基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的青風(fēng)藤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究

姚茹冰，彭 浩，蔡孟成，李 霞 （海軍軍醫(yī)大學(xué)：. 中醫(yī)系, . 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200433）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)滑膜炎為主要臨床表現(xiàn)，具有異質(zhì)性、系統(tǒng)性，呈慢性、進(jìn)行性、侵襲性，如無恰當(dāng)治療，則病情逐漸加重而形成永久性骨質(zhì)破壞并最終出現(xiàn)殘疾，甚至累及臟器和神經(jīng)系統(tǒng)而危及生命。通過早診斷、早治療，阻止關(guān)節(jié)炎癥病變發(fā)展成不可逆的骨破壞至關(guān)重要。目前常用的治療RA 藥物如非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、改善病情的抗風(fēng)濕藥、免疫抑制劑及生物制劑等，可在較短的時(shí)間改善患者的臨床癥狀，但長(zhǎng)期使用存在不良反應(yīng)增多、費(fèi)用較高、單一靶向作用療效受限等問題，因此尋找有效、低毒、價(jià)廉及適合長(zhǎng)期服用的RA 藥物，成為研究熱點(diǎn)。

RA 屬于中醫(yī)學(xué)“歷節(jié)風(fēng)”、“頑痹”、“骨痹”、“鶴膝風(fēng)”等范疇。《素問·痹論》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，治療以祛風(fēng)散寒除濕，通絡(luò)止痛為主。青風(fēng)藤為防己科植物青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils.和毛青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd. et Wils. var. cinereum Rehd.et Wils.的干燥藤莖（《中國(guó)藥典》2020 年版)，其性味苦、辛、平，歸肝、脾經(jīng)，能有效祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛?！侗静輩R言》載“青風(fēng)藤，散風(fēng)寒濕痹之藥，能舒筋活血，正骨利髓。”《本草綱目》認(rèn)為有“治風(fēng)濕流注，歷節(jié)鶴膝”之功?，F(xiàn)代研究顯示以青風(fēng)藤為主要藥物的湯劑，可有效延緩疾病發(fā)展，改善患者臨床癥狀[1-2]；青風(fēng)藤的有效成分青藤堿也具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛和抑制自身抗體產(chǎn)生的作用，在治療RA 方面，具有較好的臨床療效和較低的副作用[3]。本文旨在通過對(duì)青風(fēng)藤進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以期探索其物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究青風(fēng)藤治療RA 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 青風(fēng)藤活性成分的篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP）是國(guó)內(nèi)相對(duì)完善的中藥成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄了中藥502 味，相關(guān)靶點(diǎn)3 339 個(gè)，同時(shí)對(duì)每個(gè)成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行了詳細(xì)的描述。通過TCMSP 獲取青風(fēng)藤的化學(xué)成分。再根據(jù)化合物口服生物利用度（OB）與類藥性指數(shù)（DL）篩選活性成分，其中OB 閾值設(shè)為OB≥30%，DL 閾值設(shè)為DL≥0.18[4-5]。下載活性成分的結(jié)構(gòu)，將活性成分的結(jié)構(gòu)保存為mol2 格式。

1.2 青風(fēng)藤潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

DRAR-CPI（ https://cpi.bio-x.cn/drar/） 是 基 于DOCK 分子對(duì)接程序開發(fā)的反向分子對(duì)接服務(wù)器，可對(duì)接藥物分子和蛋白的三維結(jié)構(gòu)和特征，并通過蛋白-配體相互作用能的親和性以函數(shù)打分并排序。對(duì)接分?jǐn)?shù)（Z-score）代表藥物分子與蛋白的相互作用強(qiáng)度。服務(wù)器研發(fā)者認(rèn)為，Z-score ＜-1 的蛋白質(zhì)是良好的潛在靶點(diǎn)。通過DRAR-CPI 服務(wù)器篩選出青風(fēng)藤有效成分的蛋白靶點(diǎn)后，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)處理，得到標(biāo)準(zhǔn)名稱，獲取基因靶點(diǎn)。

1.3 RA 相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

通過對(duì)Geencards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，得到RA 的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 藥物-化合物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

