響應(yīng)面法優(yōu)化淀粉葡糖苷酶的酶反應(yīng)體系

張程慧 馮敘橋

(遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，錦州 121013)

淀粉是人類膳食中重要碳水化合物，是人體內(nèi)能量代謝葡萄糖的主要來源[1-3]。淀粉葡糖苷酶(Amyloglucosidase, EC 3.2.1.3)是一種單鏈的酸性糖苷水解酶，能夠從淀粉或類似物分子的非還原末端切開α-1,4-糖苷鍵，也能夠水解α-1,6-糖苷鍵和α-1,3-糖苷鍵，是除α-淀粉酶(α-Amylase, EC 3.2.1.1)外能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為葡萄糖的另一重要糖苷酶(Glycosidase, EC 3.2.1)，且其水解淀粉最終產(chǎn)物全部為葡萄糖[4-6]。可見淀粉葡糖苷酶能夠參與人體內(nèi)的糖降解反應(yīng)，使得血糖高低受其影響較大。

糖尿病是一種以高血糖為主要標(biāo)志的多病因代謝疾病，控制餐后血糖是目前預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的有效手段[2,4,7]。隨著病癥的嚴(yán)重化，控制高血糖的難度也增強(qiáng)，而治療糖尿病的常見藥物有胰島素及其類似物、二甲雙胍或糖苷酶抑制劑等[8-10]，大多數(shù)降糖藥物短期內(nèi)具有良好降血糖作用，但長期服用則會損害身體各個器官，甚至引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥[8,11,12]。而糖苷酶抑制劑主要通過抑制小腸刷狀緣糖苷酶的活性，延緩淀粉、蔗糖、麥芽糖等糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可吸收的葡萄糖[13,14]，因而通過糖苷酶抑制劑抑制淀粉葡糖苷酶活性來達(dá)到控制糖尿病患者體內(nèi)的血糖水平的目的具有重要意義，因此建立良好的酶反應(yīng)體系有利于對糖苷酶抑制劑進(jìn)行篩選。

酶反應(yīng)體系受酶、底物、抑制劑、反應(yīng)時間、溫度等多個因素共同影響[15-17]，其中底物濃度、酶濃度以及反應(yīng)時間對酶反應(yīng)的影響較大[17-19]，本研究就這3個主要因素進(jìn)行考察，以淀粉葡糖苷酶為代表性糖苷酶，在參照人體生理數(shù)值基礎(chǔ)上，為這種酶建立相應(yīng)優(yōu)化的酶反應(yīng)體系。4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)是一種人工合成物質(zhì)，常被用來作為糖苷酶抑制研究中的底物，但人體內(nèi)不存在且也不會通過飲食攝入pNPG，另外其研究費(fèi)用較高[20]；而實(shí)驗(yàn)選用淀粉作為淀粉葡糖苷酶直接作用的天然底物對象，不僅費(fèi)用低，更期望降低以pNPG為底物模型的較高假陽性率[20,21]，通過對可溶性淀粉濃度、淀粉葡糖苷酶濃度、反應(yīng)時間的控制，使淀粉葡糖苷酶在所建立的反應(yīng)體系基礎(chǔ)上能夠最大化地發(fā)揮優(yōu)良活性，以便后期獲得糖苷酶抑制劑在此體系下所能發(fā)揮最大抑制效果的可信度較高的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淀粉葡糖苷酶(CAS：9032-08-0；酶活力：275 U/mL；酶來源：黑曲霉)；重蒸酚(批號：1129I021)；可溶性淀粉、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酒石酸鉀鈉葡萄糖等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Perkin elmer Victor X 酶標(biāo)儀，KK21V1160W 冰箱，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，F(xiàn)E20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照文獻(xiàn)[22]方法稍作修改。配制1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并分別取2 mL稀釋后的0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750 mg/mL葡萄糖液于試管，每管加入1.5 mL由實(shí)驗(yàn)室配制的DNS試劑，搖勻后沸水浴5 min，加熱結(jié)束后立即冷卻，放置20 min加適量水稀釋，測定540 nm吸光度值。以葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度值(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=1.303x+0.003，其中R2=0.999 5。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 可溶性淀粉濃度的確定

