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    基于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的乳制品中牛血清白蛋白的定量檢測方法

    2021-02-05 05:53:56陳雨湉賴世云任一平
    中國食品學(xué)報 2021年1期
    關(guān)鍵詞:二甲基內(nèi)標(biāo)同位素

    周 熒,陳雨湉,賴世云,胡 蓓,任一平,*

    (1 浙江工業(yè)大學(xué) 杭州310000 2 杭州帕匹德科技有限公司 杭州310000)

    牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)由582 個氨基酸殘基組成,分子質(zhì)量約66.4 ku,含有2 個變異體,兩者之間只存在1 個氨基酸的差異,B 型中第214 位的氨基酸由丙氨酸(Ala)突變?yōu)樘K氨酸(Thr)。BSA 廣泛應(yīng)用于生化試驗(yàn)中,一般作為穩(wěn)定劑被用于限制酶或者修飾酶的保存溶液和反應(yīng)液中[1]。乳汁中的BSA 與血液中的血清白蛋白物理化學(xué)特性相同,在常乳中含量約為0.4 g/L[2-4]。BSA 是人體必需氨基酸的良好來源,也是生物活性肽的重要來源,具有結(jié)合游離脂肪酸和其它脂類的作用,還具有抑制脂質(zhì)氧化的作用[5-7]。

    目前,BSA 的定量檢測方法以熒光光譜法[8-10]和免疫學(xué)方法[11-13]為主。紀(jì)圓圓等[14]研究確定了BSA 濃度與ZnS 量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系,實(shí)現(xiàn)BSA 含量的檢測。熒光光譜法檢測速度快,操作簡單,然而不適用于基質(zhì)復(fù)雜的樣品,其它蛋白會干擾檢測結(jié)果。王瑋等[15]利用鼠抗BSA單克隆抗體,使用表面等離子共振技術(shù)定量檢測牛肉制品中的BSA。袁耀武等[16]建立了1 個競爭酶聯(lián)免疫吸附法,用于牛乳中BSA 的檢測。免疫學(xué)方法一般具有特異性強(qiáng),靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),較適用于微量非變性蛋白質(zhì)的定量檢測,然而用于乳制品的檢測時,由于食品加工會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生各種修飾,如磷酸化和糖基化,造成假陰性的結(jié)果。

    靶向蛋白質(zhì)組學(xué)(Targeted proteomics)技術(shù)是對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量的檢測技術(shù)。將蛋白質(zhì)酶解成肽段,經(jīng)色譜分離,使用三重四極桿中選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)或多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM),建立相應(yīng)的定量檢測方法[17-19]。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)現(xiàn)了對特征肽段的準(zhǔn)確定量,并根據(jù)肽段與蛋白質(zhì)之間的量子傳遞關(guān)系,實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的主要步驟如下:1)目標(biāo)蛋白質(zhì)特征肽段的篩選。該步驟是影響定量方法準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟,所選特征肽段應(yīng)具有特異性強(qiáng),靈敏度高,穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。2)同位素內(nèi)標(biāo)的設(shè)計。加入同位素內(nèi)標(biāo)能有效校正離子化過程中復(fù)雜基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)問題。3)質(zhì)譜方法的建立。

    本研究使用三重四極桿中MRM 模式建立乳制品中BSA 的定量檢測方法,該方法具有靈敏度高,特異性強(qiáng)等特點(diǎn),可滿足市售嬰幼兒配方奶粉與乳清粉中BSA 含量的測定。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    嬰幼兒配方乳粉購于當(dāng)?shù)爻?;乳清粉收集自生產(chǎn)商處。乳清粉樣品溶液制備:稱取粉末1.00 g,用水溶解并定容至1 000 mL;嬰幼兒配方乳粉樣品溶液制備:稱取粉末1.00 g,用水溶解并定容至100 mL。

