茶薪菇酚類提取物的抗氧化功效評(píng)價(jià)

吳 俐，翁敏劼，李怡彬，湯葆莎，賴譜富，鄭恒光，沈恒勝

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所 福州350003）

茶薪菇（Agrocybechaxingu Huang）是一種藥食兩用的食用菌珍稀品種，最早發(fā)現(xiàn)野生茶薪菇僅生長于油茶樹上[1]。田頭菇屬食用菌含有催化底物過氧化氫羥基轉(zhuǎn)移并形成酚類化合物的胞外過氧化物酶（Agrocybeaegerita peroxidase，AaP）[2-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，茶薪菇子實(shí)體的酚類提取物以黃酮醇類為主，其子實(shí)體的酚類物質(zhì)含量約為金福菇的1.67 倍；化學(xué)法測(cè)定其酚類提取物的抗氧化能力較強(qiáng)；茶薪菇液體代謝產(chǎn)物的抑制脂質(zhì)氧化能力較強(qiáng)[5]。然而，國內(nèi)外大量研究都基于對(duì)茶薪菇多糖的降血糖[6]，免疫調(diào)節(jié)[7]，抗氧化[8]，抗血管生成[9]，抗炎[10]和抑制破骨細(xì)胞形成[11]等生物活性方面，少見茶薪菇不同溶劑提取物的酚類含量及其抗氧化特征和能力的研究。本試驗(yàn)采用不同溶劑分別提取茶薪菇，通過茶薪菇不同提取物的總酚、總糖及其體外抗氧化特征，分析茶薪菇的抗氧化組分對(duì)正常小鼠的抗氧化能力以及D-半乳糖衰老小鼠抗衰老能力的影響，為進(jìn)一步開發(fā)茶薪菇抗氧化多酚提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

正常小鼠抗氧化活性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的雄性清潔級(jí)ICR 小鼠40只，體重（20±2）g，動(dòng)物證號(hào)SCXK（閩）2012-0001。D-半乳糖氧化損傷小鼠模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雄性清潔級(jí)ICR 小鼠50只，體重（20±2）g，動(dòng)物證號(hào)SCXK（閩）2012-0001。飼料：福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

茶薪菇子實(shí)體（干品），福建益升食品有限公司。

D-半乳糖、藏紅花T、鐵氰化鉀、氯化鐵、焦性沒食子酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、丙酮、乙醇等試劑均為分析純級(jí)；丙二醛、超氧化物歧化酶試劑盒，南京建成生物工程技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

BL60S 電子天平，德國Sartrius 公司；高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-6 電熱恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；KQ-600DV 數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；765P型紫外-可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；SCIENTZ-30ND 冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶薪菇不同溶劑組分的制備

1） 茶薪菇水提物 茶薪菇子實(shí)體干粉，按照1∶20 的料液比，添加蒸餾水浸提，80 ℃提取1 h，提取3 次。合并濾液。

2） 茶薪菇丙酮提取物（水解單寧）[12-13]茶薪菇子實(shí)體粉末，按照1∶20 的料液比，添加1%HCL的7∶3 丙酮水溶液浸提，30 r/min 室溫提取1 h，提取3 次。合并濾液。

3） 茶薪菇乙醇提取物（縮合單寧）[14-15]茶薪菇子實(shí)體粉末，按照1∶20 的料液比，添加弱酸性6∶4（體積比）的乙醇水溶液（pH 6），在室溫下用超聲波提取，功率300 W，頻率100 kHz，浸提0.5 h，提取3 次。合并濾液。28～30 ℃，50～60 r/min，在

