基于譜效關(guān)系的辣木葉降糖活性物質(zhì)研究

包伊凡，沈新春，韓欣然，張 羽，汪 芳

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京210023）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是一種以高血糖為特征的慢性代謝疾病。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF） 最新數(shù)據(jù)顯示，2019年全球約有4.63 億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2045年，將增加到7 億[1]。糖尿病患者血糖水平不受控制的增加，可能導(dǎo)致心血管并發(fā)癥、神經(jīng)病變、腎衰竭，甚至增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病有2 種類型：I 型糖尿?。═1DM）是胰島β 細(xì)胞自身免疫性破壞的結(jié)果，僅占所有病例的5%；II 型糖尿?。═2DM）是最常見的疾病形式，占所有病例的90%以上。糖尿病發(fā)病機(jī)制主要是胰島素抵抗和胰島細(xì)胞功能障礙，而胰島素抵抗是導(dǎo)致II 型糖尿?。═2DM）的主要原因。

辣木（Moringa oleifera Lam）是一種生長迅速的熱帶樹種，為辣木科辣木屬植物，被稱為“雞腿樹”或“辣根樹”，在全世界的熱帶和亞熱帶地區(qū)都有種植，在印度自古以來，它的不同部位就被用來當(dāng)作食物和藥物。辣木的花、根、葉和樹皮可作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑，并且其中的生物活性成分廣泛應(yīng)用于食品添加劑、護(hù)膚品、香水等領(lǐng)域[2-8]。辣木葉于2012年11月被我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)成為新資源食品[9]。辣木葉中含有維生素、多酚、黃酮、酚酸、生物堿、芥子油苷、異硫氰酸酯、丹寧酸、皂苷等[10]，具有降血糖，抗氧化，抗炎，保肝，抗腫瘤等作用[11-13]。大量研究表明，辣木葉中所含有的多糖、黃酮類物質(zhì)、水溶性蛋白等物質(zhì)具有抗氧化，降血脂，降血糖等活性，極具開發(fā)利用價(jià)值。研究表明，辣木葉具有預(yù)防II 型糖尿病的作用[14]，且能有效緩解胰島素抵抗[15]。在Ndong 等[16]的研究中，用GK 大鼠作為糖尿病模型，通過口服200 mg/kg 辣木葉粉，發(fā)現(xiàn)其能夠改善糖尿病大鼠的血糖。Kumari[17]研究發(fā)現(xiàn)40 d 內(nèi)每天服用辣木葉粉，能夠顯著降低30～60 歲的II 型糖尿病患者的空腹血糖水平（FBG）和餐后血糖水平（PPPG）。

指紋圖譜技術(shù)是定性、定量區(qū)分和評價(jià)藥材中各種化學(xué)成分含量差異的有效方法。隨著分析技術(shù)的進(jìn)步，指紋圖譜技術(shù)越來越成熟，已得到國際認(rèn)可[18]。譜效學(xué)是結(jié)合基礎(chǔ)生物活性研究成果，通過生物信息學(xué)方法，得到“譜-效”關(guān)系，用于預(yù)測活性物質(zhì)的方法[19]。

辣木葉中含有多種化學(xué)成分[20]，其提取物具有顯著的降糖作用[14，21-24]，然而其活性物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確?；诖耍狙芯拷R-HepG2 胰島素抵抗模型，評價(jià)正交試驗(yàn)得到的辣木葉提取物的降糖活性，采用譜效相關(guān)性分析法初步探討辣木葉中具有降糖活性的化學(xué)成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉，云南省昆明市；胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基（低糖/高糖）、青霉素-鏈霉素混合液（Penicillin-Streptomycin）、胰蛋白酶-EDTA（Trypsin EDTA，0.05%）、PBS 緩沖液，美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）、MTT，美國Sigma 公司；重組人胰島素細(xì)胞培養(yǎng)級，源葉生物；甲醇（色譜級），德國Meker 公司；葡萄糖測定試劑盒，上海榮盛生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M2e 多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices 公司；SL-N 系列電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；WH-2 微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司；PHS-3C pH 計(jì)，上海雷磁分析儀器有限公司；84-1A 磁力攪拌器，上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；生物安全柜，美國Thermo Fisher 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣木葉提取物的制備 取辣木葉約20 g，按表1回流提取2 次，減壓濃縮，用蒸餾水定容至400 mL，得質(zhì)量濃度50 mg/mL 的辣木葉提取物。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Design for factors and levels of L9（34） orthogonal test

