金屬離子與乳酸菌素對沙門氏菌的協(xié)同抑菌作用

李光月，陳漪汶，李雪玲

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 廣州510642）

乳酸菌素，一種由大多數(shù)乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA 經(jīng)過次級代謝過程在核糖體中編碼形成的蛋白質(zhì)或多肽，分子質(zhì)量低，具有抑菌活性。乳酸菌素不僅可以致死近緣乳酸菌，也可以抑制或殺死其它革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，產(chǎn)生菌并不會被自身所產(chǎn)的細(xì)菌素抑制或殺死，這是因其體內(nèi)具有一種特異性免疫基因，故可以使其對乳酸菌素具有自身免疫性[1]。乳酸菌素對于人類是安全無毒的，這歸功于它可以在胃腸道內(nèi)降解[2]。乳酸菌素的種類繁多，以對Nisin 的研究最廣，作為在全球已批準(zhǔn)應(yīng)用的食品添加劑，Nisin 在抑制食品中致病菌和腐敗菌的生長方面很有效果[3]。除Nisin 外，另外一些細(xì)菌素作為食品防腐劑也很有發(fā)展前景，遺憾的是某種乳酸菌素因存在一些缺陷，比如抑菌譜窄和熱穩(wěn)定性差等，故其難以在食品工業(yè)方面單獨(dú)應(yīng)用[4]。

唾液乳桿菌是一種具有多種生理功能的重要益生菌，主要存在于人及動物的胃、腸道及口腔中[5]。文獻(xiàn)[6-9]報道其所產(chǎn)乳酸菌素的抑菌作用，不僅可以抑制革蘭氏陽性菌，還可以抑制革蘭氏陰性菌，因而被制作成適用于人和動物的益生菌制劑。此外，唾液乳桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物還有多種用途，如作為食品防腐劑[10]，預(yù)防齲齒[11-12]，免疫調(diào)節(jié)[13]，抗炎和抗感染[14-16]，抗衰老[17-18]，抗腫瘤[19]等。

目前多數(shù)是對乳酸菌素單一特性的研究分析，而關(guān)于乳酸菌素與金屬離子協(xié)同抑菌方面的研究較少見。本研究通過體外抑菌試驗(yàn)尋求抑菌效果較好的細(xì)菌素，研究細(xì)菌素與金屬離子的協(xié)同作用及其抑菌機(jī)理，旨在為進(jìn)一步開發(fā)新型綠色食品防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

唾液乳桿菌O2A，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室提供；鼠傷寒沙門氏菌（Sulmouellu typhimurium）CMCC50115，廣東省微生物菌種保藏中心。

MRS 培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、七水合硫酸亞鐵、六水合三氯化鐵、硫酸鎂、七水合硫酸鋅、五水合硫酸銅、結(jié)晶氯化鋁、一水合硫酸錳、氯化鋇、乙酸鈉、冰醋酸、硫酸銨、戊二醛均為分析純級（AR），廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 唾液乳桿菌O2A 的活化及無細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備 按5%接種量將唾液乳桿菌O2A 接種于10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置恒溫培養(yǎng)24 h。再接種到150 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h 后，4 ℃，8 000 r/min 離心20 min，得到發(fā)酵上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 金屬離子-乳酸菌素對沙門氏菌的抑菌效應(yīng)測定

1.2.2.1 金屬離子-發(fā)酵上清液協(xié)同抑菌檢測配 制1.0 mol/L 的NaCl、KCl、CaCl2、FeSO4、FeCl3、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、AlCl3、MnSO4、BaCl2溶 液，滅菌后室溫保存。取1 mL 發(fā)酵上清液，分別加入20 μL 以上不同的金屬離子溶液，37 ℃溫育2 h，對照組為加入相同體積超純水發(fā)酵上清液和加入相同金屬離子濃度處理的MRS 液體培養(yǎng)基，打孔法檢測抑菌活性。

選取能顯著增強(qiáng)乳酸菌素抑菌活性的金屬離子，分別設(shè)置以下濃度：250，120，60，50，40，30，20，10 mmol/L，加入發(fā)酵上清液中，37 ℃溫育2 h，按上述方法檢測抑菌活性。

1.2.2.2 金屬離子協(xié)同乳酸菌素抑菌檢測 發(fā)酵上清液中按60%最適飽和度加入飽和硫酸銨，4℃靜置過夜，在4 ℃，7 000 r/min 離心30 min，收集沉淀，將沉淀重懸于原體積1/10 的pH 5.0，0.02 mol/L 的乙酸鈉緩沖液中，檢測鹽析上清液與沉淀復(fù)溶液的抑菌活性。以乳酸菌素的粗提物驗(yàn)證1.2.2.1 節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 金屬離子-乳酸菌素對沙門氏菌抑菌作用測定 取5 mL 培養(yǎng)14 h 的沙門氏菌菌液分別接種到100 mL 含金屬離子、金屬離子-乳酸菌素、金屬離子-發(fā)酵上清液、單獨(dú)發(fā)酵上清液和單獨(dú)乳酸菌素的MRS 培養(yǎng)液中，37 ℃條件下150 r/min 培養(yǎng)，每6 h 取樣，測定菌懸液于600 nm 波長處的吸光值，連續(xù)測定30 h，并以時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制出不同作用下的沙門氏菌生長曲線。

