煙草黑脛病生防菌LG-3 的分離鑒定及防效研究

張幸博 ，郭小紅 ，劉玉珍 ，李建華 ，王 京 ，孫曉偉 ，法鵬飛 ，危月輝

（1.河南省煙草公司許昌市公司，河南 許昌 461000；2 福建三炬生物科技股份有限公司，福建 廈門 361001；3.福建省生物肥料企業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361001）

煙草是中國(guó)的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，其總產(chǎn)量和總銷量居世界首位。但由于種植方式的改變，以及農(nóng)藥、化肥的不合理施用，煙草的病蟲危害也日益加重。煙草黑脛病是國(guó)內(nèi)危害最為嚴(yán)重的根莖病害之一，據(jù)調(diào)查表明，中國(guó)平均每年因煙草黑脛病造成的損失達(dá)上億元，僅次于煙草花葉病毒，嚴(yán)重影響了煙農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入［1］。

煙草黑脛病主要由煙草疫霉菌引起，在苗床期或移栽種植期均有可能發(fā)生，發(fā)病率一般在15%左右，嚴(yán)重可達(dá)75%，甚至造成絕收，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，給煙草產(chǎn)業(yè)造成較大的影響。煙草疫霉對(duì)煙草的侵染部位一般出現(xiàn)在莖部、根部和葉片，高溫、高濕條件下更易促使該病的發(fā)生［1，2］。

現(xiàn)階段，防治煙草黑脛病的方法有物理法、化學(xué)法和生物法，其中，化學(xué)防治方法效果最明顯，應(yīng)用較為廣泛，但在化學(xué)防治病害的同時(shí)，也造成了一系列土壤污染、作物農(nóng)藥殘留、病原菌產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題［3，4］。物理法耗時(shí)耗力，操作繁瑣，因此，采用有效、溫和的生物防治手段尤為重要。目前，生物防治的相關(guān)生防菌有芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、木霉菌屬、鏈霉菌屬等［5-9］。本研究從煙草黑脛病重病區(qū)河南省許昌市采集土壤樣本，篩選分離出1 株新型黑脛病菌拮抗菌，并開展盆栽防效試驗(yàn)，以期為煙草黑脛病生物防治方面的進(jìn)一步探究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試煙草為中煙100。煙草黑脛病致病菌有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）W1G-2、煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）YM 致病菌，篩選于許昌市煙草病株。供試土壤為許昌市煙草土壤。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g，加無(wú)菌水1 000 mL，pH 7.2～7.4；

2）PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂15～20 g，加無(wú)菌水1 000 mL，pH 7.0；

3）高氏1 號(hào)培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌）：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂 20 g，加無(wú)菌水 1 000 mL，pH 7.4～7.6。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離 稱取健康煙株根際土壤10 g，置于250 mL 錐形瓶中，隨后加入100 mL 無(wú)菌水，將錐形瓶置于220 r∕min 的振蕩器上振蕩5 min；配制成10-1～10-6稀釋度的根際土壤懸液；分別吸取100 μL 10-4～10-6不同稀釋度的土壤懸浮液，均勻涂布于培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度設(shè)置2～3 個(gè)平行，而后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d。待菌落長(zhǎng)出，挑取單一的菌落移入相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行純化，并進(jìn)行菌落形態(tài)描述，挑取單菌落，制作切片，鏡檢，拍照，最后將純化后的單一菌株轉(zhuǎn)接到PDA 試管斜面上，置于 4 ℃冰箱中保存［10］。

