LncRNA H19調(diào)控Runx2表達(dá)對(duì)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的影響*

宋 強(qiáng)，王振海，李敬武，穆勝凱

(1.沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院研究所創(chuàng)傷科 110044；2.聯(lián)勤部保障部隊(duì)第967醫(yī)院骨科，遼寧大連 116011；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院疼痛科，沈陽(yáng) 110003；4.沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院脊柱科 110044)

骨質(zhì)破壞性疾病多由凝血和纖溶系統(tǒng)紊亂或血液供應(yīng)不足引起，股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)作為其中之一的致殘疾病，通常出現(xiàn)進(jìn)行性的股骨頭塌陷和繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎，對(duì)患者生存質(zhì)量產(chǎn)生巨大影響，需行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)[1]。ONFH可分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性(non-traumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH)兩種亞型，NONFH常出現(xiàn)在30～50歲的患者，多出現(xiàn)在類(lèi)固醇皮質(zhì)激素治療炎性疾病后[2]。有研究指出，NONFH同人類(lèi)免疫缺陷病毒感染、自身免疫性疾病、酗酒、使用糖皮質(zhì)激素及凝血障礙有關(guān)[3]。也有研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)成骨分化能力的改變導(dǎo)致骨壞死和骨再生失衡，是NONFH發(fā)病的關(guān)鍵因素。各因素誘導(dǎo)MSCs向脂肪細(xì)胞分化，使細(xì)胞增殖和分化能力下降，導(dǎo)致機(jī)體自身修復(fù)能力降低，ONFH加重。但到目前為止，NONFH發(fā)病的具體分子機(jī)制仍不清楚[4]。

近年來(lái)，隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成和高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，研究人員已逐漸將研究中心放在非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)的生物學(xué)功能上。ncRNAs在調(diào)控基因表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用[5]。其中，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)廣泛參與生物體的生命過(guò)程，包括表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等[6]。LncRNAs作為“腳手架”介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用[7-8]；作為“引導(dǎo)員”促進(jìn)蛋白質(zhì)和基因的啟動(dòng)子結(jié)合；作為“信號(hào)”調(diào)節(jié)鄰近基因的轉(zhuǎn)錄；作為“誘餌”與微RNA(miRNA)或蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，影響mRNA的轉(zhuǎn)錄[9]。但目前有關(guān)lncRNAs參與NONFH發(fā)生、發(fā)展的研究并不多見(jiàn)。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX family transcription factor 2，Runx2)的表達(dá)是MSCs向成骨細(xì)胞譜系分化的充分且必要條件，是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志[10]。Runx2高表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，而Runx2表達(dá)水平下調(diào)可能促進(jìn)NONFH的進(jìn)展[11-12]。因此，本研究分析NONFH患者lncRNA H19表達(dá)情況，并分析其可能的機(jī)制，為NONFH的診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本采集

選取2014年1月至2018年12月在本院治療的42例NONFH患者(NONFH組)，男25例，女17例；年齡30～69歲，平均(49.2±8.3)歲；病程1～11年，平均(5.7±2.5)年。同時(shí)選取年齡、性別分布相近的30名健康志愿者作為對(duì)照組，排除高血壓、糖尿病、凝血和纖溶系統(tǒng)紊亂、心腦血管疾病及其他慢性疾病。對(duì)照組男17例，女13例；年齡28～72歲，平均(48.3±6.6)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。入院當(dāng)天所有受試者抽取全血20 mL，室溫靜置90 min，1 250×g室溫離心20 min，制備血清標(biāo)本。

1.1.2主要儀器與試劑

用于H19基因敲降的小干擾RNA(si-RNA)慢病毒、對(duì)照病毒及Runx2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)儀購(gòu)自瑞士Roche公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；鼠抗人Runx2抗體(1∶200)、兔抗人GAPDH抗體(1∶1 000)及二抗(1∶2 000)均購(gòu)自美國(guó)Boster公司。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC-BM)購(gòu)自美國(guó)ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

hMSC-BM培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液(美國(guó)Invitrogen公司)的高糖DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，收集、傳代。對(duì)于成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)，將培養(yǎng)基替換為含10%胎牛血清和100 ng/mL重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2，美國(guó)R&D Systems公司)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 d。