1.2.4 掃描電鏡（SEM）與透射電鏡（TEM）觀察不同處理對沙門氏菌菌體形態(tài)的影響 將過夜培養(yǎng)的菌懸液分別接種到100 mL 含金屬離子、含金屬離子-乳酸菌素、含金屬離子-發(fā)酵上清液、單獨(dú)發(fā)酵上清液和單獨(dú)乳酸菌素的MRS 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)18 h 后，于5 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用pH 7.0 的磷酸緩沖液漂洗3 次，15 min/次；加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定4 h，再進(jìn)行電鏡制樣流程，分別通過掃描電鏡及透射電鏡觀察菌體細(xì)胞形態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效應(yīng)的測定

2.1.1 不同金屬離子-發(fā)酵上清液協(xié)同抑菌作用金屬離子-發(fā)酵上清液對沙門氏菌的抑菌效果試驗(yàn)結(jié)果如圖1顯示，大部分金屬離子-發(fā)酵上清液對沙門氏菌均有不同程度的抑菌效果。與空白對照組（未加金屬離子的發(fā)酵液）相比，發(fā)酵上清液加入Na+、Mg2+、Ba2+后，其抑菌活性有不同程度的下降，而發(fā)酵上清液加入Cu2+、K+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Fe3+6 種離子后，其抑菌活性均有增強(qiáng)；而加入Mn2+或Ca2+后抑菌效果沒有差別。

圖1 不同金屬離子-發(fā)酵上清液對沙門氏菌的抑菌效果Fig.1 The antibacterial effect of different metal ionfermentation supernatant on Salmonella

通過對比11 種金屬離子-發(fā)酵上清液對沙門氏菌抑菌作用的增強(qiáng)比率（圖2）：金屬離子-發(fā)酵上清液與單獨(dú)發(fā)酵上清液相比，其增強(qiáng)效果由大到小為：Cu2+＞K+＞Al3+＞Zn2+＞Fe2+＞Fe3+，剩下的6 種離子減弱沙門氏菌抑菌效果；而金屬離子-發(fā)酵上清液與單獨(dú)金屬離子相比，其增強(qiáng)效果由大到小為：Cu2+＞Fe3+＞Mn2+＞Al3+＞Fe2+＞Na+＞K+＞Mg2+＞Zn2+＞Ba2+，而Ca2+沒有增強(qiáng)效果?？傮w來看，根據(jù)兩者之間的增強(qiáng)比率最終篩選出3 種離子Cu2+、Al3+、Zn2+做進(jìn)一步研究。

圖2 金屬離子-發(fā)酵上清液對沙門氏菌的抑菌增強(qiáng)比率Fig.2 Enhanced bacteriostatic ratio of metal ion-supernatant to Salmonella

2.1.2 不同濃度金屬離子-發(fā)酵上清液協(xié)同抑菌作用 通過設(shè)置多種不同濃度的Cu2+、Al3+、Zn2+金屬離子溶液，發(fā)現(xiàn)其對唾液乳桿菌O2A 發(fā)酵上清液的抑菌作用均有一定的影響。與對照組相比，抑制沙門氏菌的作用隨著金屬離子濃度的升高，逐漸變?yōu)橛山饘匐x子作為主導(dǎo)。對于Al3+而言，濃度在30～60 mmol/L 之間，主要由金屬離子-發(fā)酵上清液對沙門氏菌有抑菌作用，隨著濃度的升高，抑菌效果由單獨(dú)金屬離子占主導(dǎo)（圖3）；對于Zn2+而言，濃度在30～40 mmol/L 之間，主要是由金屬離子-發(fā)酵上清液對沙門氏菌有抑菌作用，隨著濃度的升高，后面的抑菌效果逐漸由單獨(dú)金屬離子占主導(dǎo)（圖4）。結(jié)果表明，30～40 mmol/L Zn2+或Al3+協(xié)同乳酸菌素的抑菌作用效果明顯，Cu2+對發(fā)酵上清液的協(xié)同抑菌作用沒有Al3+、Zn2+顯著（圖略）。

