植物乳桿菌P-8發(fā)酵乳的代謝物圖譜

王越男，米智慧，李常坤，潘 琳，孫志宏，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018）

發(fā)酵乳是由幾百種生物分子組成的一個(gè)復(fù)雜的食品體系，主要包括蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物和許多其它小分子化合物，如氨基酸、有機(jī)酸、核酸、脂肪酸、礦物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)。然而，目前采用單一的分析平臺(tái)無(wú)法全部測(cè)定出發(fā)酵乳中所有的代謝物，代謝組學(xué)技術(shù)則能夠高通量鑒定和定量代謝過(guò)程中代謝物質(zhì)的變化，測(cè)定出分子質(zhì)量低于1 000 u 的代謝物，且被廣泛應(yīng)用于藥物科學(xué)、食品科學(xué)和營(yíng)養(yǎng)科學(xué)等領(lǐng)域[1-2]。目前代謝組學(xué)方法的分析技術(shù)主要有高分辨率質(zhì)子核磁共振（NMR）譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)[3-4]。Pastink 等[5]利用代謝組學(xué)的方法研究了嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）、乳酸乳球菌（L.lactis）和植物乳桿菌（L.plantarum）的代謝圖譜，結(jié)果表明嗜熱鏈球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中需要2 種氨基酸（半胱氨酸和組氨酸），而乳酸乳球菌和植物乳桿菌在其生長(zhǎng)過(guò)程中分別需要6 種和11 種氨基酸。Bok 等[6]采用GC-MS 技術(shù)分析不同混合發(fā)酵劑酸乳樣品的芳香物質(zhì)代謝圖譜，研究發(fā)現(xiàn)很多來(lái)源于關(guān)鍵風(fēng)味的質(zhì)量峰在單個(gè)菌株或其制品中沒(méi)有，而在混合菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中濃度較高，這種方法可以用來(lái)鑒定不同的風(fēng)味物質(zhì)是否來(lái)自不同的菌株或混合菌株，并作為其特有菌株的潛在生物標(biāo)記物。

益生菌植物乳桿菌P-8（Lactobacillus plantarum P-8，簡(jiǎn)稱L.plantarum P-8）是2005年由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭的自然發(fā)酵酸牛乳，具有調(diào)節(jié)血脂，抗氧化等益生作用[7-9]。2009年，采用鳥(niǎo)槍法對(duì)植物乳桿菌P-8 進(jìn)行了全基因組序列和功能基因分析（CP005942），其基因組是由一條染色體和6 個(gè)質(zhì)粒（LBPp1，LBPp2，LBPp3，LBPp4，LBPp5 和LBPp6）構(gòu)成，染色體長(zhǎng)度為3 033 693 bp，10 個(gè)涉及細(xì)菌素產(chǎn)生的基因簇，包括細(xì)菌素肽和其同源免疫蛋白等基因[10]。本試驗(yàn)采用超高效液相色譜和四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry，UPLC Q-Tof-MS） 結(jié)合多變量分析的方法，分析植物乳桿菌P-8 發(fā)酵乳的代謝圖譜，找出其主要差異代謝物，探究其潛在的生物標(biāo)記物，為植物乳桿菌P-8 在功能性發(fā)酵乳的研發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌P-8 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11（含嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種），德國(guó)科漢森公司；脫脂乳粉，新西蘭恒天然有限公司。

乳酸菌細(xì)菌培養(yǎng)基MRS（Man rogosa sharpe broth）、TPY 液體和固體培養(yǎng)基（Trypticase peptone yeast broth），上海雅吉生物科技有限公司。

乙腈、甲酸（質(zhì)譜級(jí)），美國(guó)Fisher Scientific公司；氫氧化銨、亮氨酸腦啡肽（3 mg），美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Acquity UPLC Xevo Q-TOF，配備有在線脫氣系統(tǒng)、二元梯度高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和PDA 檢測(cè)器），美國(guó)Waters 公司；Eppendorf 真空濃縮儀、Eppendorf 5810 R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；Milli-Q 超純水儀，美國(guó)Millipore 公司；雷磁PHS-3C pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備 還原牛乳（脫脂乳粉11%）經(jīng)95 ℃，5 min 巴氏殺菌后，冷卻至37 ℃，分別加入植物乳桿菌P-8 及植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配菌株，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，其中植物乳桿菌P-8 接種量和商業(yè)發(fā)酵劑添加量分別為1.0×107CFU/mL，0.003%，發(fā)酵至pH 4.5 終止。并將上述發(fā)酵乳放置-80 ℃，備用。植物乳桿菌P-8單菌發(fā)酵乳（簡(jiǎn)稱單菌發(fā)酵乳）、植物乳桿菌P-8與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳（簡(jiǎn)稱復(fù)配發(fā)酵乳）。