1.3.2 不同方法的辣木葉提取物指紋圖譜測定

1.3.2.1 供試品溶液和對照品溶液的制備 分別取1.3.1 中9 組辣木葉提取物，加超純水稀釋成5 g/mL 的溶液，過0.45 μm 濾膜，即得供試品溶液。稱取芹菜素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡糖苷、山柰酚二乙酰-鼠李糖苷、山柰酚標(biāo)準(zhǔn)品適量分別溶于甲醇中，過0.45 μm 濾膜，即得對照品溶液。

1.3.2.2 指紋圖譜測定 色譜柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）C18柱，以0.1%乙酸水為流動相A，以甲醇為流動相B，梯度洗脫：0～40 min，10%～40%B；40～50 min，40%～60%B，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長254 nm。

1.3.3 IR-HepG2 模型的建立

1.3.3.1 HepG2 細(xì)胞的培養(yǎng)[25]用DMEM 高糖培養(yǎng)基配制好含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的培養(yǎng)液。用配制好的培養(yǎng)液在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞，每天觀察，待細(xì)胞貼壁并長至80%進(jìn)行細(xì)胞傳代，即培養(yǎng)2 d 就可進(jìn)行傳代，傳代后繼續(xù)培養(yǎng)觀察，待細(xì)胞以對數(shù)成倍增長至80%時(shí)用于試驗(yàn)。

1.3.3.2 胰島素對細(xì)胞活力的影響測定（MTT 法）通過MTT 法篩選對HepG2 細(xì)胞活性影響較小的胰島素濃度。取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔10 000 個(gè)的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，每孔體積為100 μL。將細(xì)胞置于37℃，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，更換用新鮮培養(yǎng)液配制的不同濃度梯度的胰島素，分別為10-9，10-8，10-7，5×10-7，10-6，5×10-6，10-5，5×10-5，10-4mol/L，100 μL/孔，并設(shè)立對照組，每個(gè)濃度取6 個(gè)平行。搖勻后在5%CO2、37 ℃條件下分別孵育12，24，36 h；孵育過后，每孔加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液，繼續(xù)孵育3～4 h 后，棄上清液，每孔加入100 μL 的DMSO 溶出紫色晶體，振蕩15 min，用酶標(biāo)儀測定波長570 nm 處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，見式（1）。

1.3.3.3 IR-HepG2 細(xì)胞模型的建立 觀察細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%處于對數(shù)生長期時(shí)，以每孔10 000 個(gè)的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，每孔的體積為100 μL，在5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，更換為含10-9，10-8，10-7，5×10-7，10-6，5×10-6，10-5，5×10-5，10-4mol/L 不同濃度的胰島素全培液和對照全培液100 μL/孔，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)平行，5%CO2，37 ℃條件下分別孵育12，24，36 h 后，采用葡萄糖氧化酶法測定各孔葡萄糖的消耗量，計(jì)算葡萄糖的消耗量，見式（2）。

1.3.4 辣木葉提取物及二甲雙胍對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

1.3.4.1 辣木葉提取物及二甲雙胍對HepG2 細(xì)胞活性的影響 通過MTT 法測定0.2，1，5 μg/mL 的辣木葉提取物及二級雙胍對于HepG2 細(xì)胞活性的影響，方法同1.3.3.2。

1.3.4.2 辣木葉提取物及二甲雙胍對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 取處于對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，以每孔10 000 個(gè)的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，每孔體積為100 μL，于5%CO2，37 ℃培養(yǎng)24 h。將HepG2 細(xì)胞分組：正常組、模型組、樣品組分別為5，10，20 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)平行。在5%CO2，37 ℃條件下孵育24 h 造成胰島素抵抗細(xì)胞模型。造模后，按上述方法將受試品在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h 后，按照葡萄糖測定試劑盒說明書，測定各組細(xì)胞葡萄糖消耗量。用MTT 法校正由于細(xì)胞數(shù)差異導(dǎo)致的結(jié)果差異，方法同

