地龍參麥口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

劉 棟，華之卉，郝 哲，屈 俊，王麗軍，李明春 （. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院藥劑科，河南 鄭州 45004；. 鄭州人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 45000；. 中國人民解放軍海軍第九七一醫(yī)院藥劑科，山東 青島6607）

地龍參麥口服液（曾用名：健心樂口服液）是由地龍、紅參、黃芪、麥冬、五味子等五味中藥材加工制成的復(fù)方非標(biāo)準(zhǔn)制劑，具有利尿、降壓、強(qiáng)心、補(bǔ)益氣血、養(yǎng)心安神之功效[1-2]，在臨床上用于各種病因引起的慢性心功能不全、心慌、胸悶、胸痛及各種心律失常，并有利水、抗凝、營養(yǎng)心肌之功效。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定年代久遠(yuǎn)，只有檢查項(xiàng)，不能全面控制制劑質(zhì)量。根據(jù)全軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高課題要求，增加了麥冬、黃芪和五味子的薄層色譜（TLC）鑒別方法。五味子醇甲是方中五味子的有效成分之一，能夠保護(hù)心肌結(jié)構(gòu)和功能，降低心肌耗氧量，延長供體心的保存時(shí)間[3]；羥苯乙酯為方中的化學(xué)防腐劑，具有廣譜抑菌作用，但過量使用會(huì)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)以及類激素作用[4]。為保證制劑的有效性和安全性，本研究采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定制劑中有效成分五味子醇甲和防腐劑羥苯乙酯的含量，為提高和完善地龍參麥口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10A 型高效液相色譜儀，包括SPD-10A 型紫外檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器、LC-solutionLite 色譜工作站（日本Shimadzu 公司）；BT125D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；ZF-2 型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（天津華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；硅膠G 薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

黃芪甲苷對(duì)照品（含量：95.8%，批號(hào)：110781-201314）、五味子醇甲對(duì)照品（含量：99.9%，批號(hào)：110857-201513）、羥苯乙酯對(duì)照品（批號(hào)：100847-201604，含量：99.9%）、黃芪對(duì)照藥材（批號(hào)：121462-201304）、麥冬對(duì)照藥材（批號(hào)：121013-201310）、五味子對(duì)照藥材（批號(hào)：120922-201309）均購自中國食品藥品檢定研究院；地龍參麥口服液（批號(hào)：170926、171208、180312）和陰性樣品為中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院自制；乙腈為色譜純；水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別[5-6]

2.1.1 黃芪[7]

取本品30 ml，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次20 ml，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液洗滌3 次，每次20 ml，再用水洗滌2 次，每次20 ml，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml 使溶解，作為供試品溶液。另取缺黃芪的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。取黃芪對(duì)照藥材2.0 g，加水飽和的正丁醇60 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液同法制成對(duì)照藥材溶液。再取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照TLC 法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述4 種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（25∶11∶3）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

2.1.2 麥冬

取本品20 ml，加30%鹽酸溶液3 ml，加熱煮沸5 min，放冷，用二氯甲烷振搖提取2 次，每次30 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml 使溶解，作為供試品溶液。另取缺麥冬的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。取麥冬對(duì)照藥材2 g，加水50 ml，煎煮30 min，濾過，濾液加30%鹽酸溶液6 ml，同法制成對(duì)照藥材溶液。按照TLC 法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-丙酮（12∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾，見圖2。

2.1.3 五味子[8]

取本品30 ml，用二氯甲烷振搖提取2 次，每次30 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)佣燃淄? ml 使溶解，作為供試品溶液。另取缺五味子的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。取五味子對(duì)照藥材1.0 g，加二氯甲烷30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)佣燃淄? ml 使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取五味子醇甲對(duì)照品，加二氯甲烷制成每1 ml 含1 mg 五味子醇甲的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照TLC 法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述4 種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（10∶7∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾，見圖3。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Wondasil C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流 動(dòng) 相：乙 腈(A)-水(B)，梯 度 洗 脫：0～10 min，35%A；10～20 min，35%A→47%A；20～30 min，47%A→55%A。流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2.2 溶液的制備