1.3.2 發(fā)酵乳的發(fā)酵特性

1.3.2.1 pH 值和滴定酸度的測(cè)定 將發(fā)酵乳樣品置于室溫20 ℃平衡一定時(shí)間后，采用pH 計(jì)每間隔1 h 測(cè)定1 次，直至發(fā)酵終點(diǎn)（pH 4.5）。同時(shí)取發(fā)酵乳樣品9 g，加入10 mL 蒸餾水，混勻，以酚酞作指示劑，采用0.1 mol/L NaOH 滴定，每隔1 h測(cè)定1 次。

1.3.2.2 活菌數(shù)的測(cè)定 發(fā)酵乳的活菌數(shù)測(cè)定采用MRS 瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法，42 ℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定菌落總數(shù)。益生菌植物乳桿菌P-8 采用MRS-V（萬(wàn)古霉素10 mg/L）固體培養(yǎng)基37 ℃需氧培養(yǎng)48 h 進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)[11-12]。

1.3.3 UPLC-Q-TOF MS 代謝組學(xué)分析

1.3.3.1 發(fā)酵乳樣品的預(yù)處理 將-80 ℃的發(fā)酵乳樣品置于室溫下解凍，解凍后經(jīng)4 500×g 離心10 min，取上清液2 mL，加入乙腈溶液14 mL，漩渦振蕩2 min，超聲提取5 min 后12 000×g 高速離心15 min，取上清液濃縮干燥，加入500 μL 40%（體積分?jǐn)?shù)）的乙腈溶液復(fù)溶。經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后置于進(jìn)樣瓶中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 UPLC-Q-TOF MS 分析 使用ACQUITY UPLC-Q-TOF MS（Waters，USA）對(duì)所制備的發(fā)酵乳樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析，采用ESI 源正、負(fù)離子模式掃描（ESI+/ESI-）。采用反相系統(tǒng)對(duì)預(yù)處理好的樣品進(jìn)行分離，色譜柱采用亞乙基橋雜化顆粒BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱進(jìn)行分離，樣品進(jìn)樣量為10 μL，流速0.45 mL/min，柱箱溫度35 ℃。正離子掃描模式下，流動(dòng)相A 為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸乙腈溶液，負(fù)離子掃描模式下，流動(dòng)相A 為0.1%氨水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈溶液，梯度洗脫程序按照正離子模式進(jìn)行洗脫。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 正、負(fù)離子模式下發(fā)酵乳UPLC-Q-TOF MS流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 UPLC-Q-TOF MS mobile phase gradient program for the analysis of fermented milk in positive，negative ion mode

Q-TOF 質(zhì)譜儀采用ESI+和ESI-掃描模式，參數(shù)設(shè)置如下：毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流量600 L/h，錐孔氣流量50 L/h。質(zhì)核比掃描范圍m/z 50～1 000，為確保儀器的準(zhǔn)確性，采用質(zhì)量濃度為2 ng/mL 亮氨酸腦啡肽（m/z=556.2771 [M+H]+，m/z=554.2615 [M-H]-）作為質(zhì)量校正液，流速5 μL/min，Q-TOF MS 數(shù)據(jù)采集模式為Centroid。

1.4 數(shù)據(jù)處理

UPLC Q-Tof MS 獲得的原始數(shù)據(jù)使用Mass-Lynx 與Progenesis QI 軟件進(jìn)行色譜峰提取，輸出矩陣數(shù)據(jù)集（保留時(shí)間-質(zhì)核比，樣品信息和歸一化的離子強(qiáng)度）。將此數(shù)據(jù)輸入Ezinfo 軟件（Waters，USA）進(jìn)行中心化和Pareto 縮放，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。此外，為了驗(yàn)證多元統(tǒng)計(jì)分析篩選出的變量是否不同，還利用了Progenesis QI 與Metaboanalyst 軟件進(jìn)行了差異性檢驗(yàn)（t 檢驗(yàn)）與差異倍數(shù)檢驗(yàn)（Fold Change）與變量投影重要性指標(biāo)（VIP≥1）以確定單菌發(fā)酵乳和復(fù)配發(fā)酵乳間顯著差異代謝物。