1.3.3.2 。結(jié)果用葡萄糖消耗量/MTT（GC/MTT）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法的辣木葉提取物指紋圖譜

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）對9 份辣木葉樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，比較其相似度，結(jié)果表明樣品指紋圖譜（圖1）的相似度分別為0.978，0.987，0.984，0.994，0.991，0.994，0.996，0.939，0.995，說明9 份樣品中成分類別沒有顯著差異。

對9 個(gè)樣品共11 個(gè)色譜峰（表2）的峰面積進(jìn)行熱圖分析（圖2），發(fā)現(xiàn)9 份樣品中的化學(xué)成分含量有一定差異，通過聚類分析可將9 份樣品分為2 大類，結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果，可知這2 類分別為水提取物（S1～S3）和乙醇提取物（S4～S9）。

2.2 辣木葉提取物的降糖活性研究

2.2.1 胰島素對HepG2 細(xì)胞活性的影響 由圖3可知，將濃度為10-9～10-4mol/L 的胰島素作用于HepG2 細(xì)胞。當(dāng)作用時(shí)間為12 h 時(shí)，與正常組相比，胰島素組的細(xì)胞存活率不受影響，可能是胰島素作用時(shí)間較短，從而對于HepG2 細(xì)胞活性的影響不大。當(dāng)胰島素濃度為10-9mol/L 時(shí)，胰島素濃度過低，作用效果不明顯；當(dāng)胰島素濃度為10-4mol/L 時(shí)，胰島素濃度過高，細(xì)胞活性受到顯著影響。當(dāng)作用時(shí)間為36 h 時(shí)，由于胰島素的穩(wěn)定性較差易分解導(dǎo)致作用效果不顯著。因此，本文選取濃度為10-8～5×10-5mol/L 的胰島素作用24 h建立IR-HepG2 模型。

表2 11 個(gè)峰的保留時(shí)間和峰面積Table 2 Retention time and peak area regarding eleven common peaks

2.2.2 胰島素濃度篩選 通過胰島素濃度篩選試驗(yàn)可知，當(dāng)胰島素濃度為5×10-8mol/L 和5×10-7mol/L 時(shí)，與正常組相比，HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量無顯著差異（P＞0.05），而當(dāng)胰島素濃度達(dá)到5×10-7mol/L 和10-6mol/L 時(shí)，HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量已明顯低于正常對照組（P＜0.05），隨著胰島素濃度的升高，HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量持續(xù)降低，而5×10-7mol/L 和10-6mol/L 的胰島素已能引起細(xì)胞攝取葡萄糖能力受損，為避免高胰島素對細(xì)胞造成毒性，本試驗(yàn)選用最小有效濃度5×10-7mol/L 為造模用胰島素濃度（圖4）。

圖1 辣木葉不同提取方式樣品的指紋圖譜Fig.1 The chemical fingerprints of different Moringa oleifera leaves extracts

圖2 正交試驗(yàn)中9 份辣木葉樣品中的11 個(gè)共有峰峰面積熱圖Fig.2 Heat map analysis of 11 common peaks of Moringa oleifera leaves in orthogonal test

圖3 不同濃度不同作用時(shí)間的胰島素對HepG2細(xì)胞活性的影響Fig.3 Effects of insulin on HepG2 cell activity in different concentrations and at different time periods

圖4 不同濃度的胰島素作用24 h 對HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.4 Effects of insulin on glucose consumption of HepG2 cells in different concentrations in 24 h

2.2.3 辣木葉提取物對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

2.2.3.1 辣木葉提取物對HepG2 細(xì)胞活性的影響由圖5可知，與對照組相比，不同提取方式、提取時(shí)間的辣木葉提取物和二甲雙胍作用后的HepG2 細(xì)胞存活率均在90%以上，故采用不超過20 μg/mL 的樣品濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3.2 辣木葉提取物對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 由圖6可知，與對照組相比，模型組HepG2 細(xì)胞在高濃度胰島素條件下，葡萄糖消耗量顯著下降（P＜0.01），說明模型組細(xì)胞的葡萄糖吸收能力損傷，胰島素敏感度下降，造模成功。5～20 μg/mL 的辣木葉提取物能顯著促進(jìn)IRHepG2 細(xì)胞對葡萄糖的吸收（P＜0.05），能夠有效緩解胰島素抵抗，且具劑量依賴性。

