綠豆皮牡荊素對(duì)H2O2損傷HUVEC細(xì)胞的預(yù)防和治療作用

羅 磊 杜冠尚 張向輝 夏迎利 段雪瑩 朱文學(xué)

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；河南省農(nóng)產(chǎn)品干燥裝備工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng) 471023)

心腦血管疾病是一類高患病率和高死亡率的疾病，致死率居世界首位，嚴(yán)重威脅人類尤其是中老年人健康[1, 2]。人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，是覆蓋于心血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平細(xì)胞，其氧化損傷能誘發(fā)多種血管類疾病，相比其他細(xì)胞具有繁殖快，培養(yǎng)周期短等特點(diǎn)。曹致超等[3]建立HUVEC細(xì)胞氧化損傷模型，考察黃芩莖葉總黃酮對(duì)其保護(hù)作用及機(jī)制；吳瓊等[4]探究葒草花提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究。氧化應(yīng)激反應(yīng)是造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要因素之一，H2O2作為體內(nèi)常見(jiàn)的活性氧分子，能直接作用于細(xì)胞膜，造成脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞組織[5, 6]，常被用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化建立損傷模型。

綠豆(Mung Bean)，又名青小豆，蝶花亞科豇豆屬，產(chǎn)量和出口量均居世界首位[7, 8]。綠豆皮是包裹在綠豆外部的種皮，占綠豆質(zhì)量的8%，在綠豆深加工過(guò)程中常被廢棄，造成很大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[9]。研究表明，綠豆皮中黃酮含量為10.18 mg/g，牡荊素占其中的51.99%，被認(rèn)為是綠豆皮主要抗氧化成分[10]。An等[11]發(fā)現(xiàn)金蓮花牡荊素能提高小鼠血清SOD等抗氧化酶系，延緩衰老；Guimaraes等[12]研究發(fā)現(xiàn)牡荊素能減弱Aβ神經(jīng)毒性，減輕細(xì)胞損傷；周欣等[13]發(fā)現(xiàn)牡荊素能抑制細(xì)胞內(nèi)自由基活性，減少活性氧復(fù)合物。目前鮮見(jiàn)牡荊素對(duì)HUVEC細(xì)胞氧化損傷的預(yù)防和治療作用，因此本實(shí)驗(yàn)以綠豆皮牡荊素為研究對(duì)象，考察其對(duì)HUVEC細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，以期為綠豆皮應(yīng)用于血管類疾病的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆皮牡荊素實(shí)驗(yàn)室自制；禾盛澤綠豆皮，粉碎過(guò)篩；纖維素酶(酶活≥150 U/mg)輔助APG聯(lián)合超聲醇提，經(jīng)HPD100B大孔吸附樹(shù)脂純化所得；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、噻唑藍(lán)(methyl thiazoly1 tetrazolium，MTT)、雙抗(青霉素-鏈霉素)、二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白定量試劑盒、MDA、SOD、LDH、GSH、GSH-Px測(cè)定試劑盒；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SNWTZ-5N冷凍干燥箱，XKX41倒置微鏡，F(xiàn)M-CJ-6FD超凈工作臺(tái)，E191IR型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，XW-80A漩渦混合儀，L5S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，680全自動(dòng)酶標(biāo)儀，KQ-500DE超聲波清洗儀，HH-S6A水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，1.7 μm)；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)278nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相：A為水(0.5%甲酸)，B為乙腈(色譜級(jí))；梯度洗脫條件：0～3 min，5% B；3～6 min，10% B；6～9 min，15% B；9～12 min，20% B；12～15 min，25% B；15～20 min，30% B；20～25 min，20% B；25～30 min，10%B；30～35 min，5%B。

1.3.2 綠豆皮牡荊素提取和含量測(cè)定

提取方法參照李俠等[10]、HAN等[14]有改動(dòng)，并利用HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定[15]：稱取10 g過(guò)80目篩的綠豆皮粉末，放入90 mL水中，加入0.5%纖維素酶，在pH4.5、50 ℃條件下酶解60 min，沸水滅酶3 min，抽濾得濾渣和酶提液V1，濾渣和70%乙醇以1∶10的比例混合，加入APG0810調(diào)整濃度為0.5%、調(diào)pH為8.5，室溫浸泡2.5 h后，350 W、50 ℃超聲45 min，過(guò)濾得提取液V2，合并V1、V2得綠豆皮牡荊素粗提液V，50 ℃旋蒸濃縮至一定體積，4倍體積無(wú)水乙醇沉淀離心去大分子，過(guò)0.22 μm濾膜，278 nm下高效液相色譜測(cè)定峰值，帶入牡荊素標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=41.997x+16.217，R2=0.999 5)，按式(1)計(jì)算提取量：

