紅景天苷單體與坤復(fù)康片大鼠口服藥動學(xué)特征的比較

劉昕竹，徐人杰,，馮 城，魏 昕 （. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥學(xué)部，上海 0009；. 紹興市婦幼保健院臨床藥學(xué)室，浙江 紹興 3000）

中藥及其制劑由于其特殊的功效，低毒性和較少的副作用而在世界范圍內(nèi)越來越流行[1]。坤復(fù)康片是著名的中藥配方，包括赤芍、苦參、香附、豬苓、女貞子、南劉寄奴、烏藥、粉萆解、扁蓄，臨床用于治療中國女性的骨盆炎癥[2-3]。紅景天苷（圖1）是坤復(fù)康片抗炎作用的重要生物活性化合物。研究證明，紅景天苷包含許多藥理作用，例如抗血栓[4]、抗成骨細(xì)胞凋亡[5]、保肝[6]和抗腫瘤[7]。

圖1 紅景天苷結(jié)構(gòu)式

中藥藥動學(xué)研究不僅可以解釋和預(yù)測有關(guān)功效和安全性的藥物事件，而且還有助于評估處方或者中草藥的合理性和相容性[8-10]。口服是應(yīng)用中藥的主要途徑，并通過口服發(fā)揮藥理作用。但是，口服坤復(fù)康片后，紅景天苷的藥動學(xué)特征尚未見報(bào)道。同時(shí)，坤復(fù)康片中其他成分對紅景天苷吸收的影響目前也未被揭曉。

我們旨在開發(fā)一種選擇性高、靈敏且快速的UPLC-MS/MS 方法，用于測定大鼠血漿中的紅景天苷。隨后，本方法成功地用于該活性成分在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。同時(shí)，通過比較大鼠口服給予紅景天苷單體和坤復(fù)康片后的藥動學(xué)行為，我們探究了坤復(fù)康片對紅景天苷藥動學(xué)特征的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑

紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。甲醇、乙腈均為色譜純；水為純化水；坤復(fù)康片為市售品（薄膜衣片，規(guī)格：0.4 g/片，批號：20190610）；空白大鼠血漿取自健康Wistar 大鼠，用前經(jīng)檢測對實(shí)驗(yàn)無干擾。

1.2 動物

Wistar 雄性大鼠（180～220 g，上海交通大學(xué)公共實(shí)驗(yàn)室）。

1.3 儀器

Applied Biosystem 5500 QTRAP? hybrid triple-quad LC/MS/MS（美國AB 科學(xué)技術(shù)公司）；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（美國安捷倫科技有限公司，50 mm×2.1 mm, 1.8 μm）。

2 方法

2.1 色譜條件

流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B）。梯度洗脫：0.0～2.4 min, 1.0%～23.4% A; 2.4～2.5 min, 23.4%～95.0% A; 2.5～3.5 min，95.0% A; 3.5～3.6 min,95.0%～1.0% A; 3.6～4.6 min, 1.0% A。用 前 經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾。在線脫氣；流速：0.4 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI 離子源：負(fù)離子模式；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子化溫度（TEM）：550 ℃；噴霧電壓：-4 500 V；霧化氣（GS1）：50 psi；輔助氣（GS2）：50 psi；氣簾氣（CUR）：50 psi。紅景天苷m/z 299.2 →59.0，內(nèi)標(biāo)葛根素m/z 415.1 → 267.1，碰撞能量（CE）:-29 V（紅景天苷），-40 V（葛根素）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取紅景天苷對照品適量，加水定容至10 ml 制成對照品溶液，濃度為100 μg/ml，4 ℃冷藏備用。

2.4 血漿樣本處理

取血漿樣品50 μl，加入70 ng/ml 葛根素內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，渦旋混勻，加入400 μl 甲醇，渦旋提取1 min。12 000 r/min 離心10 min，吸取2 μl 上清液進(jìn)樣LC-MS/MS 分析。