圖5 辣木葉提取物對HepG2 細(xì)胞活性的影響Fig.5 Effects of Moringa oleifera leaves extracts on HepG2 cell activity

圖6 辣木葉提取物對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.6 Effects of Moringa oleifera leaves extracts on glucose consumption in IR-HepG2 cells

表3 20 μg/mL 時(shí)樣品較模型組的葡萄糖消耗量上升率Table 3 Increasing rate of glucose consumption in each group of Moringa oleifera leaves extract samples and metformin compared with model group at 20 μg/mL

2.3 辣木葉提取物的降糖活性分析

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 比較正交試驗(yàn)結(jié)果（表4）可知，各因素對辣木葉降糖活性影響順序?yàn)椋阂掖紳舛龋ˋ）＞提取時(shí)間（C）＞溶劑體積（B），且降糖活性最適宜條件為A3B2C1，即80%乙醇、10+8 倍體積，提取時(shí)間1 h。

2.3.2 譜效雙變量相關(guān)分析 采用SPSS for windows 16.0 中雙變量相關(guān)分析法處理，計(jì)算指紋圖譜中11 個(gè)共有峰與降糖活性的Person 相關(guān)系數(shù)（表6）。由圖7可知峰6，7，8，9，10 與降糖活性呈顯著正相關(guān)，其中峰6，7，8，9 與降糖活性的相關(guān)性極顯著（P＜0.01）。通過與對照品比對，色譜峰6 為芹菜素-7-O-葡萄糖苷，色譜峰7 為槲皮素-3-O-葡糖苷，色譜峰8 為山柰酚二乙酰-鼠李糖苷，色譜峰9 為山柰酚（圖3）。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The design and results of L9（34） orthogonal test

表5 L9（34）正交試驗(yàn)方差分析Table 5 The ANOVA of L9（34） orthogonal test

表6 正交試驗(yàn)中9 份辣木葉提取物11 個(gè)共有峰與降糖活性的Pearson 相關(guān)系數(shù)Table 6 The Pearson correlation coefficient of 11 common peaks regarding the nine Moringa oleifera leaves extract samples in orthogonal test

圖7 辣木葉提取物液相色譜圖（a）及混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（b）Fig.7 HPLC chromatogram of Moringa oleifera leaves extract（a） and mixed standard（b）

2.3.3 驗(yàn)證分析 辣木葉中4 個(gè)主要活性成分峰為6～9 號峰，即芹菜素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡糖苷、山奈酚二乙酰-鼠李糖苷和山奈酚，進(jìn)而驗(yàn)證4 種單體化合物在3 種質(zhì)量濃度下（5，10，20 μg/mL）都能顯著促進(jìn)葡萄糖消耗量（圖8），其結(jié)果顯示當(dāng)質(zhì)量濃度為20 μg/mL 時(shí)，葡萄糖消耗量上升率均在20%以上（表7）。同時(shí)，為比較這4 種活性成分對于辣木葉降糖活性的相對活性貢獻(xiàn)度，測定其在9 份辣木葉提取物樣品的含量分別為：芹菜素-7-O-葡萄糖苷（0.09～0.13 mg/g）、槲皮素-3-O-葡糖苷（0.40～0.65 mg/g）、山奈酚二乙酰-鼠李糖苷（26.50～29.99 mg/g）和山奈酚（0.02～0.12 mg/g），計(jì)算4 種活性成分在辣木葉中的相對活性貢獻(xiàn)度，公式為：相對活性貢獻(xiàn)度=各單體化合物葡萄糖消耗量上升率×相對含量（相對含量是指每mg 辣木葉中所含的各單體化合物的量），其中山奈酚二乙酰-鼠李糖苷是辣木葉降糖的主要活性物質(zhì)（圖9）。

3 結(jié)論

圖8 芹菜素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡糖苷、山奈酚二乙酰-鼠李糖苷和山奈酚對IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響Fig.8 Effects of apigenin-7-O-glucoside，quercetin-3-O-glucoside，kaempferol diacetyl-rhamnoside，kaempferol on glucose consumption in IR-HepG2 cells