(1)

式中：C為綠豆皮牡荊素濃度；V為粗提液總體積；N為稀釋倍數(shù)；M為綠豆皮質(zhì)量。

1.3.3 綠豆皮牡荊素的純化

預(yù)處理HPD-100B型樹(shù)脂，將2 BV質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL的綠豆皮牡荊素提取液以1.5 mL/min的速度過(guò)柱吸附(pH 4.0)，吸附完全后先用3 BV蒸餾水洗脫除雜，再用3BV體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇以1.0 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至有淡黃色固體析出，真空冷凍干燥得綠豆皮牡荊素，測(cè)定純度為(81.690±0.241)%。

1.3.4 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)

配制含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，將復(fù)蘇后細(xì)胞移入裝有適量培養(yǎng)基的25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。在5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，及時(shí)更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)80%左右，以1∶2比例傳代。

1.3.5 HUVEC細(xì)胞氧化損傷模型建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液加入相同比例臺(tái)盼藍(lán)溶液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×105個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96孔板，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。棄上清，加入不同濃度H2O2進(jìn)行細(xì)胞損傷，共10個(gè)梯度，6個(gè)平行，相同條件下培養(yǎng)24 h，PBS沖洗1～3次，每孔先加入200 μL培養(yǎng)基、再加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清，每孔加入150 μLDMSO，室溫放置10 min，放入酶標(biāo)儀，調(diào)節(jié)濾光片至490 nm，記錄吸光度值，帶入式(2)計(jì)算細(xì)胞存活率。

(2)

式中：A0為空白組吸光度均值；A1為不同濃度H2O2吸光度均值。

1.3.6 綠豆皮牡荊素質(zhì)量濃度選擇

用培養(yǎng)基配制不同濃度的綠豆皮牡荊素溶液代替H2O2，其余操作步驟及計(jì)算方法參照1.3.5。

1.3.7 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液制備

預(yù)防組：在六孔板中設(shè)置空白組、模型組、低、中、高劑量組、VC對(duì)照組，參照1.3.5調(diào)整細(xì)胞濃度為2.0×105個(gè)/mL，每孔接種2.0 mL，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液。3個(gè)劑量組各加入2.0 mL相應(yīng)質(zhì)量濃度的綠豆皮牡荊素培養(yǎng)液；對(duì)照組加入2.0 mL質(zhì)量濃度為100 μg/mL的VC培養(yǎng)液，其余兩組加入2.0 mL培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，棄上清。除空白組外每孔加入2.0 mL濃度為900 μmol/L的H2O2，在相同條件細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。收集培養(yǎng)液離心(1 500 r/min、5 min)取上清待測(cè)；細(xì)胞消化后，用PBS吹洗離心(1 000 r/min、10 min)，取細(xì)胞沉淀團(tuán)塊加1.0 mLPBS，冰浴超聲破碎(450 W、5s/次、間隔30 s、重復(fù)3次)待測(cè)。

治療組：按上述步驟將細(xì)胞接種培養(yǎng)24 h后，先加入H2O2損傷細(xì)胞，再加入不同濃度綠豆皮牡荊素溶液和VC培養(yǎng)液，其余操作方法保持不變。

1.3.8 MDA、SOD、LDH、GSH、GSH-Px測(cè)定

參照試劑盒方法測(cè)定細(xì)胞及培養(yǎng)液中的各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Origin85軟件作圖、用DPS7.5軟件中Tukey法進(jìn)行完全隨機(jī)單因素方差分析，不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜結(jié)果

經(jīng)HPD100B大孔吸附樹(shù)脂純化后綠豆皮牡荊素色譜圖如圖1b所示，與圖1a牡荊素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰保留時(shí)間一致，說(shuō)明提取成分為牡荊素。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品HPLC色譜圖