2.5 方法學(xué)考察

根據(jù)FDA 發(fā)布的生物分析方法標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定紅景天苷3 個(gè)質(zhì)控濃度（5、50、200 ng/ml），通過將標(biāo)準(zhǔn)溶液用空白血漿稀釋的方式配制質(zhì)控樣本，對方法的專屬性、精密度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、提取回收率、線性關(guān)系進(jìn)行了考察（FDA，2001 年）。驗(yàn)證試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行3 d。每次驗(yàn)證均重復(fù)6 份質(zhì)控樣品。

2.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

12 只雄性Wistar 大鼠，隨機(jī)分為2 組，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后，于實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食，自行飲水。紅景天苷單體和坤復(fù)康片事先用0.5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液，2 組大鼠分別灌胃給予紅景天苷單體和坤復(fù)康片混懸液，劑量分別為0.95 和120 mg/kg。其中，坤復(fù)康片劑量為單次口服臨床等效量。大鼠于給藥前和給藥后0、0.17、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48 h 眼眶取全血150 μl，立即置于含肝素的試管中，搖勻，12 000 r/min 離心10 min，分離血漿50 μl，-20 ℃保存，備測。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性

在本研究中，我們嘗試了各種流動相條件以獲得分析物的最佳響應(yīng)、合適的保留時(shí)間和良好的峰形。主要測試了甲醇、乙腈、0.1%甲酸和100%水作為潛在的流動相。結(jié)果表明，0.1%甲酸和甲醇作為流動相可以產(chǎn)生更高的響應(yīng)和更好的峰形。因此，選擇了甲醇-0.1%甲酸水。對于MS 條件，測試了正掃描和負(fù)掃描模式。由于處于負(fù)離子模式的紅景天苷顯示出更明顯的碎片特征和更高的靈敏度，因此選擇了該模式?？瞻籽獫{、紅景天苷和內(nèi)標(biāo)血漿的典型色譜見圖2。其中，紅景天苷和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為1.52 和1.98 min。在空白血漿中，沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)干擾紅景天苷的分析。

3.1.2 提取回收率試驗(yàn)

于空白大鼠血漿中加入對照品溶液配制成（5、50、200 ng/ml）3 種濃度的對照品血漿溶液，每個(gè)濃度平行為6 份，按“血漿預(yù)處理方法”項(xiàng)處理，進(jìn)樣，測定峰面積A1。另取6 份空白大鼠血漿，按“血漿預(yù)處理方法”項(xiàng)處理后，加入按對照品溶液配制成（5、50、200 ng/ml）3 種濃度的對照品血漿溶液，每個(gè)濃度平行為6 份，進(jìn)樣，測定峰面積A2。計(jì)算A1/A2為提取回收率，分別為（87.2±6.2）%、（85.1±4.4）%、（90.4±7.1）%。內(nèi)標(biāo)葛根素的提取回收率為（91.2±5.9）%。結(jié)果表明紅景天苷的提取回收率較高，且穩(wěn)定。

圖2 紅景天苷在血漿中的LC/MS/MS 圖

3.1.3 精密度與準(zhǔn)確性試驗(yàn)

制備高、中、低濃度的質(zhì)控樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法提取后進(jìn)樣分析。在3 d 內(nèi)測定日內(nèi)精密度，通過準(zhǔn)備各濃度下6 份重復(fù)樣本來評估日間精密度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出質(zhì)控樣品濃度，并對質(zhì)控樣品結(jié)果進(jìn)行方差分析以獲得精確度和準(zhǔn)確性。結(jié)果見表1。幾組樣本的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對誤差均在合理范圍內(nèi)，表明紅景天苷的精密度和準(zhǔn)確性良好。