為明確青風(fēng)藤與RA 潛在靶點(diǎn)間的相互作用，利用Venn 在線軟件將藥物與疾病靶點(diǎn)取交集，通過Venn 圖的形式展現(xiàn)藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)間存在的交集靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.5 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選得到的藥物-疾病共同靶點(diǎn)上傳至String 在線平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.6 功能富集分析與通路分析

利用clusterProfiler 程序包（3.6 版）對(duì)藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路分析，設(shè)定閾值P＜0.05，并按照涉及的靶點(diǎn)數(shù)目多少進(jìn)行排序，篩選GO 富集分析中分子功能、細(xì)胞組成和生物過程的前10 個(gè)條目以及KEGG 富集的前10 個(gè)信號(hào)通路，進(jìn)一步篩選與RA 相關(guān)的信號(hào)通路，探討青風(fēng)藤抗RA 的生物學(xué)過程及信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 青風(fēng)藤有效化學(xué)成分的篩選

從TCMSP 共獲得青風(fēng)藤16 個(gè)化學(xué)成分，以O(shè)B＞30%，DL＞0.18 為篩選條件，共篩選出有效活性成分6 個(gè)（表1）。

表1 青風(fēng)藤有效成分

2.2 青風(fēng)藤潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

登陸DRAR-CPI 服務(wù)器并上傳青風(fēng)藤有效活性成分結(jié)構(gòu)的mol2 格式文件，篩選Z-score ＜-1的蛋白靶點(diǎn)的PDB ID 導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取6 個(gè)有效活性成分的潛在基因靶點(diǎn)合計(jì)383 個(gè)。其中，存在多個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)同一基因靶點(diǎn)的情況，經(jīng)去重處理后，共獲得青風(fēng)藤潛在基因靶點(diǎn)176 個(gè)。

2.3 RA 靶點(diǎn)的篩選

通過Geencards 數(shù)據(jù)庫(kù)得到RA 相關(guān)靶點(diǎn)4329 個(gè)，通過篩選設(shè)置relevance score≥15，最終獲得305 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)得到與RA 相關(guān)靶點(diǎn)13 個(gè)，篩重后獲得疾病相關(guān)靶點(diǎn)305 個(gè)。

2.4 “中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

利用Venn 2.1 軟件將“青風(fēng)藤”活性成分對(duì)應(yīng)的176 個(gè)靶點(diǎn)與RA 對(duì)應(yīng)的305 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行交集，獲得15 個(gè)共有靶點(diǎn)（圖1）。將15 個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“青風(fēng)藤-化合物-靶點(diǎn)-RA”的網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行可視化分析（圖1）。該網(wǎng)絡(luò)包含了23 個(gè)節(jié)點(diǎn)，100 條邊，其中，三角形代表藥物；燕尾形代表疾??；菱形代表活性成分；橢圓形代表靶點(diǎn)；連接化合物與靶點(diǎn)的邊表示它們之間有作用關(guān)系。依據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)可知，靶點(diǎn)度值(degree)是拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的重要參數(shù)，其表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線的條數(shù)，度值高的節(jié)點(diǎn)很可能在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到橋梁作用，有較多節(jié)點(diǎn)的化合物或藥物靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中可能起到關(guān)鍵的作用。本研究篩選度值較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，排名前3 位的化合物分別為青藤堿（sinomenine）、拉茲馬寧堿（16-epi-isositsirikine）及烏心石環(huán)氧內(nèi)酯（michelenolide），其分別能與8、6 及6 個(gè)靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用。從靶點(diǎn)的角度看，排名前4 位的是IL-10、B2M、NR3C1 及S100A9，分別能與4、4、3 及3 個(gè)化合物發(fā)生相互作用，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)的特性。

圖1 “青風(fēng)藤-化合物-靶點(diǎn)-RA”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

將Venn 圖獲得的15 個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)上傳至String 在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)得到PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），同時(shí)得到網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)節(jié)點(diǎn)的度值。在此網(wǎng)絡(luò)中包含節(jié)點(diǎn)15 個(gè)，邊55 條，度值均值7.33。根據(jù)“度值＞均值”篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)7 個(gè)，包括：IL-10、IL-4、INS、MAPK8、ELANE、MAPK1、MAPK14。度值最高的是IL-10，為14；其次為IL-4，度值為13；INS度值為12。度值大的靶點(diǎn)提示在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，度值大的靶點(diǎn)很可能是青風(fēng)藤治療RA 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.6 青風(fēng)藤治療RA 潛在靶點(diǎn)的GO 生物功能注釋