2.2 過(guò)氧化氫及綠豆皮牡荊素濃度篩選

過(guò)氧化氫(H2O2)是機(jī)體氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧，能分解產(chǎn)生氧自由基，過(guò)量存在可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白變性，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16-18]。如圖2，H2O2濃度越高對(duì)HUVEC細(xì)胞抑制作用越明顯，細(xì)胞存活率越低。當(dāng)H2O2濃度為900 μmol/L時(shí)，細(xì)胞半數(shù)致死，存活率為51.32%。H2O2濃度過(guò)高細(xì)胞死亡損傷嚴(yán)重，濃度過(guò)低不能有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，兩種情況均不能客觀反映后期藥物處理對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用[19]，因此選擇900 μmol/L作為模型損傷濃度。

綠豆皮牡荊素質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率與濃度呈正相關(guān)，藥物濃度越高，細(xì)胞存活率越高；小于60μg/mL時(shí)，藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響不顯著(P>0.05)；為60、80、100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增值加速，影響效果顯著(P<0.05)，存活率分別為110.61%、122.3%、131.68%；藥物濃度高于100 μg/mL時(shí)，產(chǎn)生高濃度抑制，細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)。因此選擇能顯著促進(jìn)細(xì)胞生產(chǎn)的藥物濃度作為后期低、中、高劑量處理濃度(即60、80、100 μg/mL)。

圖2 不同濃度H2O2及綠豆皮牡荊素對(duì)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.3 HUVEC細(xì)胞及培養(yǎng)液中MDA含量

MDA是機(jī)體中氧自由基與多不飽和脂肪酸結(jié)合產(chǎn)物，能降低細(xì)胞免疫機(jī)能，影響細(xì)胞分裂，促使細(xì)胞凋亡[20-22]。如圖3，H2O2能顯著增高細(xì)胞和培養(yǎng)液中MDA含量(P<0.05)，不同濃度藥物處理均能顯著降低MDA含量(P<0.05)；預(yù)防組細(xì)胞和培養(yǎng)液中MDA含量整體低于治療組，且藥物濃度越大，組間差異越小；治療組細(xì)胞中MDA抑制能力與藥物

圖3 HUVEC細(xì)胞和培養(yǎng)液中MDA含量

濃度呈明顯正相關(guān)(P<0.05)；當(dāng)藥物濃度為100 μg/mL時(shí)，預(yù)防組細(xì)胞和培養(yǎng)液中MDA含量與VC對(duì)照組基本一致。說(shuō)明一定濃度的綠豆皮牡荊素能降低MDA含量，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，且損傷前預(yù)防優(yōu)于損傷后治療。

2.4 HUVEC細(xì)胞及培養(yǎng)液中SOD活性

SOD是機(jī)體內(nèi)重要的酶類抗氧化物，能通過(guò)歧化反應(yīng)及時(shí)清理氧自由基，是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[23-25]。從圖4可看出，H2O2處理后細(xì)胞及培養(yǎng)液中SOD活力顯著降低，劑量組與模型組相比SOD活力顯著上升(P<0.05)；治療組細(xì)胞和培養(yǎng)液中SOD活力高于預(yù)防組；當(dāng)綠豆皮牡荊素質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，治療組細(xì)胞和培養(yǎng)液中SOD活力與VC組持平(P>0.05)；預(yù)防組藥物質(zhì)量濃度為80、100 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)液中SOD活性相差不大。說(shuō)明綠豆皮牡荊素質(zhì)量濃度在80～100 μg/mL內(nèi)，能起到調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化平衡的作用。

圖4 HUVEC細(xì)胞和培養(yǎng)液中SOD活性

2.5 HUVEC 細(xì)胞及培養(yǎng)液中LDH活性

LDH是一種存在于細(xì)胞內(nèi)部，促進(jìn)機(jī)體能量代謝的氧化還原類酶，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，會(huì)透過(guò)細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞外部，其活性大小可客觀反映細(xì)胞損傷程度[26, 27]。如圖5，H2O2處理能顯著降低細(xì)胞中LDH活性，提高培養(yǎng)液中LDH活性(P<0.05)；預(yù)防組和治療組細(xì)胞中，低、中、高劑量組LDH活性差異顯著，與藥物濃度呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，濃度為100 μg/mL時(shí)，治療組細(xì)胞中LDH活性與VC治療組無(wú)明顯差異(P>0.05)；預(yù)防組和治療組培養(yǎng)液中LDH活性隨藥物濃度變化差異不顯著(P>0.05)，中、高劑量藥物治療效果幾乎與VC組持平。