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至1/3 體積，凍凍干燥。

1.3.2 茶薪菇水提物、丙酮提取物、乙醇提取物的總酚、總糖和抗氧化活性測(cè)定

1） 總酚 普魯士藍(lán)法[5]；

2） 總糖 苯酚硫酸法[5]；

3） 茶薪菇酚類物分離組分的抑制脂質(zhì)過氧化作用 卵黃脂蛋白不飽和脂肪酸（PUFA）過氧體系法[16]；

4） 茶薪菇酚類物分離組分清除羥自由基作用 Fenton 體系法[17]；

5） 茶薪菇酚類物分離組分清除超氧陰離子作用 鄰苯三酚體系法[18]。

1.3.3 茶薪菇提取物對(duì)正常小鼠抗氧化活性測(cè)定篩選在體外抗氧化活性測(cè)定中，表現(xiàn)出抗氧化能力最強(qiáng)的茶薪菇提取物，灌胃給予正常小鼠，并測(cè)定其血清抗氧化指標(biāo)，為后續(xù)D-半乳糖衰老動(dòng)物的體內(nèi)抗氧化功效評(píng)價(jià)提供灌胃水平和抗氧化能力等實(shí)驗(yàn)依據(jù)。以生理鹽水組、50 mg/（kg bw·d）阿魏酸組和維生素E（VE）組為對(duì)照，經(jīng)口連續(xù)灌胃12 mg/（kg bw·d）茶薪菇水提物（以總酚含量計(jì)）10 d，每組10 只小鼠，每只小鼠灌胃量為0.2 mL/10g。定期稱量動(dòng)物體重，并按體重調(diào)整灌胃量；最后1 d 灌胃1 h 后，小鼠眼內(nèi)眥靜脈取血，分離血清測(cè)定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）含量；其后脫頸椎處死動(dòng)物，稱量肝、脾、胸腺組織。

1.3.4 D-半乳糖小鼠衰老模型評(píng)價(jià)茶薪菇酚類物的抗氧化功效 以茶薪菇水提物對(duì)正常小鼠的抗氧化功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，采用D-半乳糖衰老動(dòng)物模型評(píng)價(jià)茶薪菇提取物對(duì)衰老小鼠的體內(nèi)抗氧化功效。

1） 造模方法及模型驗(yàn)證 采用D-半乳糖致亞急性衰老法[19]，通過連續(xù)腹腔注射D-半乳糖，使得機(jī)體細(xì)胞內(nèi)過量累積的D-半乳糖在醛糖還原酶作用下生成無法被細(xì)胞代謝的半乳糖醇，影響細(xì)胞的滲透壓，使細(xì)胞腫脹，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞功能障礙、代謝紊亂，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老。體重（18±4）g的ICR 雄性清潔小鼠50 只，除空白對(duì)照組（10只） 外，其余40 只小鼠用D-半乳糖400 mg/（kg bw·d）腹腔注射造模，注射量為0.1 mL/10 g，每日1 次，空白對(duì)照組注射等體積生理鹽水，連續(xù)造模8 周，每周定期稱重1 次，依據(jù)每周體重調(diào)整給藥劑量。分別在造模第6 周和第8 周，用內(nèi)徑1.0～1.5 mm 的玻璃毛細(xì)管從眼眶靜脈叢采血0.5 mL/只，室溫靜置1 h 后，4 ℃，3 000 r/min 離心10 min，分離血清測(cè)定丙二醛含量，驗(yàn)證小鼠造模是否成功。第8 周造模組小鼠MDA 含量與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示造模成功。

2） 分組與給藥 ICR 小鼠適應(yīng)期3 d，根據(jù)體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組10 只，造模組40 只。D-半乳糖模型成功后，將40 只造模小鼠依據(jù)第8周小鼠血清的MDA 含量隨機(jī)分為模型對(duì)照組和茶薪菇水提物高、中、低劑量組。從第9 周開始，繼續(xù)腹腔注射D-半乳糖的同時(shí)，處理組灌胃10，20，40 mg/（kg bw·d）的茶薪菇水提物（以總酚含量計(jì)，以1.3.3 節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)），灌胃量為0.2 mL/10 g，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組用相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液替代，灌胃期45 d。每周定時(shí)稱重，根據(jù)每周體重平均值調(diào)整灌胃量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束眼眶后靜脈叢采血。飼養(yǎng)管理：每籠4 只小鼠，室溫（22±2）℃，濕度60%～65%，自由飲食，隔日更換墊料[20]。