1.2.2RT-PCR

TRIzol法提取總RNA，并檢測(cè)純度及濃度。依據(jù)日本TaKaRa公司試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。H19的上游引物序列為5′-GGT TGG AGT TGT GGA GAC-3′，下游引物序列為5′-GCG TAA TGG AAT GCT TGA A-3′；Runx2上游引物序列為5′-CGG CCC TCC CTG AAC TCT-3′，下游引物序列為5′-TGC CTG CCT GGG GTC TGT A-3′；U6的上游引物序列為5′-TTA TGG GTC CTA GCC TGA C-3′，下游引物序列為5′-CAC TAT TGC GGG CTG C-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算二者的相對(duì)表達(dá)水平。ΔCt=Ct標(biāo)記物-CtU6。以U6作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染

Lipofectamine 2000將過(guò)表達(dá)和沉默載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，收集細(xì)胞用于進(jìn)一步研究。Si-H19#1(5′-3′)：CCU CUA GCU UGG AAA UGA AUA(引導(dǎo)鏈)，UUC AUU UCC AAG CUA GAG GGU(過(guò)客鏈)；Si-H19#2(5′-3′)：GCA CUA CCU GAC UCA GGA AUC(引導(dǎo)鏈)，UUC CUG AGU CAG GUA GUG CAG(過(guò)客鏈)。

1.2.4Western blot

提取細(xì)胞總蛋白，制備8%聚丙烯酰胺凝膠，每孔20 μg上樣；80 V積層膠，120 V分離膠進(jìn)行電泳，100 V轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜90 min，5%牛血清蛋白(BSA)封閉PVDF膜1 h，加一抗，4 ℃振蕩過(guò)夜。TBST洗滌后滴加二抗，37 ℃孵育1 h，顯影成像。GAPDH作為內(nèi)參，ImageJ軟件獲取灰度值。

1.2.5CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48、72 h加入CCK-8試劑，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值(A450值)。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 NONFH患者及健康受試者血清lncRNA H19、Runx2表達(dá)情況

RT-PCR結(jié)果顯示，lncRNA H19在NONFH患者血清中的表達(dá)水平為0.43±0.07，較lncRNA H19在健康受試者血清中表達(dá)水平(1.03±0.18)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1A)。而Runx2在NONFH患者血清中的表達(dá)水平為0.54±0.10，低于健康受試者血清中Runx2表達(dá)水平(1.05±0.13)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

A：血清lncRNA H19相對(duì)表達(dá)水平比較；B：血清Runx2相對(duì)表達(dá)水平比較；a:P<0.05,與對(duì)照組比較。

2.2 BMP-2促進(jìn)lncRNA H19在hMSC-BM中表達(dá)

應(yīng)用不同濃度的BMP-2誘導(dǎo)hMSC-BM的成骨分化，分別采用0、25、50、100、200 ng/mL BMP-2處理hMSC-BM，RT-PCR檢測(cè)lncRNA H19表達(dá)水平變化，隨著B(niǎo)MP-2加入量的增加，lncRNA H19的表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，但在BMP-2加入至100 ng/mL后，lncRNA H19表達(dá)不再明顯增加(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

a：P<0.05。

2.3 lncRNA H19表達(dá)對(duì)Runx2的影響

在hMSC-BM中分別過(guò)表達(dá)和沉默lncRNA H19，確定基因操作工具有效，其中si-H19#1具有更優(yōu)的沉默效率(P<0.05，圖3A)；采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)或沉默lncRNA H19后Runx2表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示lncRNA H19的表達(dá)變化并不引起Runx2 mRNA表達(dá)變化(P>0.05，圖3B)，而對(duì)Runx2水平變化影響明顯(P<0.05，圖3C)。

A：轉(zhuǎn)染si-H19和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒前后lncRNA H19表達(dá)情況；B：轉(zhuǎn)染si-H19和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒前后Runx2 mRNA表達(dá)情況；C：轉(zhuǎn)染si-H19#1和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒前后Runx2表達(dá)情況；NC：對(duì)照病毒質(zhì)粒；a：P<0.05，與NC比較。

2.4 lncRNA H19和Runx2對(duì)hMSC-BM增殖能力的影響

CCK-8驗(yàn)證lncRNA H19和Runx2對(duì)hMSC-BM增殖能力的影響。將si-H19#1序列轉(zhuǎn)染進(jìn)入hMSC-BM后，細(xì)胞的增殖能力明顯下降。在此基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)Runx2，被抑制的細(xì)胞的增殖能力部分恢復(fù)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