    碳酸氫銨、碳酸氫鈉(均為分析純級),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氨水(25%,體積分?jǐn)?shù)),浙江漢諾化工科技有限公司;氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)分析純級、二硫蘇糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、甲酸(FA)、乙腈(ACN)、甲醛(36.5%~39%,體積分?jǐn)?shù))、同位素甲醛(20%,體積分?jǐn)?shù))均為色譜純級、牛血清白蛋白高純標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥90%),美國Sigma-Aldrich 公司;重組豬胰蛋白酶(Trypsin,測序級),上海雅心生物技術(shù)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    靜電場軌道離子阱質(zhì)譜儀(Q Exactive)、Proteome Discoverer 2.1 數(shù)據(jù)處理軟件,美國Thermo Fisher 公司;三重四級桿質(zhì)譜儀(Xevo TQ-XS)、Masslynx 4.1 數(shù)據(jù)處理軟件,美國Waters 公司;電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;MSC-100 恒溫金屬浴,杭州奧盛儀器有限公司。

    1.3 試驗(yàn)前處理

    1.3.1 酶解肽段溶液的制備 準(zhǔn)確吸取200 μL試樣溶液于2 mL 離心管中,加入超純水550 μL,加入200 μL 濃度為500 mmol/L 的NaHCO3溶液,隨后加入10 μL 濃度為500 mmol/L 的DTT 溶液,混勻后置于70 ℃恒溫金屬浴中振蕩反應(yīng)30 min;待反應(yīng)結(jié)束后,取出,冷卻至室溫(25 ℃),加入30 μL 濃度為500 mmol/L 的IAA 溶液,混勻后置于25 ℃避光反應(yīng)30 min;反應(yīng)完成后加入10 μL 質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的Trypsin 溶液,混勻后置于37℃恒溫金屬浴中振蕩酶解2 h,制得酶解肽段溶液,備用。

    1.3.2 二甲基化和同位素二甲基化衍生 取1 份酶解肽段溶液,加入40 μL 4%(體積分?jǐn)?shù))甲醛-水溶液和40 μL 濃度為600 mmol/L 的氰基硼氫化鈉溶液,混勻后置于25 ℃恒溫金屬浴中振蕩反應(yīng)1 h;待反應(yīng)結(jié)束后,加入160 μL 1%(體積分?jǐn)?shù))氨水和80 μL 純甲酸,混勻后置于25 ℃恒溫金屬浴中振蕩反應(yīng)30 min;反應(yīng)完成后,冷卻至室溫,用0.22 μm 濾膜過濾,即得二甲基標(biāo)記溶液。同時取另1 份酶解肽段溶液,加入40 μL 4%(體積分?jǐn)?shù))同位素甲醛-水溶液后,按上文步驟處理,即得同位素二甲基標(biāo)記溶液,作為內(nèi)標(biāo)。移取相同體積的混合二甲基標(biāo)記溶液與同位素二甲基標(biāo)記溶液混合,即制得待測液。

    1.4 液相色譜條件

    色譜柱:Acquity BEH 300 C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm,Waters);柱溫:40 ℃;樣品室溫度:15 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL;流動相A:0.1%甲酸-水溶液;流動相B:0.1%甲酸-乙腈溶液;梯度洗脫:0~1.0 min,5%B;1.0~5.8 min,5%~60%B;5.8~6.0 min,60%~100%B;后運(yùn)行1.9 min;流速為0.3 mL/min。

    1.5 質(zhì)譜條件

    靜電場軌道離子阱質(zhì)譜參數(shù):離子源模式:ESI+;離子源參數(shù):毛細(xì)管電壓:3.5 kV;毛細(xì)管溫度:320 ℃;輔助氣加熱溫度:350 ℃;鞘氣流速:40 U;輔助氣流速:10 U;質(zhì)譜掃描模式:采用Full MS/dd-MS2模式;Full MS 參數(shù):掃描范圍:200~2 000 m/z;Orbitrap 分辨率:70 000;AGC target值:1×106;允許最大注入時間:200 ms;dd-MS2參數(shù):Orbitrap 分辨率:17 500;AGC target 值:1×105;允許最大注入時間:50 ms;TopN:10;碰撞能量:25,30,35。三重四極桿質(zhì)譜參數(shù):離子源模式:ESI+;離子源參數(shù):毛細(xì)管電壓3.0 kV;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:800 L/h;鞘氣流量:150 L/h。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 牛血清白蛋白肽段的定性