1.2.2 拮抗菌的篩選 采用平板對(duì)峙法進(jìn)行測(cè)定。將拮抗菌株活化后涂布接種在平板上培養(yǎng)24 h，在無(wú)菌條件下用已滅菌的直徑6 mm 打孔器制成菌碟，然后接種到PDA 固體培養(yǎng)基的四周；用已滅菌的直徑6 mm 打孔器將病原菌制成菌碟接種于PDA 培養(yǎng)基平板中間，以只接病原菌菌碟的處理為對(duì)照。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對(duì)照長(zhǎng)滿全平板時(shí)，觀查對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果，待抑菌圈不再變化時(shí)，記錄抑菌圈的大小并計(jì)算抑菌率，根據(jù)兩菌落發(fā)展速度、菌落之間有無(wú)抑菌圈、菌落邊緣的菌絲是否發(fā)生稀疏和萎縮的現(xiàn)象等來(lái)判斷分離的拮抗菌對(duì)病原菌有無(wú)拮抗作用，每處理3 次重復(fù)。

抑菌率=［（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）∕對(duì)照組菌落直徑］×100%

1.2.3 拮抗菌防效試驗(yàn) 試驗(yàn)于福建省漳州市南靖縣福建三炬生物股份有限公司玻璃實(shí)驗(yàn)室大棚內(nèi)進(jìn)行，選擇健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗，移栽到花盆中。對(duì)照（CK）取20 mL 105CFU∕mL 病原菌菌液施入花盆，24 h 后移栽煙苗，同時(shí)加入20 mL 無(wú)菌水于根部。移栽后7 d 再加1 次無(wú)菌水。處理取20 mL 105CFU∕mL 病原菌菌液施入花盆中，24 h 后移栽煙苗，同時(shí)加入20 mL 108CFU∕mL 拮抗菌菌液于根部，移栽后7 d 再加1 次拮抗菌菌液。將4 個(gè)拮抗菌株與2 株病原菌進(jìn)行拮抗比較，每處理10 株煙苗，設(shè)3 次重復(fù)。

移栽后15 d 觀察煙株的發(fā)病情況，煙草黑脛病致病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YC∕T 39—1996）。

相對(duì)防效=（FCK-F）t∕FCK×100%，其中，F(xiàn)CK表示空白組病情指數(shù)；Ft表示處理組病情指數(shù)。

1.2.4 拮抗菌的鑒定 將純化后的拮抗菌斜面送至國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部進(jìn)行菌種鑒定，并由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部送至指定單位進(jìn)行毒理檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草黑脛病拮抗菌分離、篩選

采用3 種培養(yǎng)基對(duì)煙草植株體及根際土壤菌株進(jìn)行分離，挑取分離平板上的單菌落進(jìn)行多次劃線純化，直至分離出單菌落，記錄單菌落的形態(tài)特征、編號(hào)、斜面，保存。最終從采集的煙草土壤樣品中共分離得到 35 株菌株，包括 29 株細(xì)菌、4 株真菌、2 株放線菌。結(jié)果表明，煙草根際土壤中分布有大量的微生物，以細(xì)菌最多，真菌次之，放線菌最少。

將篩選的菌株進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，取發(fā)酵液進(jìn)行病原菌拮抗試驗(yàn)，其中，有4 株菌株對(duì)供試病原菌均有明顯的抑制作用，將4 個(gè)拮抗菌株與2 株病原菌進(jìn)行拮抗比較，每處理10 株煙苗，設(shè)3 次重復(fù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 拮抗防效盆栽處理設(shè)計(jì)

LG-12、LG-3、LT-10、LJ-11 對(duì) 2 種黑脛病病原菌表現(xiàn)出較好的抑菌效果（表2、圖1A、圖1B），其中，對(duì)煙草黑脛病抑菌效果最好的為L(zhǎng)G-3，抑菌圈直徑分別達(dá)39、28 mm，與其他3 種分離菌株之間差異達(dá)極顯著水平。

表2 分離菌株對(duì)煙草黑脛病病原菌生長(zhǎng)的抑制

圖1 LG-3 對(duì)煙草黑脛病病原菌的抑菌效果

2.2 拮抗菌對(duì)煙草黑脛病的防效

以添加清水作為對(duì)照，通過(guò)在苗期人為添加病菌 W1G-2、YM 和拮抗菌，15 d 后觀察煙苗生長(zhǎng)情況。接種病菌W1G-2、YM 后，煙苗莖部發(fā)黑，無(wú)新葉生長(zhǎng)。由表3 可知，接種煙草節(jié)桿菌（Arthrobacter nicotianae）LG-3 對(duì)煙草黑脛病的防治效果最好，相對(duì)防效達(dá)85.59%，其他拮抗菌防效相對(duì)較低。