我國是糖尿病大國，糖尿病患者逐年增加，且患者主要為II 型糖尿病[26]。II 型糖尿病主要是由胰島素抵抗而產(chǎn)生的胰島素相對缺乏導(dǎo)致[27-29]。目前控制糖尿病多采用西藥降糖，長期服用西藥將對身體產(chǎn)生不同程度的副作用，如使肝臟、腎臟出現(xiàn)功能障礙，使胃腸道出現(xiàn)不良反應(yīng)等癥狀。尤其是雙胍類藥物，會對腎臟、肝臟功能產(chǎn)生非常顯著的影響。長期服用降糖藥物也容易使患者產(chǎn)生藥物抵抗的現(xiàn)象，使藥效明顯降低。因此，運(yùn)用高效低毒性的純天然降糖活性物質(zhì)來輔助降糖是未來控制糖尿病的研究方向。

辣木葉作為一種植物新資源食品，其較高的營養(yǎng)價(jià)值，以及多方面的生物活性使其受到深入研究和開發(fā)[30]。辣木葉的降血糖活性在臨床上也得到了驗(yàn)證[31-32]，能顯著降低血糖水平，提高胰島素敏感性。本文考察提取過程中的乙醇濃度、溶劑體積和提取時(shí)間對于辣木葉降糖活性的影響，故采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取方式，建立IR-HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗模型，以細(xì)胞的葡萄糖消耗量為指標(biāo)，評價(jià)辣木葉提取物的降糖活性，結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取方式，發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間對于辣木葉降糖活性的影響較大。同時(shí)結(jié)果表明80%乙醇、10+8 倍溶劑體積，提取時(shí)間1 h 條件下的辣木葉提取物具有最強(qiáng)的降糖活性。

表7 20 μg/mL 標(biāo)品較模型組的葡萄糖消耗量上升率Table 7 Increasing rate of glucose consumption in apigenin-7-O-glucoside，quercetin-3-O-glucoside，kaempferol diacetyl-rhamnoside，kaempferol compared with model group at 20 μg/mL

圖9 芹菜素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡糖苷、山奈酚二乙酰-鼠李糖苷和山奈酚在辣木葉中的相對活性貢獻(xiàn)率分析Fig.9 The relative active contributions regarding apigenin-7-O-glucoside，quercetin-3-O-glucoside，kaempferol diacetyl-rhamnoside，kaempferol in Moringa oleifera leaves

本文測定了9 種辣木葉提取物的指紋圖譜，通過相似度分析發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分差異不大。通過建立IR-HepG2 模型評價(jià)辣木葉提取物的降糖活性，隨著辣木葉提取物濃度的上升，HepG2 細(xì)胞攝取葡萄糖的能力上升，有效緩解胰島素抵抗。而辣木葉組成復(fù)雜，化學(xué)指紋圖譜無法確定其中的活性物質(zhì)，因此，將指紋圖譜與降糖活性評價(jià)相結(jié)合，通過相關(guān)性分析研究其譜效關(guān)系，初步探索辣木葉中的降糖活性成分群。本文通過分析辣木葉降糖活性與其指紋圖譜的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)辣木葉中降糖活性物質(zhì)可能為芹菜素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡糖苷、山柰酚二乙酰-鼠李糖苷和山柰酚，這4 種物質(zhì)與降糖活性的相關(guān)性極顯著，而山柰酚二乙酰-鼠李糖苷是辣木葉中起到降糖作用的主要活性成分。與文獻(xiàn)[33-34]報(bào)道中山奈酚與槲皮素及其衍生物能夠緩解HepG2 的胰島素抵抗，芹菜素-7-O-葡萄糖苷能夠作為α-葡萄糖苷酶發(fā)揮降糖作用[35]相吻合。辣木葉組成復(fù)雜，各成分也可能存在相互作用，各降糖活性成分緩解胰島素抵抗的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本文結(jié)合化學(xué)指紋圖譜與降糖活性評價(jià)，通過建立譜效關(guān)系，初步定位了辣木葉中具有降糖活性的成分，本研究為辣木葉降糖活性成分的分離純化提供了參考依據(jù)。