    通過Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫找到BSA 的理論信息,蛋白質(zhì)對應(yīng)編號為P02769。利用ExPASy 網(wǎng)站中的Peptidemass 工具處理得到BSA 經(jīng)Tripsin酶切后的理論肽段。嬰幼兒配方乳粉經(jīng)前處理后,使用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行分析,通過Proteome Discoverer 2.1 軟件將Q Exactive 掃描結(jié)果與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載的序列信息進(jìn)行比對,對各理論肽段進(jìn)行定性分析。得到定性確認(rèn)的肽段共40 條,肽段YNGVFQECCQAEDK、VLASSAR、DAIPENLPPL TA DFAEDK、CCAADDK、VPQVSTPTLVEVSR 未能找到。表1中列出的是被定性的長度在2~20 個氨基酸殘基之間的肽段,圖1和圖2分別為肽段的高分辨質(zhì)譜圖以及PD 軟件定性分析圖譜。

    圖1 牛血清白蛋白特征肽段的高分辨質(zhì)譜圖Fig.1 Chromatogram of two peptides of bovine serum albumin by Q Exactive

    圖2 肽段LVNELTEFAK 的子離子信息圖Fig.2 The fragment ions of LVNELTEFAK by Q Exactive

    2.2 牛血清白蛋白特征肽段的篩選

    先使用文獻(xiàn)報道的肽段篩選原則對已定性的肽段做初步篩選[20-21]。篩選原則:1)N-端不是谷氨酰胺(Q),其在酸性條件下會環(huán)化形成焦谷氨酸鹽;2)無天冬酰胺或谷氨酰胺和甘氨酸的組合(即NG 和QG),其在中性和堿性條件下可發(fā)生脫酰胺基反應(yīng);3) 無天冬氨酸和脯氨酸或甘氨酸的組合(即DP 和DG),其在酸性條件下會水解;4)無連續(xù)的脯氨酸(P)和絲氨酸(S),會異構(gòu)化,降低肽純度;5)無翻譯后修飾(PTMs),如磷酸化、糖基化、乙?;?。舍去不符合要求的肽段,結(jié)果見表1。

    2.2.1 肽段特異性考察 使用NCBI 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中的Blast 工具,將肽段與數(shù)據(jù)庫內(nèi)已知蛋白進(jìn)行比對檢索,考察其特異性。以查到已知干擾數(shù)目為評價指標(biāo),選擇干擾數(shù)目少的特征肽段。

    2.2.2 肽段酶解曲線考察 在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中,驗(yàn)證蛋白質(zhì)的酶解效率至關(guān)重要,本文通過繪制酶解曲線,來證明酶解反應(yīng)在前處理所取反應(yīng)時間內(nèi)已達(dá)到平衡狀態(tài)。按前處理方法對嬰幼兒配方乳粉溶液做酶解處理,選取0.5,6,15,30,45,60,75,90,120,150,180,210,240,270,300,330,360 min,共17 個酶解時間點(diǎn),進(jìn)行二甲基化衍

    生;酶解360 min 的樣品溶液進(jìn)行同位素二甲基化衍生,作為內(nèi)標(biāo),將兩者按體積比1∶1 混合,按高分辨質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行Full MS 模式的數(shù)據(jù)采集。并采用內(nèi)標(biāo)法對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行定量處理,得到各時間點(diǎn)各肽段的相對濃度,繪制酶解曲線。發(fā)現(xiàn)大多肽段在2 h 內(nèi)酶解反應(yīng)能達(dá)到平衡,故選擇2 h為前處理酶解時間。酶解曲線可以被分為3 種類型(圖3):(1)在試驗(yàn)設(shè)定時間6 h 之內(nèi),酶解反應(yīng)能達(dá)到并處于平衡狀態(tài)(圖3a);(2)酶解反應(yīng)能達(dá)到平衡狀態(tài),然而隨時間延長,相對含量開始下降,不能保持平衡狀態(tài)(圖3b);(3)酶解反應(yīng)不能達(dá)到平衡狀態(tài)(圖3c)。其中,類型1 判定為Y,后2 個類型都判定為N,只有酶解能達(dá)到并保持平衡的肽段可用于定量。