1.5 代謝物的鑒定

篩選出的顯著性代謝差異物根據(jù)其質(zhì)荷比、保留時(shí)間（Retention time） 和二級(jí)碎片信息通過(guò)Progenesis QI 軟件在HMDB（http：//www.hmdb.ca/），ECMDB（http：//ecmdb.ca/），YMDB（http：//www.ymdb.ca/） 與KEGG（http：//www.kegg.jp/），Chemspider（http：//www.chemspider.com/）等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，確定其結(jié)構(gòu)，其中理論質(zhì)量數(shù)與實(shí)際測(cè)得的質(zhì)量數(shù)的質(zhì)量誤差閾值設(shè)置為10 ppm。篩選得到的差異代謝物進(jìn)一步做碎片信息比對(duì)以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳發(fā)酵特性分析

2.1.1 植物乳桿菌P-8 發(fā)酵乳酸度分析 植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳、植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳在發(fā)酵過(guò)程中pH 值和滴定酸度（Titratable acidity，TA）的變化見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳酸度的變化Fig.1 Changes in acidity of fermented milk with L.plantarum P-8

圖2 植物乳桿菌P-8 復(fù)配發(fā)酵乳酸度的變化Fig.2 Changes in acidity of the co-fermentation milk with L.plantarum P-8

由圖1可知，植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳在發(fā)酵5 h 時(shí)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，而植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳發(fā)酵13 h 可達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)（pH 4.5）。由圖2可知，植物乳桿菌P-8與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳T(mén)A 隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)與發(fā)酵初期相比顯著升高（P＜0.05），其中復(fù)配發(fā)酵乳的TA 增加速度顯著高于（P＜0.05） 植物乳桿菌P-8單菌發(fā)酵乳。植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵初期，由于牛乳中游離氨基酸和肽類物質(zhì)等游離氮源的含量不足以促進(jìn)植物乳桿菌P-8 的生長(zhǎng)，因此使發(fā)酵體系的pH 值在0～9 h 內(nèi)變化不明顯；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生了一定量的乳酸、甲酸等有機(jī)酸，使發(fā)酵乳的pH 值下降；在復(fù)配發(fā)酵乳中，嗜熱鏈球菌可以利用原料乳中和德氏乳桿菌保加利亞亞種發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的游離氨基酸和寡肽，增殖速度較快。同時(shí)，乳酸等有機(jī)酸也較單菌發(fā)酵生成速度快，以致體系的pH 值在發(fā)酵過(guò)程中迅速下降，發(fā)酵5 h 即可達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。因此，植物乳桿菌P-8 在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)與其它發(fā)酵劑復(fù)配使用，可提高發(fā)酵乳的品質(zhì)。

2.1.2 發(fā)酵乳活菌數(shù)分析 植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳、植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11復(fù)配發(fā)酵乳在發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化見(jiàn)圖3。

圖3 植物乳桿菌P-8 發(fā)酵乳活菌數(shù)的變化Fig.3 Changes in the bacterial viable counts of L.plantarum P-8 fermented milk

植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳中植物乳桿菌P-8 活菌數(shù)增長(zhǎng)不顯著（P＞0.05）；植物乳桿菌P-8與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳的活菌數(shù)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)活菌數(shù)顯著升高（P＜0.05），其中復(fù)配發(fā)酵乳活菌數(shù)增殖速度較快，發(fā)酵至終點(diǎn)時(shí)其活菌數(shù)分別為9.11×108CFU/mL，而植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳的發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)達(dá)13 h，其發(fā)酵終點(diǎn)的活菌數(shù)為7.48×108CFU/mL，在其發(fā)酵時(shí)間為5 h 時(shí)，其活菌數(shù)為3.62×107CFU/mL，遠(yuǎn)低于復(fù)配發(fā)酵乳（P＜0.05）。根據(jù)植物乳桿菌P-8 的全基因組信息，植物乳桿菌P-8 具有蛋白水解和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，而發(fā)酵初期蛋白水解能力較弱，游離氮源的含量較少，可能由于植物乳桿菌P-8 單獨(dú)發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸產(chǎn)生的數(shù)量較少，在發(fā)酵過(guò)程中植物乳桿菌P-8 應(yīng)與其它發(fā)酵劑復(fù)配發(fā)酵有利于共同生長(zhǎng)。