3） 檢測(cè) 最后一次灌胃0.5 h 后，小鼠眼內(nèi)眥靜脈取血分離血清，檢測(cè)血清丙二醛、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和蛋白質(zhì)羰基含量，檢測(cè)方法參照南京建成生物工程技術(shù)研究所試劑盒的說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素ANQVA 檢驗(yàn)比較顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶薪菇水提物、丙酮提取物、乙醇提取物的制備結(jié)果

以茶薪菇酚類物質(zhì)的極性差異為分離依據(jù)，分別采用去離子水、丙酮水溶液和乙醇水溶液分離獲得以水解單寧為主要成分的丙酮提取物，以及以縮合單寧為主要成分的乙醇提取物；采用不同溶劑分離得到茶薪菇水提物約占子實(shí)體總質(zhì)量的31.62%，茶薪菇丙酮提取物含量約為36.67%；茶薪菇乙醇提取物的含量約為38.17%。

2.2 定性、定量分析茶薪菇不同提取物總酚、總糖及抗氧化活性

茶薪菇水提物、丙酮提取物和乙醇提取物的總酚含量分別為1.25‰，1.01‰，1.68‰，說明用乙醇水溶劑體系提取茶薪菇子實(shí)體可以獲得酚類的物質(zhì)最多。一定濃度的酚類物質(zhì)分離組分均具有一定的抗氧化能力。當(dāng)茶薪菇水提物質(zhì)量濃度為60.00 mg/mL，丙酮提取物質(zhì)量濃度為146.47 mg/mL，乙醇提取物質(zhì)量濃度為122.44 mg/mL 時(shí)，它們對(duì)Fenton 羥自由基的清除率在3 種體外抗氧化體系中最高，分別為87.00%，82.54%，79.73%；對(duì)鄰苯三酚體系超氧陰離子清除率為19.88%，41.52%，57.06%；對(duì)卵黃脂蛋白不飽和脂肪酸（PUFA） 過氧化的抑制率為65.31%，54.47%，57.85%。3 種不同溶劑提取物中體外抗氧化能力最強(qiáng)的是茶薪菇水提物。

表1 茶薪菇總酚、總糖含量及其體外抗氧化結(jié)果Table 1 The content of total phenol，total sugar of A.chaxingu and its antioxidant in vitro

2.3 茶薪菇水提物對(duì)正常小鼠抗氧化活性的影響

2.3.1 茶薪菇水提物對(duì)小鼠體重增重的影響 從圖1可知，灌胃茶薪菇水提物組小鼠體重不斷增加，灌胃前和灌胃第1 天相比較，小鼠體重增加較大，且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，茶薪菇水提物組小鼠體重變化與生理鹽水對(duì)照組小鼠的體重變化基本相同，增重效果介于維生素E 對(duì)照組和阿魏酸對(duì)照組之間，說明灌胃茶薪菇水提物中酚類物質(zhì)含量適宜，對(duì)消化道無明顯不良刺激，不影響小鼠體重正常增長。

圖1 茶薪菇水提物對(duì)小鼠體重增重的影響Fig.1 The effect of A.chaxingu aqueous extract on weight gain in mice

表2 小鼠臟器指數(shù)Table 2 Viscera index in mice

2.3.2 茶薪菇水提物對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 從表2可知，生理鹽水組、維生素E 組和阿魏酸組的胸腺指數(shù)均高于茶薪菇水提物組；與3 個(gè)對(duì)照組相比茶薪菇水提物組肝臟指數(shù)最高；茶薪菇水提物組的脾臟指數(shù)僅略低于維生素E 組，高于生理鹽水組和阿魏酸組。因此，灌胃茶薪菇水提物的抗氧化能力，在一定程度上可以保護(hù)機(jī)體免疫器官脾臟，減緩因自由基損害導(dǎo)致的免疫器官萎縮。