    表1 牛血清白蛋白特征肽段的篩選Table 1 Peptide selection of all candidate peptides in bovine serum albumin

    2.2.3 肽段穩(wěn)定性與靈敏度考察 肽段穩(wěn)定性以嬰幼兒配方乳粉樣品溶液的6 次平行試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為考察指標(biāo),肽段靈敏度以平均質(zhì)譜響應(yīng)為考察指標(biāo)。質(zhì)譜響應(yīng)大于4.0×106為H,大于1.0×106小于4.0×106為M,小于1.0×106為L;RSD 小于6%為H,大于6%小于10%為M,大于10%為L。選擇響應(yīng)高,穩(wěn)定性好的特征肽段。具體結(jié)果列于表1中。

    由初步篩選以及高分辨質(zhì)譜各項考察結(jié)果表明,肽段LVNELTEFAK 和HLVDEPQNLIK 表現(xiàn)優(yōu)于其它肽段,故選擇這2 條肽段作為BSA 的定量特征肽段。

    2.3 內(nèi)標(biāo)的確定

    一般選用相應(yīng)特征肽段的同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)標(biāo),主要有化學(xué)合成法和同位素衍生法等。本研究采用一種簡單而成本較低的方法:同位素二甲基衍生化法,其利用肽段N 末端和賴氨酸側(cè)鏈中游離氨基與甲醛發(fā)生反應(yīng)進(jìn)行衍生(輕鏈),與同位素甲醛發(fā)生反應(yīng)得到穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的二甲基結(jié)構(gòu)(重鏈)。由于將酶解后的樣品分成2 份平行反應(yīng),保證了良好的平行及定量的準(zhǔn)確性。

    2.4 牛血清白蛋白定量方法的建立

    在三重四極桿質(zhì)譜上優(yōu)化肽段LVNELTE FAK 和HLVDEPQNLIK 的錐孔電壓及碰撞能量,確定BSA 特征肽段的以及內(nèi)標(biāo)肽段質(zhì)譜MRM 參數(shù),列于表2。

    圖3 3 種BSA 酶解曲線類型Fig.3 Three kind of enzymatic curve of bovine serum albumin

    2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

    2.5.1 方法特異性 為了驗(yàn)證所選肽段LVNEL TEFAK、HLVDEPQNLIK 是BSA 的特異肽段,牛乳樣品中其它乳蛋白的酶解產(chǎn)物不會對其產(chǎn)生干擾。將牛乳中存在的牛乳蛋白質(zhì):β-酪蛋白、α-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛免疫球蛋白、乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別按前處理步驟進(jìn)行處理,進(jìn)樣分析,評估各種蛋白對所選肽段的干擾情況。由圖4可知,在BSA 標(biāo)準(zhǔn)品酶解后肽段LVNELTEFAK 出峰處無干擾,由此證明肽段和所建方法滿足特異性要求。

    表2 特征肽段和內(nèi)標(biāo)肽段的MRM 參數(shù)Table 2 The parameters of the signature peptide and the isotopic internal standard peptide

    圖4 肽段LVNELTEFAK、HLVDEPQNLIK 的特異性圖Fig.4 Specificity of peptide LVNELTEFAK,HLVDEPQNLIK

    2.5.2 線性 分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為1,5,10,50,100,150,200 μg/mL 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL至2 mL 塑料離心管中,按前處理步驟進(jìn)行酶解與二甲基化衍生,將質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行同位素二甲基衍生,作為定量時的內(nèi)標(biāo)。移取相同體積的二甲基標(biāo)記溶液與內(nèi)標(biāo)混合,制得標(biāo)曲溶液。如表3所示,2 條特征肽段的線性良好(R2≥0.999)。