圖2 靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

GO 是Gene Ontology 的簡(jiǎn)稱，主要包括生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）及分子功能（MF）3 個(gè)部分。本研究GO 功能富集分析顯示500 個(gè)生物過程（BP）、18 個(gè)細(xì)胞組成（CC）、28 個(gè)分子功能（MF），分別對(duì)BP、CC 及MF 前10 個(gè)條目進(jìn)行可視化分析，得到圖3，其中縱坐標(biāo)表示富集條目，橫坐標(biāo)表示富集個(gè)數(shù)。圖4 顯示共同作用靶點(diǎn)在BP 中，主要富集條目為對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)，調(diào)節(jié)DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、積極調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，以及對(duì)中性粒細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等；共同作用靶點(diǎn)在CC 中主要富集條目為分泌顆粒內(nèi)腔、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、內(nèi)體腔、液泡腔等；共同作用靶點(diǎn)在MF 中主要富集條目為MAP 激酶活性、Toll樣受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性等。

2.7 青風(fēng)藤治療RA 潛在靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析

KEGG 通路富集分析顯示77 條通路，對(duì)前10 條通路進(jìn)行可視化分析，得到圖4，其中縱坐標(biāo)表示富集通路的名稱，橫坐標(biāo)表示富集基因個(gè)數(shù)。前10 條通路顯示，靶點(diǎn)主要富集于FcεRI 信號(hào)通路、百日咳、利什曼病、結(jié)核、IL-17 信號(hào)通路、恰加斯?。绹?guó)錐蟲病）、C 型凝集素受體信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、弓形蟲病、FoxO 信號(hào)通路等，多為感染、炎癥和免疫相關(guān)通路。其中涉及到的靶點(diǎn)基因，出現(xiàn)頻次較高的是MAPK1、MAPK14、MAPK8、IL-10 及IL-4。

圖3 靶點(diǎn)的GO 分析（含BP、CC 及MF）柱狀圖

圖4 靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析圖

3 討論

痹病，是人體正氣不足或臟腑功能失調(diào)，風(fēng)寒濕熱等邪為患，痰濁瘀血滯留，引起經(jīng)脈氣血不通，出現(xiàn)肢體關(guān)節(jié)疼痛腫脹及活動(dòng)不利等為特征的疾病。中藥青風(fēng)藤功能祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛，在痹病治療中應(yīng)用較多，療效可靠。由于中藥是一個(gè)多成分多靶標(biāo)并且可以調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)多個(gè)生物學(xué)途徑的復(fù)雜混合物系統(tǒng)，中藥中的化學(xué)成分可以作用于機(jī)體內(nèi)多個(gè)靶標(biāo)從而發(fā)揮協(xié)同作用來治療疾病，給中藥作用機(jī)制的研究帶來了一定的挑戰(zhàn)。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)展十分迅速，已成為在藥理學(xué)研究中一個(gè)很有價(jià)值的工具，現(xiàn)今也逐漸應(yīng)用到中醫(yī)藥研究領(lǐng)域，對(duì)單位中藥及中藥復(fù)方中活性藥物成分的預(yù)測(cè)和分析、闡述復(fù)方的分子作用機(jī)制有重要意義[6-9]。

本研究通過TCMSP 篩選青風(fēng)藤有效活性成分6 個(gè)，分別是β-谷固醇、拉茲馬寧堿、千金藤啶堿、青藤堿、烏心石環(huán)氧內(nèi)酯、甘露聚糖。通過DRAR-CPI 服務(wù)器篩選出青風(fēng)藤靶點(diǎn)176 個(gè)。使用GeenCards 及OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)得到與RA 相關(guān)靶點(diǎn)305 個(gè)。藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行Venn 圖繪制，獲得共同相關(guān)的15 個(gè)靶點(diǎn)。將這15 個(gè)共同靶點(diǎn)上傳至String 在線數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)“度值＞均值”篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)7 個(gè)，包括：IL-10、IL-4、INS、MAPK8、ELANE、MAPK1、MAPK14。GO 功能富集分析顯示500 個(gè)BP、18 個(gè)CC、28 個(gè)MF。KEGG 通路富集分析顯示77 條通路，排名前10 的信號(hào)通路集中在感染、炎癥和免疫等相關(guān)通路。