2.3.3 茶薪菇水提物體內(nèi)抗氧化能力 前期定性、定量分析酚類物質(zhì)分離組分及體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，茶薪菇酚類組分抗氧化特性顯示，其茶薪菇水提取物的體外抗氧化能力最強(qiáng)，總酚含量介于丙酮提取物和乙醇提取物之間。從表3小鼠血清的SOD、MDA 值可見，茶薪菇水提物組SOD 值最高達(dá)130.43 U/mL；MDA 值顯著低于生理鹽水對(duì)照組（P＜0.05），抗氧化能力與維生素E和阿魏酸含量相當(dāng)。茶薪菇水提物通過提高小鼠血清中超氧化物歧化酶活性，發(fā)揮清除體內(nèi)過多活性氧自由基的作用，當(dāng)機(jī)體的SOD 酶活降低，脂質(zhì)過氧化物MDA 積累，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，組織損傷等。因此，SOD 酶活和MDA 含量呈負(fù)相關(guān)，SOD 酶活越高，MDA 含量越低，反之亦成立。茶薪菇水提物的抗氧化機(jī)理可能是通過提高機(jī)體SOD酶活，清除體內(nèi)過多的活性氧自由基，減少脂質(zhì)自由基和過氧化物MDA 的積累，降低其對(duì)細(xì)胞膜破壞和組織損傷的作用，從而發(fā)揮抗氧化作用。

2.4 D-半乳糖小鼠衰老模型評(píng)價(jià)茶薪菇酚類物的抗氧化功效

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》 附件1 抗氧化功能評(píng)價(jià)方法對(duì)抗氧化功效評(píng)價(jià)[21]的要求，實(shí)施D-半乳糖動(dòng)物衰老模型功效評(píng)價(jià)與生理生化測(cè)試分析，為天然抗氧化劑研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

2.4.1 茶薪菇水提物對(duì)衰老小鼠體重的影響 茶薪菇水提物處理前和灌胃45 d 后，所有組別的小鼠體重均無顯著性差異（P＞0.05）。原因是在灌胃實(shí)驗(yàn)開始前的雄性ICR 小鼠大約14 周齡，小鼠已經(jīng)成熟，生長發(fā)育趨于緩慢，體重增幅相對(duì)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶薪菇水提物對(duì)小鼠的體重未產(chǎn)生明顯的不良作用。

表3 茶薪菇水提物對(duì)正常小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 The effect of A.chaxingu aqueous extract on serum antioxidant index of the normal mice

表4 茶薪菇水提物對(duì)衰老小鼠體重的影響Table 4 The effect of A.chaxingu aqueous extract on body weight of aging mice

2.4.2 茶薪菇水提物對(duì)衰老小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響 與空白對(duì)照組相比，D-半乳糖模型組小鼠的MDA 含量明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01）。與模型組比較，茶薪菇水提物低、中、高劑量組MDA含量降低且差異極顯著（P＜0.01）；茶薪菇水提物低劑量組GSH-Px 活力極顯著提高（P＜0.01）。綜合分析，茶薪菇水溶性酚類粗提物能明顯拮抗D-半乳糖的作用，使得小鼠血清MDA 含量降低，GSH-Px 活性升高。其中，低劑量組提高GSH-Px活性的效果最好，MDA 含量降低至空白組正常小鼠水平。

表5 茶薪菇水提物對(duì)衰老小鼠血清的抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 The effect of A.chaxingu aqueous extract on serum antioxidant index of aging mice