圖5 HUVEC細(xì)胞和培養(yǎng)液中LDH活性

2.6 HUVEC細(xì)胞及培養(yǎng)液中GSH含量

GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)，能還原機(jī)體細(xì)胞在氧化損傷過(guò)程中殘存的H2O2為H2O，本身作為反應(yīng)底物被大量消耗，因此GSH含量可作為評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力大小的指標(biāo)[28, 29]。如圖6所示，

圖6 HUVEC細(xì)胞和培養(yǎng)液中GSH含量

H2O2能顯著降低細(xì)胞和培養(yǎng)液中GSH含量(P<0.05)；治療組細(xì)胞和培液中GSH含量與藥物劑量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，中、高劑量藥物(綠豆皮牡荊素質(zhì)量濃度分別為80、100 μg/mL時(shí))處理后，預(yù)防組細(xì)胞和培養(yǎng)液中GSH含量差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)藥物質(zhì)量濃度100 μg/mL時(shí)，治療組細(xì)胞和預(yù)防組培養(yǎng)液中GSH含量與VC處理組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.7 HUVEC 細(xì)胞及培養(yǎng)液中GSH-Px活性

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，能特異催化GSH與H2O2反應(yīng)生成H2O，從而降低體內(nèi)H2O2濃度，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，在機(jī)體抗氧化過(guò)程中表現(xiàn)積極[30, 31]。如圖7，模型損傷組、劑量組細(xì)胞和培養(yǎng)液中GSH-Px活性相比空白組顯著下降(P<0.05)，各藥物處理組細(xì)胞和培養(yǎng)液中GSH-Px活性相比模型組顯著上升(P<0.05)，各劑量組之間存在明顯差異；當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，治療組細(xì)胞和培養(yǎng)液中GSH-Px活力與VC處理組無(wú)明顯差異(P>0.05)。

圖7 HUVEC細(xì)胞和培養(yǎng)液中GSH-Px活性

3 討論

機(jī)體內(nèi)促氧因子和抗氧因子失衡導(dǎo)致的自由基過(guò)剩能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老病變，是造成心腦血管疾病和癌癥等慢性疾病產(chǎn)生的重要因素，因此增加機(jī)內(nèi)抗氧化物質(zhì)是治療這類疾病的有效手段[32]。研究表明食物中的活性成分(酚類、黃酮等)能顯著抑制體內(nèi)自由基活動(dòng)，長(zhǎng)期食用富含抗氧化成分的食物能增強(qiáng)人體免疫力，減少血管類疾病的發(fā)病率[33-35]。

牡荊素的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其C環(huán)上連接的酚羥基活性最高，能與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，從而終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其C2和C3之間的雙鍵結(jié)構(gòu)在一定程度上能增強(qiáng)B環(huán)酚羥基作用，增強(qiáng)抗氧化效果[36, 37]。關(guān)于牡荊素是否能在機(jī)體內(nèi)直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，以及其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)果

采用H2O2誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞建立細(xì)胞氧化損傷模型，觀察不同綠豆皮牡荊素濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，確定最佳藥物濃度，探究其對(duì)細(xì)胞氧化損傷的預(yù)防和保護(hù)作用。結(jié)果表明，H2O2能不同程度的抑制HUVEC細(xì)胞增值，900 μmol/L H2O2濃度為最佳損傷濃度；HUVEC細(xì)胞存活率在一定范圍內(nèi)隨綠豆皮牡荊素濃度增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；無(wú)論是損傷前預(yù)防還是損傷后治療，低、中、高濃度綠豆皮牡荊素均能顯著降低細(xì)胞和培養(yǎng)液中MDA含量，增加GSH含量，提高SOD、GSH-Px酶活，并存在一定劑量依賴性；同時(shí)綠豆皮牡荊素能減輕細(xì)胞膜受損程度，阻礙細(xì)胞內(nèi)LDH滲透到細(xì)胞外；當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞保護(hù)能力相當(dāng)于VC對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)能力。綠豆皮牡荊素有較好的抗氧化能力，能有效避免機(jī)體有害成分和活性氧累積，提高各種抗氧化酶類活性，保護(hù)細(xì)胞完整性。