參照前人方法并稍作修改[16,23]。反應(yīng)總體積設(shè)定為2.00 mL，吸取一定體積的(0.1 mol/L，37 ℃下pH 6.80 ～ 6.81)磷酸鈉緩沖液和質(zhì)量濃度分別為3.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 mg/mL，0.50 mL的可溶性淀粉溶液混合于(37.0±0.2) ℃水浴預(yù)孵5 min，同時取(0.50 U/mL，0.10 mL)淀粉葡糖苷酶溶液于(55.0±0.2) ℃下預(yù)孵5 min，將酶液與淀粉溶液混合并于(37.0±0.2) ℃下反應(yīng)10 min，以1.50 mL DNS試劑終止整個反應(yīng)體系，并在沸水浴中加熱5 min，流水冷卻至室溫后放置20 min，適當(dāng)稀釋后在540 nm下測定吸光度OD值。以葡萄糖作為終產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，在保證反應(yīng)總體積不變的情況下，以每個淀粉濃度下不加酶的混合液作為空白對照，可得到一系列不同淀粉濃度下酶的反應(yīng)速度。

1.3.2.2 淀粉葡糖苷酶濃度的確定

分別在添加了淀粉的固定反應(yīng)體系中加入經(jīng)預(yù)孵處理的不同酶濃度(0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 U/mL)的淀粉葡糖苷酶0.10 mL，混合反應(yīng)10 min，加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴后立即冷卻至室溫并放置20分鐘，稀釋后測定樣品吸光度OD值。探討不同淀粉葡糖苷酶濃度對葡萄糖生成量的影響，在保證反應(yīng)總體積和淀粉濃度不變的情況下，以此淀粉濃度下的不加酶混合液作為空白對照。

1.3.2.3 反應(yīng)時間的確定

在反應(yīng)體系中酶液與淀粉溶液混合后，分別反應(yīng)2.5、5、7.5、10、15、20、25 min，以1.50 mL DNS試劑終止整個反應(yīng)體系，稀釋后測定吸光度OD值，以反應(yīng)時間0 min為空白對照。

1.3.3 響應(yīng)面分析法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在淀粉葡糖苷酶促反應(yīng)中，以單位量的樣品在一定時間內(nèi)生成的葡萄糖的量即酶促反應(yīng)速度表示酶活力[15,20]。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇可溶性淀粉濃度(X1)、淀粉葡糖苷酶濃度(X2)、反應(yīng)時間(X3)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，且以反應(yīng)速度為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過優(yōu)化酶促反應(yīng)條件，建立檢測糖苷酶活性的體外反應(yīng)體系以便后期進(jìn)行糖苷酶抑制劑的體外篩選實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系的因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 淀粉葡糖苷酶反應(yīng)體系響應(yīng)面分析法的因素與水平

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或3次以上，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2003進(jìn)行公式計(jì)算及數(shù)據(jù)儲存，用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及相關(guān)性分析，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，及利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析與方差分析，并用Origin 7.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1 可溶性淀粉濃度的確定

酶促反應(yīng)體系中，底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響較大[24]。從圖1可知，在保持酶濃度不變的情況下，淀粉濃度從0上升到10 mg/mL這一過程中，淀粉葡糖苷酶的酶活不斷增強(qiáng)，因而酶促反應(yīng)速度呈增大趨勢；但由于酶添加量固定，不斷增大淀粉濃度會使淀粉葡糖苷酶被飽和，以至于在較大淀粉濃度下的酶反應(yīng)速度呈現(xiàn)保持增長自增長緩慢的趨勢；當(dāng)?shù)矸蹪舛冗_(dá)到10 mg/mL時，此時酶促反應(yīng)速度已達(dá)到最大值且最終趨于穩(wěn)定(P>0.05)，因而淀粉葡糖苷酶的酶反應(yīng)體系中可溶性淀粉濃度選擇10 mg/mL為宜。

