子（IL-6、IL-1β）的產(chǎn)生，減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥［28］。槲皮素治療可明顯減輕RA 的典型特征，如軟骨間關(guān)節(jié)損傷、炎性細(xì)胞浸潤；小鼠膝關(guān)節(jié)TNF-αmRNA 表達(dá)明顯降低［29］；槲皮素能降低天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、硫代巴比妥酸活性物質(zhì)和活性氧的水平，在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中起到抗氧化、基因保護(hù)和細(xì)胞保護(hù)作用［30］；通過抑制 NF-kB 激活，減弱炎癥環(huán)境中 MMP-13、細(xì)胞凋亡［31］；能夠降低 RA 破骨細(xì)胞的生成和分化，提示可治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［32］。由此可以說明，三七依靠多成分共同發(fā)揮作用來治療關(guān)節(jié)炎。而人參皂苷f2、人參皂苷rh2 對(duì)于抗皮膚炎癥、抗支氣管炎癥反應(yīng)也有一定的作用［33，34］，尚未見對(duì)于關(guān)節(jié)炎的報(bào)道，可以將人參皂苷作為未來研究治療關(guān)節(jié)炎的提示成分。與7 個(gè)活性成分相關(guān)的作用靶點(diǎn)163 個(gè)，篩選得到關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)5 536 個(gè)，獲得三七藥物活性成分-關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)131 個(gè)，從“三七-有效活性成分-靶基因-關(guān)節(jié)炎”的中藥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖中，能夠看出靶點(diǎn)連接較多的活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇，可能就是這些成分起主要調(diào)控作用。

以R 語言為工具，進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析，最后獲得了134 條生物過程和152 條重要信號(hào)通路；GO 富集分析涉及蛋白質(zhì)異二聚活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、近端啟動(dòng)子序列特異性DNA 結(jié)合、RNA 聚合酶II 近端啟動(dòng)子序列特異性DNA 結(jié)合等關(guān)鍵生物過程；KEGG 通路富集結(jié)果顯示，三七相關(guān)成分靶點(diǎn)主要涉及生物代謝途徑：糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、人巨細(xì)胞病毒感染、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等重要信號(hào)通路。腫瘤壞死因子（TNF）是一種非常關(guān)鍵的信號(hào)因子，它能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，參與細(xì)胞凋亡、分化等；在RA 患者的滑膜、軟骨中TNF 表達(dá)異常，并影響滑膜中的各種細(xì)胞，進(jìn)一步破壞關(guān)節(jié)［35-37］。TNF-α 是由激活的單核巨噬細(xì)胞分泌，能夠引起局部炎癥還通過激活MAPK 信號(hào)通路導(dǎo)致滑膜組織炎性增生、關(guān)節(jié)骨與軟骨的破壞；TNF 的受體之一TNFR1 可以激活其他基因，使MAPK 通路控制軟骨細(xì)胞凋亡［38］。這些通路都與炎癥密切相關(guān)，從生物過程和信號(hào)通路的分析可以說明，三七是通過多種成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，并且靶點(diǎn)又作用于不同的生物過程和信號(hào)通路，協(xié)同發(fā)揮藥效。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度，研究對(duì)三七治療關(guān)節(jié)炎的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)了三七的7 種成分作用于關(guān)節(jié)炎的131 個(gè)靶點(diǎn)，涉及到發(fā)揮藥效的多條生物過程和通路，也為后續(xù)研究三七治療關(guān)節(jié)炎的生物學(xué)過程和信號(hào)通路提供了一些參考。