表3 煙草節(jié)桿菌對(duì)煙草黑脛病的防效情況

2.3 菌種鑒定及菌種安全性

將對(duì)煙草黑脛病抑菌效果較好的LG-3 菌株純化后送至農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生物肥料和食用菌菌種質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果表明，LG-3菌株的16S rDNA 序列和RecA基因序列與煙草節(jié)桿菌的序列同源性為99%。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，24 h菌落圓形，微隆起，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)，呈淡黃色（圖2A）。該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞幼齡桿狀，老齡斷裂呈小球狀，有明顯的桿、球周期變化（圖2B）。

煙草節(jié)桿菌在煙草上乃至農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用鮮見報(bào)道，為1 株新型煙草黑脛病拮抗菌株。為后續(xù)能在煙草病害防治或農(nóng)業(yè)生防方面加以應(yīng)用，本研究參考微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則（NY 1109—2006），將煙草節(jié)桿菌LG-3 送至匯智泰康生物技術(shù)（北京）有限公司進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，雌性、雄性小鼠經(jīng)口半致死量（LD50）均大于10 g∕kg BW，屬實(shí)際無(wú)毒。

圖2 煙草節(jié)桿菌LG-3 的菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果

3 小結(jié)與討論

煙草黑脛病現(xiàn)階段仍以化學(xué)防治為主，主要施用抗菌劑，但長(zhǎng)期施用化學(xué)制劑容易造成土壤污染、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，給人體健康和生態(tài)環(huán)境造成威脅。生物防治是符合健康、安全、環(huán)?？沙掷m(xù)發(fā)展的手段。微生物對(duì)植物病原菌生長(zhǎng)的抑制作用機(jī)制主要有代謝產(chǎn)物含抗菌物質(zhì)、寄生于病原菌、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間、或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性等［11-14］。目前，對(duì)于煙草黑脛病的生物防效已有許多報(bào)道。喻會(huì)平等［15］篩選的枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和惡臭假單胞菌單獨(dú)使用的防效和組合菌的防效分別達(dá)60%和70%以上；Han 等［16］篩選的枯草芽孢桿菌Tpb 55 在盆栽和大田試驗(yàn)的防效分別為70.66%和59.34%；彭閣等［17］從煙草病株中篩選出5 株對(duì)煙草黑脛病具有較好抑制效果的真菌，其中，里氏木霉、煙曲霉和黑曲霉的防效分別為59.50%、61.82%和85.00%；黃大躍［18］從土壤中篩選出1 株對(duì)煙草疫霉抑制作用最好的鏈霉菌F-7，抑菌率達(dá)75.00%，但在盆栽生防試驗(yàn)的效果不明顯，不能起到控制病情的作用；曹明慧等［19］從健康煙株的根際土壤中分離出1 株多粘類芽孢桿菌C-5，煙草苗期的防效達(dá)80%。

本研究首次從煙草根際土壤中篩選出1 株煙草節(jié)桿菌，對(duì)其進(jìn)行毒理試驗(yàn)和防效試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌在煙草苗期表現(xiàn)出較好的生防效果和促生長(zhǎng)作用，對(duì)黑脛病防效達(dá)85.59%；除此之外，有研究報(bào)道煙草節(jié)桿菌對(duì)五氯硝基苯殺菌劑具有降解作用［20］。說(shuō)明煙草節(jié)桿菌在煙草病害和農(nóng)藥殘留降解中都具有良好的研究和開發(fā)前景。經(jīng)口毒性試驗(yàn)為實(shí)際無(wú)毒，屬于安全、高效的生防菌株。但其防治機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。