已有的研究提示，β-谷甾醇是植物甾醇的重要組成成分，具有抗炎、調(diào)節(jié)人體甾體激素、抗氧化及抗腫瘤等作用[10]。Kripa 等研究發(fā)現(xiàn)，含有β-谷甾醇的白術(shù)醇提物可明顯降低佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠血清和組織中的TNF-α、C-反應(yīng)蛋白和IL-2 的含量，證明含有β-谷甾醇的白術(shù)具有顯著的抗炎作用[11]。拉茲馬寧堿可調(diào)節(jié)COX-2 表達(dá)[12]。千金藤啶堿不僅具有鎮(zhèn)痛及對(duì)多巴胺D1 激動(dòng)、D2 拮抗、D3 拮抗等多重作用，對(duì)心臟也具有較強(qiáng)的生物活性[13]。青藤堿具有免疫抑制、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、降血壓等多種藥理作用，已經(jīng)被證明在治療多種疾病中有藥理學(xué)活性[12]。

本研究中藥物與疾病共同的15 個(gè)靶點(diǎn)，主要參與對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)、調(diào)節(jié)DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、對(duì)中性粒細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等生物學(xué)過程。主要參與FcεRI 信號(hào)通路、百日咳、利什曼病、結(jié)核、IL-17 信號(hào)通路、恰加斯病（美國(guó)錐蟲?。?、C 型凝集素受體信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、弓形蟲病、FoxO 信號(hào)通路等感染、炎癥和免疫相關(guān)通路。這些通路中涉及次數(shù)較多的靶基因依次為MAPK1、MAPK14、MAPK8、IL-10 及IL-4?？傊?，提示青風(fēng)藤具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多途徑的作用特點(diǎn)，通過不同靶點(diǎn)和通路發(fā)揮藥效以治療RA。

RA 特征性的病理改變包括關(guān)節(jié)滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成及對(duì)關(guān)節(jié)骨和軟骨以及周圍組織造成破壞與侵蝕，在免疫介導(dǎo)的RA 的炎癥、增生和骨破壞三大病理過程中，MAPK 都起著重要的調(diào)節(jié)作用。IL-10、IL-4 作為抑炎和抗炎因子，參與了RA 的炎癥過程，高水平的細(xì)胞因子不斷刺激T 細(xì)胞、破骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶異常激活和過度的信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)控相關(guān)基因的過量表達(dá)。研究表明，對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠給予MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑后，在抑制滑膜炎癥、骨質(zhì)破壞和關(guān)節(jié)軟骨的破壞方面，與未給信號(hào)通路抑制劑組相比有顯著性差異[14]。以MAPK信號(hào)通路作為治療靶點(diǎn)，然后針對(duì)其信號(hào)傳遞中的各個(gè)階段抑制其活化，已經(jīng)成為治療RA 的一個(gè)熱點(diǎn)。研究顯示，用青藤堿與針刺聯(lián)合治療大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)炎評(píng)分降低，癥狀好轉(zhuǎn)。同時(shí)，核因子κB 和磷酸化的p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白表達(dá)被抑制，提示可能通過核因子κB 和MAPK 信號(hào)通路發(fā)揮作用[15]。

本研究通過中藥活性成分的篩選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析，從“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”的關(guān)聯(lián)性對(duì)青風(fēng)藤治療RA 的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行分析，找出了關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路，MAPK 信號(hào)通路也可作為后續(xù)研究的參考。為中藥青風(fēng)藤治療RA 的臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供了部分依據(jù)和理論支持。同時(shí)，本研究尚存在一些局限性，如數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)可能不完全，獲取小分子化合物及作用靶標(biāo)數(shù)量有限，不能完全揭示中藥藥理作用；依托網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的數(shù)據(jù)來源中存在對(duì)某些研究熱點(diǎn)傾向性，可能對(duì)本研究結(jié)果產(chǎn)生影響，但仍需進(jìn)一步做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以準(zhǔn)確揭示中藥抗RA 有效成分及作用機(jī)制。