3 討論

3.1 茶薪菇多酚的體外抗氧化活性分析

前期研究比較了茶薪菇、金福菇、秀珍菇等幾種不同食用菌子實(shí)體的酚類物含量及其抗氧化活性的關(guān)系，茶薪菇酚類化合物的濃度最高，酚類化合物成分以黃酮醇類化合物為主，且食用菌子實(shí)體的酚類物含量與其抗氧化活性呈明顯正相關(guān)[22]，茶薪菇液體培養(yǎng)代謝產(chǎn)物同樣具有明顯的體外抗氧化作用[5，23]。其它文獻(xiàn)報(bào)道茶樹菇粗多酚對(duì)·OH 自由基清除能力與茶多酚相當(dāng)，對(duì)·O－2自由基清除能力以及總抗氧化能力比VC 強(qiáng)[24]。本文研究結(jié)果顯示，茶薪菇水、乙醇、丙酮提取物均具有清除·OH 自由基和·O－2自由基的抗氧化能力，與前人研究報(bào)道相一致[5，22]，不同之處在于研究還發(fā)現(xiàn)茶薪菇子實(shí)體和菌絲體均具有較強(qiáng)的抑制脂質(zhì)過氧化的能力，茶薪菇酚類物具有開發(fā)油脂抗氧化劑的潛力。

3.2 茶薪菇提取物的體內(nèi)抗氧化活性分析

衰老的自由基學(xué)說[25]認(rèn)為體內(nèi)產(chǎn)生過多的氧自由基氧化細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化、交聯(lián)、聚合成脂褐素（lipofuscin），過多的氧自由基還會(huì)破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)和酶變性，從而加速衰老。氧化物含量（如MDA）和抗氧化酶活性（如GSH-Px、SOD 酶） 是評(píng)價(jià)機(jī)體氧化水平的主要指標(biāo)。課題組前期采用D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型成功評(píng)價(jià)了液體發(fā)酵富硒秀珍菇菌絲體的體內(nèi)抗氧化功效[20]。采用野生型黑腹果蠅作為模式動(dòng)物，1 mg/mL 茶樹菇多酚對(duì)雌雄果蠅壽命的延長率高于0.25，4 mg/mL 劑量組，與對(duì)照組相比達(dá)極顯著水平[24]。本文通過分析茶薪菇水提取物對(duì)正常小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與他人研究報(bào)道相一致。不同之處在于，本文還研究茶薪菇水提取物對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)茶薪菇水提取物具有明顯的拮抗D-半乳糖的衰老作用，并推測(cè)其抗氧化機(jī)制可能是通過提高GSH-Px、SOD 酶等抗氧化酶體系的活力，同時(shí)降低MDA 脂質(zhì)氧化物含量，從而發(fā)揮抗氧化作用。

4 結(jié)論

茶薪菇水提物、丙酮提取物和乙醇提取物中，茶薪菇水提取物的總酚含量為1.25‰，介于丙酮提取物和乙醇提取物之間，對(duì)羥自由基的清除率高達(dá)87.00%，對(duì)卵黃脂蛋白不飽和脂肪酸（PUFA）過氧化的抑制率高達(dá)65.31%。12 mg/（kg bw·d）（以總酚含量計(jì)）的茶薪菇水提物不影響正常小鼠體重增長，具有調(diào)高肝臟和脾臟指數(shù)的趨勢(shì)，以及提高SOD 酶活和明顯降低MDA 含量的作用（P＜0.05）。10，20，40 mg/（kg bw·d）的茶薪菇水提物（以總酚含量計(jì)） 極顯著降低了衰老小鼠的MDA 含量（P＜0.01），20 mg/（kg bw·d） 劑量組的MDA 含量下降率高達(dá)94.53%；10 mg/（kg bw·d）劑量組的GSH-Px 活力極顯著提高22.98%（P＜0.01）。茶薪菇水提物中酚類物質(zhì)是體外和體內(nèi)抗氧化的主要功效成分，通過提高SOD、GSH-Px 等抗氧化酶活力，降低MDA 含量，發(fā)揮維持機(jī)體抗氧化穩(wěn)態(tài)和拮抗D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老損傷的作用。茶薪菇水提物中多酚類抗氧化組分分離純化，以及抗氧化機(jī)理有待進(jìn)一步研究。