圖1 可溶性淀粉質(zhì)量濃度、淀粉葡糖苷酶濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系

2.1.2 淀粉葡糖苷酶濃度的確定

在底物充足且能夠使酶飽和的條件下，酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比關(guān)系[20,24]。如圖1所示，當(dāng)酶濃度控制在0～1.00 U/mL時，反應(yīng)速度與酶濃度呈良好線性關(guān)系(R2=0.994 8)，當(dāng)酶濃度超過1.00 U/mL時，其酶促反應(yīng)速度仍在增加但增長幅度明顯降低，可能是高濃度酶大量消耗淀粉，產(chǎn)物的快速生成抑制了淀粉葡糖苷酶活性，以致反應(yīng)速度后呈緩慢增長趨勢，因此，淀粉葡糖苷酶的酶反應(yīng)體系中淀粉葡糖苷酶濃度選擇1.00 U/mL為宜。

2.1.3 淀粉葡糖苷酶酶促反應(yīng)時間的確定

如圖2所示，在反應(yīng)10 min時間內(nèi)，吸光度與葡萄糖生成量成正比，因而以O(shè)D540值與反應(yīng)時間作圖，得出反應(yīng)時間與葡萄糖生成量呈良好的線性關(guān)系(R2=0.992 6)的結(jié)果；同樣，在反應(yīng)前10 min內(nèi)，淀粉葡糖苷酶的酶促反應(yīng)速度可達(dá)到最大，但反應(yīng)到第10 min時，反應(yīng)速度已略有下降但下降并不明顯(P>0.05)，隨著反應(yīng)時間延長，反應(yīng)速度顯著下降。過早停止反應(yīng)會導(dǎo)致產(chǎn)物濃度低，因此，在淀粉添加過量的前提下，為保證一定的葡萄糖生成量和較大的反應(yīng)速度，淀粉葡糖苷酶的酶反應(yīng)體系中反應(yīng)時間選擇10 min為宜。

圖2 淀粉葡糖苷酶酶促反應(yīng)時間與葡萄糖生成量、反應(yīng)速度的關(guān)系

2.2 淀粉葡糖苷酶反應(yīng)體系響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c方差分析

對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，建立二次響應(yīng)面回歸模型，尋求最優(yōu)響應(yīng)因子水平，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。獲得描述淀粉葡糖苷酶的酶促反應(yīng)速度與自變量可溶性淀粉濃度、淀粉葡糖苷酶濃度、反應(yīng)時間的二次多項(xiàng)式：