3.1.4 線性關(guān)系考察

取空白大鼠血漿適量，配成含紅景天苷4、5、10、20、50、100、200、500 ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)空白血漿系列溶液。按“2.4”項(xiàng)下提取，每個(gè)濃度平行測定6 份樣本。以待測物紅景天苷濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)葛根素峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，權(quán)重系數(shù)為1/C2，計(jì)算直線回歸方程。紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.039 5X-0.013 1。其中，X 為紅景天苷的濃度（ng/ml），Y 為紅景天苷和內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜峰面積的比值。線性范圍為4～500 ng/ml，紅景天苷定量限為4 ng/ml。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取低、中、高3 個(gè)濃度的質(zhì)控樣本各6 份，測定反復(fù)凍融3 次、-20 ℃存放2 周、室溫（20 ℃）下存放4 h、自動進(jìn)樣器（4 ℃）保存24 h 后藥物的濃度，考察凍融和存放時(shí)間對紅景天苷穩(wěn)定性的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明：紅景天苷在上述條件下穩(wěn)定，不影響測定結(jié)果。結(jié)果見表2。

表2 紅景天苷在大鼠血漿中的穩(wěn)定性(n=6)

3.2 藥動學(xué)試驗(yàn)

該方法用于大鼠口服紅景天苷單體和坤復(fù)康片的藥動學(xué)研究。圖3 和表3 給出了通過DAS 2.0 計(jì)算兩組大鼠的平均濃度-時(shí)間曲線及其藥動學(xué)參數(shù)的數(shù)據(jù)。濃度-時(shí)間曲線見圖3。與紅景天苷單體組相比，坤復(fù)康片組中cmax、AUC0-t和AUC0-∞的水平顯著增加。

4 討論

圖3 大鼠灌胃紅景天苷單體和坤復(fù)康混懸液后紅景天苷血藥濃度均值-時(shí)間曲線（n=6）

表3 紅景天苷大鼠體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)( ±s, n=6)

表3 紅景天苷大鼠體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)( ±s, n=6)

*P ＜0.05，** P ＜0.01，與紅景天苷單體組比較。

參數(shù) 紅景天苷單體組 坤復(fù)康片組t1/2 (t/h) 36.08±6.63 27.44±9.87 MRT (t/h) 16.11±0.82 15.97±0.61 CL[L/(kg·h)] 0.022±0.003 0.016±0.003 cmax (ng/ml) 85.81±15.66 143.86±46.91*AUC0-t (ng·h/ml) 587.11±35.02 956.35±47.65**AUC0-∞ (ng·h/ml) 917.61±121.43 1 296.47±249.32*tmax (t/h) 0.50±0.00 0.83±0.47

本實(shí)驗(yàn)建立了新的血漿中紅景天苷的LC/MS/MS 測定方法，方法簡單方便易行，分離效率好，專屬性強(qiáng)，血漿中雜質(zhì)或內(nèi)源性物質(zhì)對待測物均不產(chǎn)生干擾，保留時(shí)間短、靈敏、穩(wěn)定可靠，適用于針對紅景天苷大鼠血漿樣本的批量檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給大鼠分別予紅景天苷單體和坤復(fù)康片灌胃后，紅景天苷的一些藥動學(xué)特征，如t1/2、MRT 在兩組中未見差異，說明復(fù)方中其他成分可能對紅景天苷的體內(nèi)消除過程影響較小。另一方面，部分藥動學(xué)參數(shù)顯示出顯著差異，主要表現(xiàn)為兩組AUC0-t、AUC0-∞、cmax均有顯著差異，表明復(fù)方給藥增加了紅景天苷吸收入體內(nèi)的血藥濃度和體內(nèi)暴露量，提示該復(fù)方成分對紅景天苷有增加吸收的作用。該結(jié)果證明了方劑配伍可明顯影響彼此在體內(nèi)化學(xué)成分的藥動學(xué)參數(shù)，說明在中醫(yī)辨證理論指導(dǎo)下的復(fù)方配伍原則具有豐富的科學(xué)內(nèi)涵。

根據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道，除紅景天苷外，坤復(fù)康片主要還包括氧化苦參堿、苦參堿、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷及苯甲酰芍藥苷等若干種成分，復(fù)方中幾味藥材間存在復(fù)雜的相互作用，從而可能導(dǎo)致藥效發(fā)生改變，值得我們進(jìn)一步深入研究。