2.1.3 不同濃度金屬離子-乳酸菌素協(xié)同抑菌作用 如圖5所示，Al3+在濃度為30 mmol/L 時，3 種處理（單獨(dú)乳酸菌素、單獨(dú)金屬離子和金屬離子-乳酸菌素）對沙門氏菌的抑菌效果均不明顯，而當(dāng)濃度升高到40 mmol/L 時，其抑菌效果有明顯變化，然而根據(jù)趨勢來看，協(xié)同抑菌效果比較差，對沙門氏菌的抑菌作用主要是金屬離子的原因。對于Zn2+，單獨(dú)金屬離子和金屬離子-乳酸菌素都對沙門氏菌有明顯的抑菌效果，并且隨著濃度的升高，金屬離子的對沙門氏菌的抑菌作用逐漸占主導(dǎo)。因此，最終選定Zn2+（30 mmol/L）-乳酸菌素與Zn2+（30 mmol/L）-發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌機(jī)理的研究。

圖3 不同濃度Al3+-發(fā)酵上清液對沙門氏菌的抑菌效果Fig.3 Bacteriostatic effect of different concentrations of Al3+-fermentation supernatants on Salmonella

圖4 不同濃度Zn2+-發(fā)酵上清液對沙門氏菌的抑菌效果Fig.4 Bacteriostatic effect of different concentrations of Zn2+-fermentation supernatants on Salmonella

2.2 抑菌機(jī)理的初探

2.2.1 不同抑菌劑對沙門氏菌生長曲線的影響由圖6可知，5 種抑菌劑對沙門氏菌都有明顯抑制作用。與對照組相比，不同處理組在不同時間段具有不同的抑菌效果，其中Zn2+（30 mmol/L）-乳酸菌 素、Zn2+（30 mmol/L）-發(fā)酵上清液和Zn2+（30 mmol/L）抑菌效果比較穩(wěn)定，而與對照組相比，在培養(yǎng)23 h 之前，發(fā)酵上清液具有抑菌作用，并且其抑菌效果逐漸減弱，然而在23 h 后，發(fā)酵上清液失去抑菌效果，反而出現(xiàn)了增長現(xiàn)象；同樣的，乳酸菌素在21 h 前具有抑菌作用，而21 h 后也出現(xiàn)了沙門氏菌增長現(xiàn)象，這可能是由于后期出現(xiàn)染菌現(xiàn)象，也有可能是隨著菌液濃度的變化，發(fā)酵上清液或乳酸菌素對沙門氏菌的抑菌活性發(fā)生了改變[20]：發(fā)酵上清液或乳酸菌素被蛋白酶類物質(zhì)分解，最終變成微生物的營養(yǎng)物質(zhì)——多種氨基酸。

2.2.2 掃描電鏡與透射電鏡觀察不同處理對沙門氏菌菌體形態(tài)的影響 掃描電鏡下觀察可見正常的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，菌體邊緣清晰，結(jié)構(gòu)完整，未變形，呈現(xiàn)短棒狀，細(xì)胞表面沒有出現(xiàn)明顯的破裂，無內(nèi)容物溢出，生長狀態(tài)良好。發(fā)酵上清液和乳酸菌素處理后，沙門氏菌表面兩端均出現(xiàn)凸起的小孔，然而還沒有內(nèi)容物滲出，整體形狀沒有改變，相對而言，乳酸菌素處理凸起的小孔較多，開始有部分內(nèi)容物滲出；Zn2+（30 mmol/L）處理后，沙門氏菌菌體表面變得粗糙，且在菌體表面明顯覆蓋著一層凸起的圓形片狀物，這可能是菌體細(xì)胞的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的完整性遭到了破壞，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外泄；Zn2+（30 mmol/L）-發(fā)酵上清液處理后，沙門氏菌的細(xì)胞膜都有一定程度的皺縮現(xiàn)象，中間凹陷；Zn2+（30 mmol/L）-乳酸菌素處理后，大量菌體破裂，菌體內(nèi)部破損，細(xì)胞壁發(fā)生溶解，細(xì)胞質(zhì)從菌體細(xì)胞體內(nèi)大量滲出。通過對比發(fā)現(xiàn)Zn2+（30 mmol/L）-乳酸菌素處理后的菌體結(jié)構(gòu)改變最為突出，受到破壞程度最大（圖7）。

透射電鏡結(jié)果如圖8所示，對照組沙門氏菌細(xì)胞外觀完整，細(xì)胞膜完整，內(nèi)部組織緊密，細(xì)胞質(zhì)分布均勻。發(fā)酵上清液和乳酸菌素處理過的菌體內(nèi)容物固縮；Zn2+（30 mmol/L） 處理過的菌體出現(xiàn)空洞，原生質(zhì)體分布不均勻；Zn2+（30 mmol/L）-發(fā)酵上清液處理的菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜部分呈現(xiàn)融溶狀態(tài)；Zn2+（30 mmol/L）-乳酸菌素處理后的菌體形態(tài)異常，菌體拉長，空洞面積大；通過對比發(fā)現(xiàn)不同處理對沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)與外部結(jié)構(gòu)的變化程度有差異，其中Zn2+（30 mmol/L）-發(fā)酵上清液和Zn2+（30 mmol/L）-乳酸菌素處理后的菌體破壞程度最為嚴(yán)重。