NC:對(duì)照病毒質(zhì)粒；a:P<0.05，與si-H19#1比較。

3 討 論

NONFH病因復(fù)雜，可由多種原因引起，對(duì)股骨頭的損傷尤為突出，目前其病因和致病機(jī)制尚不清楚。日本第4次全國(guó)NONFH流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，致病因素中激素占50%，酒精占27%，酒精+激素性占2%，其他因素占21%[13]。目前針對(duì)NONFH早期患者以口服降脂藥、抗凝藥和雙磷酸鹽藥物等為主，易引起胃腸道不適反應(yīng)，并可能對(duì)肝、腎功能造成損傷，療效欠佳[14]。對(duì)于中晚期患者多采取手術(shù)治療，壞死晚期采用人工關(guān)節(jié)置換術(shù)，但手術(shù)存在費(fèi)用高、創(chuàng)傷大、并發(fā)癥多等缺點(diǎn)。因此，進(jìn)一步探究NONFH的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，從分子水平探究其發(fā)病原因，給予針對(duì)性的靶向治療，可能是臨床治療的突破口。

在過(guò)去的20年里，高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展極大地加速了基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究。大量研究認(rèn)為，ncRNA的表達(dá)改變是疾病發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素之一[15-16]，廣泛參與生物體的生命過(guò)程，如染色體重構(gòu)、細(xì)胞分化及免疫應(yīng)答等[17]。NONFH的發(fā)生需要ncRNA的參與。LI等[18]在1項(xiàng)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的NONFH研究中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)可能參與NONFH發(fā)生、發(fā)展的miRNAs，而WEI等[19]和CHEN等[20]分別發(fā)現(xiàn)了lncRNA HOTAIR和lncRNA AWPPH可能參與NONFH相關(guān)成骨基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19在NONFH患者血清中表達(dá)水平明顯降低，可能參與NONFH的病理生理過(guò)程。lncRNA H19定位于人11p15.5，是第一個(gè)被證實(shí)為具有印記特性的基因[21]，在胚胎期表達(dá)，出生后表達(dá)下降，而往往在腫瘤及其他疾病中再次出現(xiàn)[22]。lncRNA H19過(guò)表達(dá)同血管生成和細(xì)胞增殖密切相關(guān)[21，23]。同時(shí)，過(guò)表達(dá)的lncRNA H19可以誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移[23]。有研究認(rèn)為，lncRNA H19介導(dǎo)MSCs的多種分化過(guò)程，參與肌肉骨骼系統(tǒng)的再生，并對(duì)骨代謝過(guò)程進(jìn)行調(diào)控[24]。

骨的形成主要是由骨祖細(xì)胞、軟骨祖細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)協(xié)同作用完成，而細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、礦化和細(xì)胞凋亡是成骨細(xì)胞在骨形成中的4個(gè)主要階段。成骨細(xì)胞分化改變是NONFH發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵病理變化[11]，而B(niǎo)MP-2能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19在hMSC-BM中的表達(dá)水平同BMP-2加入劑量相關(guān)，BMP-2以濃度依賴(lài)的方式促進(jìn)lncRNA H19在hMSC-BM中的表達(dá)，提示lncRNA H19參與了成骨細(xì)胞分化的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，lncRNA H19和Runx2在NONFH患者血清中均表達(dá)降低；而在hMSC-BM中過(guò)表達(dá)lncRNA H19后能夠在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)Runx2的表達(dá)；相反，在抑制了lncRNA H19的表達(dá)后Runx2的表達(dá)也隨之降低。而在細(xì)胞增殖的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抑制lncRNA H19后細(xì)胞的增殖能力減弱，而過(guò)表達(dá)Runx2后，細(xì)胞的增殖能力部分恢復(fù)，提示lncRNA H19對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響是通過(guò)Runx2實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，與健康對(duì)照相比，NONFH患者lncRNA H19表達(dá)下調(diào)。lncRNA H19能夠促進(jìn)hMSC-BM中Runx2表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。因此，lncRNA H19可能通過(guò)影響Runx2表達(dá)參與NONFH的發(fā)生、發(fā)展，但二者之間調(diào)控的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。此外，血管內(nèi)凝血學(xué)說(shuō)認(rèn)為各種系統(tǒng)疾病激活的血管內(nèi)凝血也可能是引起骨內(nèi)血栓和骨壞死的重要途徑，NONFH患者往往存在血小板活性程度增高、凝血趨勢(shì)增加的高凝和低纖容狀態(tài)。lncRNA H19和Runx2在這其中扮演的角色仍不明確，這也是后期基礎(chǔ)向臨床轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要討論方向。