Y=14.14+0.11X1+2.61X2-1.63X3+0.48X1X2-0.46X1X3+0.04X2X3-2.07X12-2.21X22-1.40X32

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析

圖3 反應(yīng)速度預(yù)測值與觀察值之間的相關(guān)性

2.2.2 響應(yīng)曲面圖和等高線圖的分析

圖4是對響應(yīng)值反應(yīng)速度影響很大的兩因素交互作用的響應(yīng)面圖，其等高線呈橢圓形且根據(jù)方差分析可知，因素之間的交互作用極顯著(P<0.01)，其他因素交互作用不顯著。從圖4a可知，可溶性淀粉濃度與淀粉葡糖苷酶濃度的交互作用極顯著(P<0.01)，說明可溶性淀粉濃度改變顯著影響淀粉葡糖苷酶的用量，反之也成立；當(dāng)反應(yīng)時間保持在零水平時，淀粉濃度與酶濃度對酶促反應(yīng)速度的影響存在明顯的二次關(guān)系?？赡苁堑矸?、淀粉與產(chǎn)物葡萄糖的過渡態(tài)以及與葡萄糖的結(jié)構(gòu)之間存在相似性，淀粉葡糖苷酶與過渡態(tài)結(jié)構(gòu)結(jié)合的同時也會部分結(jié)合淀粉和葡萄糖，使得酶內(nèi)部淀粉和葡萄糖的能量狀態(tài)與游離淀粉和葡萄糖的不同，造成內(nèi)、外部化學(xué)平衡的不同，其中淀粉葡糖苷酶與淀粉和葡萄糖復(fù)合物的相對穩(wěn)定性由內(nèi)部化學(xué)平衡決定，而相對穩(wěn)定性則會影響酶活性，即影響體系的反應(yīng)速度[25]。因而，當(dāng)?shù)矸蹪舛纫欢〞r，淀粉葡糖苷酶的酶促反應(yīng)速度隨著酶濃度的增大而增大，但當(dāng)酶濃度達(dá)到1.15 U/mL后，反應(yīng)速度的增緩幅度呈下降趨勢；當(dāng)酶濃度一定時，過高至過低的淀粉濃度變量使得反應(yīng)速度均呈先增大后變小趨勢，且在淀粉質(zhì)量濃度為10.33 mg/mL處有最高值，說明淀粉葡糖苷酶的酶活性受到底物的影響，反應(yīng)體系中淀粉質(zhì)量濃度達(dá)到10.33 mg/mL時有利于酶發(fā)揮最大的活性。圖4b顯示了可溶性淀粉濃度與反應(yīng)時間對淀粉葡糖苷酶的酶促反應(yīng)速度的影響?？扇苄缘矸蹪舛扰c反應(yīng)時間的交互作用極顯著(P<0.01)，在淀粉質(zhì)量濃度為10.33 mg/mL，固定反應(yīng)時間6.99 min時，兩因素之間的交互作用最好，且可以看出淀粉濃度對酶促反應(yīng)速度的影響較大。在不添加酶的條件下，固定反應(yīng)時間后，酶促反應(yīng)速度隨淀粉濃度的升高呈先增大后變小趨勢，說明酶活性受到底物的影響，較高的底物濃度有利于淀粉葡糖苷酶發(fā)揮較大的活性，且在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時間內(nèi)有利于酶活性達(dá)到最大。

圖4 交互作用對淀粉葡糖苷酶促 反應(yīng)速度影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

由響應(yīng)面軟件分析能夠得到發(fā)揮淀粉葡糖苷酶良好酶活性最佳反應(yīng)體系的優(yōu)化參數(shù)：可溶性淀粉質(zhì)量濃度10.33 mg/mL、淀粉葡糖苷酶濃度1.15U/mL、反應(yīng)時間6.98 min，預(yù)測體系達(dá)到的最佳酶反應(yīng)速度為15.43 mmol/(L·min)。為考察模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的可行性，將反應(yīng)條件改進(jìn)為：可溶性淀粉質(zhì)量濃度10.30 mg/mL、淀粉葡糖苷酶濃度1.15 U/mL、反應(yīng)時間7.00 min，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的酶反應(yīng)速度為(15.17±1.84)mmol/(L·min)，與理論預(yù)測值相對誤差為1.69%，說明回歸模型與實(shí)際情況擬合良好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，所得反應(yīng)體系能夠促使淀粉葡糖苷酶發(fā)揮優(yōu)良活性。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定了最佳淀粉葡糖苷酶反應(yīng)體系的條件為可溶性淀粉質(zhì)量濃度10.30mg/mL、淀粉葡糖苷酶濃度1.15 U/mL、反應(yīng)時間7.00 min，在此條件下驗(yàn)證得酶促反應(yīng)速度為(15.17±1.84)mmol/(L·min)。模型的酶促反應(yīng)速度預(yù)測值與實(shí)際值的吻合度較高，說明所建立的反應(yīng)體系能夠使淀粉葡糖苷酶在此條件下發(fā)揮優(yōu)良的活性，獲得準(zhǔn)確可靠的酶活測定數(shù)據(jù)，以便后期獲得糖苷酶抑制劑在此反應(yīng)體系下所能發(fā)揮的最大抑制效果。