    2.5.3 檢出限與定量限 將前處理得到的待測液稀釋成一系列濃度梯度樣品,進(jìn)樣分析,以信噪比為3∶1 和10∶1 分別為方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ),肽段LVNELTEFAK 和HLVDEPQNLIK 檢出限分別為0.85 mg/100 g 和0.98 mg/100 g,定量限分別為2.83 mg/100 g 和3.26 mg/100 g。由此得到各特征肽段定量方法的檢出限與定量限可滿足乳清粉與嬰幼兒配方奶粉中BSA 的定量檢測的要求。

    2.5.4 回收率與精密度 做3 d 3 水平6 平行試驗(yàn),評價方法的回收率與精密度。取樣品進(jìn)行低、中、高3 水平加標(biāo)處理,重復(fù)試驗(yàn)3 d。在3 個水平加標(biāo)下,各特征肽段的回收率在87.9%~101.1%之間,日內(nèi)精密度小于5.7%,日間精密度小于7.6%,滿足乳清粉與嬰幼兒配方奶粉中BSA 的定量檢測要求,具體結(jié)果見表3、表4。

    表3 牛血清白蛋白各定量特征肽段的方法學(xué)驗(yàn)證(嬰幼兒配方乳粉)Table 3 Methodological validation of quantitative signature peptides of bovine serum albumin(infant formula)

    表4 牛血清白蛋白各定量特征肽段的方法學(xué)驗(yàn)證(乳清粉)Table 4 Methodological validation of quantitative signature peptides of bovine serum albumin(whey powder)

    2.5.5 方法實(shí)際應(yīng)用 為了評價定量方法的適用性,從當(dāng)?shù)爻匈徺I6 份不同品牌的嬰幼兒配方奶粉樣品,同時從生產(chǎn)商處收集6 份乳清粉(WPC35、WPC80、D90 各2 份)。使用建立的定量方法進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果見表5,樣品的質(zhì)譜圖見圖5。由結(jié)果可以看出,同種乳制品間,測得的BSA 含量相近,且2 條肽段測得的BSA 含量不存在顯著性差異。由于目前未查到乳制品(嬰幼兒配方乳粉和乳清粉)中BSA 準(zhǔn)確定量方法,故未進(jìn)行方法間的比對。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)通過Proteome Discoverer 2.1 軟件將高分辨質(zhì)譜掃描得到的BSA 肽段信息與Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查到的肽段理論數(shù)據(jù)進(jìn)行定性比對,再根據(jù)文獻(xiàn)[20],[21]中查到的肽段篩選策略進(jìn)行肽段的初步篩選,后對待選肽段進(jìn)行特異性、酶解曲線、靈敏度和穩(wěn)定性考察,篩選出符合要求的2 條定量特征肽段:LVNELTEFAK、HLVDEPQN LIK。并且通過同位素二甲基化衍生得到可提供質(zhì)譜準(zhǔn)確定量的同位素內(nèi)標(biāo),在三重四極桿質(zhì)譜上建立BSA 的MRM 定量方法。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明:方法具有良好的特異性,可排除樣品中其它蛋白質(zhì)的干擾;在線性范圍1~200 μg/mL 內(nèi),具有良好的線性(R2>0.999);在嬰幼兒配方乳粉和乳清中的檢出限分別為0.85 mg/100g 和0.98 mg/100 g;各特征肽段的回收率在87.9%~101.1%之間,日內(nèi)精密度小于5.7%,日間精密度小于7.6%。本方法相比于熒光光譜法具有靈敏度高,特異性強(qiáng),定量結(jié)果準(zhǔn)確,檢測限低等優(yōu)點(diǎn);與免疫學(xué)方法相比,本方法在肽段選擇過程中,考慮到了加工過程中可能發(fā)生的修飾,定量更加準(zhǔn)確。本方法為乳制品中BSA 的定量檢測提供了有效手段。

    圖5 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品中BSA 定量特征肽段的質(zhì)譜離子流圖Fig.5 Chromatogram of quantitative signature peptide of bovine serum albumin in standards and samples

    表5 實(shí)際樣品檢測結(jié)果Table 5 Analysis results of samples

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