2.2 發(fā)酵乳代謝物圖譜分析

2.2.1 發(fā)酵乳UPLC-Q-TOF 色譜圖分析 本研究采用了UPLC-Q-TOF MS 代謝組學(xué)技術(shù)研究不同發(fā)酵乳達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)代謝物變化。圖4、5 分別顯示植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳、植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳在相同色譜和質(zhì)譜ESI+和ESI-條件掃描模式下的基峰圖（Base peak intensity chromatograms，BPI chromato-grams）。

從圖4、圖5可知，在相同色譜條件下，植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳和植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳圖譜之間存在較大差異，各樣品間色譜峰的數(shù)量和色譜峰離子強(qiáng)度存在一定差異。

圖4 植物乳桿菌P-8 發(fā)酵乳BPI 圖（正離子模式）Fig.4 BPI of L.plantarum P-8 fermented milk（positive ion mode）

圖5 植物乳桿菌P-8 發(fā)酵乳BPI 圖（負(fù)離子模式）Fig.5 BPI of L.plantarum P-8 fermented milk（negative ion mode）

2.2.2 發(fā)酵乳的主成分分析結(jié)果 將植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳和植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳樣品數(shù)據(jù)錄入MassLynx 軟件（V4.1，Waters USA）進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 正、負(fù)離子模式下復(fù)配發(fā)酵乳與單菌發(fā)酵乳的PCA 得分圖Fig.6 The PCA score plots of mixed fermented milk and L.plantarum P-8 fermented milk in positive and negative ion patterns

由PCA 得分圖可見(jiàn)，復(fù)配發(fā)酵乳與單菌發(fā)酵乳有一定重合現(xiàn)象，正離子模式下主成分1 和主成分2 的大小分別為31.7%和20.2%；負(fù)離子模式下主成分1 和主成分2 的大小分別為46.9%和22.3%?；趶?fù)配發(fā)酵乳和單菌發(fā)酵乳代謝物的PCA 分析，證明二者的差異較小。

2.2.3 發(fā)酵乳的代謝差異物鑒定和分析 本研究應(yīng)用MassLynx 軟件（V4.1，Waters USA）進(jìn)行代謝物鑒定。在正離子和負(fù)離子模式下分別檢測(cè)到6 415 個(gè)和379 個(gè)代謝物，根據(jù)VIP 值≥1，差異倍數(shù)≥2 和P＜0.05 的篩選原則，共鑒定得到62 個(gè)差異代謝物（正離子46 個(gè)和負(fù)離子16 個(gè)）。隨后，通過(guò)相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳和植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳2 組樣品中的差異代謝物主要為有機(jī)酸（7種）、多肽（4 種）、游離氨基酸（4 種）、核酸代謝物（4 種）和芳香類物質(zhì)（3 種）等。

與植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳相比，植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳中有7 種有機(jī)酸顯著變化，順烏頭酸、2-酮丁酸、2，5-二羥苯乙酸、月桂酸、肉豆蔻酸和犬尿氨酸在復(fù)配發(fā)酵乳中含量顯著高于單菌發(fā)酵乳；而在單菌發(fā)酵乳中戊二酸和N-甲酰犬尿氨酸含量顯著（P＜0.05）高于復(fù)配發(fā)酵乳。

表2 復(fù)配發(fā)酵乳與單菌發(fā)酵乳的差異代謝物Table 2 Differential abundant markers of mixed fermented milk and L.plantarum P-8 fermented milk