（1）混合對(duì)照品溶液：精密稱取羥苯乙酯、五味子醇甲對(duì)照品各適量，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml 含羥苯乙酯、五味子醇甲分別為505.89、116.12 μg 的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2 ml，置于10 ml 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得羥苯乙酯、五味子醇甲質(zhì)量濃度分別為101.18、23.22 μg/ml 的混合對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液：精密量取樣品2 ml，置于10 ml量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（3）陰性對(duì)照溶液：分別取缺羥苯乙酯、缺五味子的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖4。結(jié)果表明，在該色譜條件下，供試品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處出峰，陰性對(duì)照溶液對(duì)羥苯乙酯、五味子醇甲的測(cè)定無干擾。

圖4 地龍參麥口服液HPLC 圖

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，進(jìn)樣，記錄峰面積。以羥苯乙酯和五味子醇甲質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得羥苯乙酯回歸方程為Y=58 559.18X-90 593.32 (r=0.999 9)，五味 子 醇 甲 回 歸 方 程 為Y=27 155.08X-7 196.072(r=0.999 9)。結(jié)果表明，羥苯乙酯和五味子醇甲檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為25.29～252.94、5.81～58.06 μg/ml。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，羥苯乙酯和五味子醇甲峰面積的RSD 分別為0.62%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取已知含量的供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時(shí)按進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，羥苯乙酯和五味子醇甲峰面積的RSD 分別為1.03%、0.85%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，羥苯乙酯和五味子醇甲的含量平均值分別為0.468 8、0.115 6 mg/ml，RSD 分別為0.75%、0.85%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的樣品（批號(hào)：170328）1.0 ml，共9 份，分別置于10 ml 量瓶中，各加入低、中、高質(zhì)量的羥苯乙酯和五味子醇甲對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.3 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 TLC 鑒別

黃芪TLC 鑒別時(shí)，樣品的正丁醇提取液用1%氫氧化鈉溶液洗滌，既可以除去酸性、酚類非指標(biāo)成分，又能促進(jìn)其他黃芪皂苷轉(zhuǎn)化成黃芪甲苷，增加黃芪甲苷的量[9-11]，提高鑒別效果。

試驗(yàn)過程中，曾進(jìn)行過紅參和地龍的薄層鑒別研究。在對(duì)紅參的鑒別中，采用不同的展開系統(tǒng)陰性均出現(xiàn)干擾；而在地龍的研究中采用不同供試品處理方法、不同的展開系統(tǒng)均無法顯示出地龍的特征性斑點(diǎn)，故質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中舍棄了對(duì)紅參和地龍的薄層鑒別。

3.2 含量測(cè)定

本試驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-水3 種不同的流動(dòng)相體系，在滿足基線平穩(wěn)、指標(biāo)峰分離度良好、峰型對(duì)稱度好的基礎(chǔ)上，從經(jīng)濟(jì)環(huán)保的角度出發(fā)，選用乙腈-水體系。但羥苯乙酯和五味子醇甲極性有一定差別，故采用梯度洗脫法來達(dá)到快速檢測(cè)的目的。

由紫外吸收?qǐng)D譜可知，羥苯乙酯和五味子醇甲在254 nm 附近均有最大吸收，故選擇254 nm 作為檢測(cè)波長，操作更加簡(jiǎn)單、普適性更強(qiáng)[12]。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3, mg/ml)

試驗(yàn)中考察了水、甲醇、乙醇、稀乙醇和50%甲醇作為提取溶劑，結(jié)果顯示50%甲醇作溶劑時(shí)，指標(biāo)成分無干擾，提取率高。

本研究曾嘗試測(cè)定紅參中有效成分的含量，將樣品采用直接過濾法、蒸干后甲醇超聲法、正丁醇萃取法等均無法有效檢測(cè)出紅參中的有效成分，故最終放棄對(duì)紅參的含量測(cè)定。

3.3 羥苯乙酯含量測(cè)定的意義

《中國藥典》（2015 年版）四部通則0181【合劑】項(xiàng)下規(guī)定羥苯酯類防腐劑的用量不得超過0.05%，但所有抑菌劑都有一定的毒性，添加到制劑中的抑菌劑應(yīng)是在抑菌效力測(cè)試試驗(yàn)基礎(chǔ)上的最低有效量[13]。樣品處方中羥苯乙酯的用量為0.05%，但3 批樣品的測(cè)定結(jié)果顯示羥苯乙酯的含量差異較大，因而把羥苯乙酯含量也作為質(zhì)量控制項(xiàng)符合制劑的安全性要求。