圖5 不同金屬離子-乳酸菌素對沙門氏菌的抑菌效果Fig.5 Effect of different metal ions-lactic acid bacteriocin on Salmonella

圖6 不同處理對沙門氏菌生長曲線的影響Fig.6 Effect of different treatments on growth curve of Salmonella

3 討論

圖7 不同處理下沙門氏菌掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopy of Salmonella by different treatments

圖8 不同處理下沙門氏菌透射電鏡圖（8 000×）Fig.8 Transmission electron microscopy of Salmonella by different treatments（8 000×）

為了有效提高食品防腐劑的相關(guān)性能，可以利用不同防腐劑之間存在的協(xié)同效應(yīng)，將多種防腐劑聯(lián)合使用，達(dá)到單一防腐劑無法實(shí)現(xiàn)的效果[21]。而協(xié)同抑菌作用，既包括天然防腐劑和化學(xué)防腐劑的協(xié)同，天然防腐劑之間的協(xié)同以及化學(xué)防腐劑之間的協(xié)同，也包括食品防腐劑和其它非防腐劑抑菌物質(zhì)以及食品環(huán)境因素的協(xié)同。劉喚明等[22]通過研究脂肽和茶多酚對副溶血弧菌的協(xié)同抑菌效應(yīng)和機(jī)理，發(fā)現(xiàn)脂肽和茶多酚對副溶血弧菌具有強(qiáng)烈的協(xié)同抑菌效應(yīng)；劉國榮等[23]通過研究食品加工環(huán)境因素對雙歧桿菌細(xì)菌素BB04抑菌作用的影響，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)所選取的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl24 種鹽對細(xì)菌素的抑菌作用都有一定協(xié)同效應(yīng)，各種鹽之間及同種鹽內(nèi)不同濃度間差異顯著（P＜0.05）。谷新晰等[24]研究了金屬離子對腌制臭雞蛋中乳酸菌產(chǎn)的細(xì)菌素的影響，發(fā)現(xiàn)Zn2+、Al3+、Ca2+和K+促進(jìn)了FJY-1 細(xì)菌素的抑菌活性，Ca2+起到了最明顯的促進(jìn)作用。

金屬離子能夠影響乳酸菌素的抑菌活性，兩者之間的關(guān)系主要有以下4 種：增強(qiáng)作用、減弱作用、離子濃度與所帶電荷影響。本文研究了11 種金屬離子對唾液乳桿菌O2A 的乳酸菌素抑菌活性的影響，結(jié)果表明Cu2+、K+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Fe3+6種離子均有增強(qiáng)作用。谷新晰等[24]和趙春燕等[25]的結(jié)果與本文研究結(jié)果相似，然而他們沒有做單獨(dú)金屬離子以及單獨(dú)乳酸菌素處理的對照以及金屬離子和乳酸菌素協(xié)同抑菌機(jī)理方面的研究，未闡釋金屬離子與乳酸菌素對指示菌菌體的作用效果。金屬離子發(fā)揮抑菌作用首先靠接觸細(xì)菌，進(jìn)而穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜，使細(xì)菌喪失分裂增殖能力而死亡[26-27]。而金屬離子與乳酸菌素的協(xié)同抑菌機(jī)理可能是Zn2+（30 mmol/L）-乳酸菌素的協(xié)同抑菌破壞菌體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，通過損傷菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞的內(nèi)容物流出，從而抑制細(xì)菌生長甚至殺死細(xì)菌。而Na+、Mg2+、Ba2+對該上清液抑菌活性有抑制作用，可能是這些金屬離子調(diào)節(jié)細(xì)菌的生物量和特殊細(xì)菌素的分泌，從而在很大程度上影響了細(xì)菌素的產(chǎn)量[28]，也可能是因?yàn)閹д姾傻慕饘匐x子能結(jié)合到菌體帶負(fù)電荷的磷脂上，從而降低了發(fā)酵上清液與菌體的結(jié)合[29]。

綜上所述，金屬離子和乳酸菌素的適當(dāng)配合將有可能作為復(fù)合抑菌劑用于食品防腐劑中，尤其是生食海鮮食品中。而Zn2+和乳酸菌素的復(fù)配理論上是安全的，因?yàn)殇\元素是人體的必需金屬元素，存在于人體的各個部位，具有促進(jìn)人體的新陳代謝的功效[30]。