（續(xù)表2）

亮氨酸、酪氨酸和L-蛋氨酸在復(fù)配發(fā)酵乳中含量顯著高于單菌發(fā)酵乳；而L-半胱氨酸則在單菌發(fā)酵乳中含量顯著高于復(fù)配發(fā)酵乳。在風(fēng)味物質(zhì)方面，復(fù)配發(fā)酵乳和單菌發(fā)酵乳的差異代謝物有3 種芳香類物質(zhì)，即山梨糖醇、月桂酸和肉豆蔻酸。復(fù)配發(fā)酵乳中月桂酸和豆蔻酸顯著高于單菌發(fā)酵乳，而復(fù)配發(fā)酵乳中的山梨醇含量顯著低于單菌發(fā)酵乳中的含量，這3 種物質(zhì)可能對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味都有一定的貢獻(xiàn)作用。

活性多肽方面，復(fù)配發(fā)酵乳中4 種多肽Ala-Ile，Asn-Ser，Pro-Asn，Val-Asn 均比單菌發(fā)酵乳中顯著增多（P＜0.05）。此外，復(fù)配發(fā)酵乳比單菌發(fā)酵乳多了一種重要代謝物——多巴胺，它是一種能調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，參與對(duì)人的情緒、情感發(fā)揮正相的刺激作用，并對(duì)神經(jīng)退行性疾病有一定的治療作用[13]。與脫脂乳相比，復(fù)配發(fā)酵乳和單菌發(fā)酵乳中均發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸的水平顯著增加，由此說(shuō)明γ-氨基丁酸是植物乳桿菌P-8 發(fā)酵產(chǎn)生的一類活性物質(zhì)，γ-氨基丁酸（GABA）是很多發(fā)酵食品中的重要功能成分之一，綜上可知，復(fù)配發(fā)酵乳在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生多種降糖和降血壓的代謝物，以及情緒調(diào)節(jié)物質(zhì)多巴胺，并能產(chǎn)生多種提升發(fā)酵乳風(fēng)味的化合物。

3 討論

近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)已可以精確鑒定復(fù)雜生物體系中的氨基酸、碳水化合物、有機(jī)酸、維生素、肽、核酸等代謝物，且在乳酸菌代謝途徑研究，代謝工程、發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化，乳酸菌和疾病的關(guān)系等研究方面，取得了新的突破和進(jìn)展。當(dāng)前，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于藥物毒性和機(jī)理研究，微生物和植物研究，疾病診斷和動(dòng)物模型，食品及營(yíng)養(yǎng)學(xué)及基因功能的闡明等領(lǐng)域[3，14]。

3.1 氨基酸

在正離子和負(fù)離子模式下，植物乳桿菌P-8與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳和植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳2 組樣品中，顯著差異的氨基酸有亮氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等。

商業(yè)發(fā)酵劑是由蛋白水解能力較弱的嗜熱鏈球菌和蛋白水解能力較強(qiáng)的德氏乳桿菌保加利亞亞種組成，在發(fā)酵初期，牛乳的原始pH 值最適合嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)，利用牛奶中游離氨基酸和短肽維持其生長(zhǎng)，嗜熱鏈球菌利用蛋白水解能力較強(qiáng)的德氏乳桿菌保加利亞亞種分解酪蛋白，并產(chǎn)生氨基酸和短肽以滿足其生長(zhǎng)需求。而植物乳桿菌P-8 作為一株具有益生功效的乳酸菌，且具有獨(dú)特的蛋白水解能力和代謝通路。植物乳桿菌P-8 通過(guò)細(xì)胞膜改變，PTS 系統(tǒng)激活，氨基酸的積累和利用，碳水化合物的代謝增加（通過(guò)糖酵解、檸檬酸循環(huán)和丙酮酸代謝）等因素存活[14]。Khalid等[15]通過(guò)SDS-PAGE 的方法測(cè)定植物乳桿菌水解牛乳蛋白，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌主要降解牛乳中的β-酪蛋白，產(chǎn)生游離氨基酸和短肽。在本研究中，采用代謝組學(xué)技術(shù)所鑒定的亮氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等氨基酸與其它發(fā)酵乳制品代謝產(chǎn)物的鑒定結(jié)果一致[16-18]。Pan 等[19]采用代謝組學(xué)的分析方法研究了布里亞特傳統(tǒng)乳制品和商業(yè)乳制品的代謝產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的主要差異代謝物為短肽和氨基酸。

3.2 肽類

牛乳通過(guò)乳酸菌的作用間接影響各種代謝物，主要為氨基酸、肽類、有機(jī)酸和芳香物質(zhì)等，在本試驗(yàn)中植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11復(fù)配發(fā)酵乳和植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳2 組樣品中顯著差異的肽為Ala-Ile，Asn-Ser，Pro-Asn和Val-Asn，這些代謝物對(duì)發(fā)酵乳的功能及風(fēng)味影響較大。其中Ala-Ile 是已報(bào)道的ACE 抑制活性多肽[20-21]，Pro-Asn 和Val-Asn 屬于已報(bào)道的具有降糖活性物質(zhì)[22]，具有在人體內(nèi)拮抗2 型糖尿病的潛力。嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌共同發(fā)酵可提高發(fā)酵乳的功能及益生特性，主要在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)相互作用產(chǎn)生具有一定功能的短肽和人體必需氨基酸[23]。Ochi 等[17]利用UPLC-QTOF-MS分析發(fā)酵期間代謝物的變化，共鑒定出氨基酸、短肽、核酸、尿素循環(huán)的中間產(chǎn)物和有機(jī)酸等22 種代謝物，這些代謝物都與其感官性質(zhì)有密切相關(guān)，可以作為其潛在的生物標(biāo)記物，為生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量、品質(zhì)的監(jiān)控提供一定依據(jù)。有研究報(bào)道，通過(guò)GC-MS 和LC-MS 兩種代謝組學(xué)的方法，對(duì)10 種乳制品進(jìn)行鑒定，共鑒定出223 個(gè)代謝物，主要是氨基酸、脂類、有機(jī)酸，短鏈脂肪酸、核酸、維生素和短肽等代謝物[24]。

3.3 有機(jī)酸

植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳和植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳2 組樣品中顯著差異的有機(jī)酸主要有順烏頭酸、2-酮丁酸、2,5-二羥苯乙酸、月桂酸、豆蔻酸和戊二酸等。這主要與發(fā)酵劑的糖酵解、檸檬酸循環(huán)和丙酮酸代謝等因素有關(guān)，此結(jié)論與先前的研究報(bào)道一致[15，17，20，24]。

3.4 其它代謝物

發(fā)酵乳的特有風(fēng)味越來(lái)越受人們的青睞。在發(fā)酵乳的代謝物中，有機(jī)酸和醇類對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味和生物活性等功能呈非常重要的作用，山梨醇、月桂酸和豆蔻酸等物質(zhì)在本研究中顯著增加，吲哚丙酮酸、2-酮丁酸和2,5-二羥苯乙酸等物質(zhì)對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味影響較大，這與以前的研究報(bào)道一致[19，25-26]。γ-氨基丁酸（GABA）是很多發(fā)酵食品中的重要功能成分之一，復(fù)配發(fā)酵乳和單菌發(fā)酵乳中γ-氨基丁酸水平均顯著增加，Hagi 等[26]利用代謝組學(xué)的方法分析發(fā)酵乳制品的代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組牛乳相比，在發(fā)酵乳制品中γ-氨基丁酸（GABA）的含量顯著增加（1 216 倍），且富含GABA 的發(fā)酵乳中ACE 抑制肽的含量較高。Boucher 等[27]采用UPLC-MS 和GC-MS 代謝組學(xué)的分析技術(shù)研究干酪的代謝圖譜，共鑒定出45 個(gè)代謝物，其中包括12 種氨基酸、25 種芳香物質(zhì)、4種維生素、尿酸、肌酸和肉毒堿。可見(jiàn)代謝組學(xué)作為一種解決復(fù)雜機(jī)制中差異分析的技術(shù)方法在食品領(lǐng)域受到越來(lái)越多研究者的青睞。

4 結(jié)論

本研究采用UPLC-Q-TOF MS 代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)的分析方法對(duì)植物乳桿菌P-8 單菌發(fā)酵乳、植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11復(fù)配發(fā)酵乳進(jìn)行代謝圖譜分析。結(jié)果表明，植物乳桿菌P-8 與商業(yè)發(fā)酵劑YC-X11 復(fù)配發(fā)酵乳在發(fā)酵5 h 時(shí)即可達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。利用代謝組學(xué)方法能夠?qū)Πl(fā)酵乳的差異代謝物進(jìn)行鑒定和分析，并作為潛在的生物標(biāo)記物，代謝組學(xué)是理想的區(qū)分和鑒定發(fā)酵乳中代謝物的高通量分析技術(shù)。