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    基于Nrf2通路探討阿里紅三萜酸減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的作用*

    2021-02-05 01:02:42古麗尼歌爾阿布都米吉提沙依拜沙比提叢媛媛帕麗達(dá)阿不力孜
    中國(guó)病理生理雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:肺泡氧化應(yīng)激試劑盒

    古麗尼歌爾·阿布都米吉提, 沙依拜·沙比提, 叢媛媛, 帕麗達(dá)·阿不力孜

    (新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,新疆烏魯木齊830011)

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)以彌漫性肺泡肺間質(zhì)水腫,難治性低氧血癥及非心源性肺水腫為特征[1-2],與體內(nèi)氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)及炎癥介質(zhì)升高具有關(guān)聯(lián)性[3]。氧化應(yīng)激在體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),可引起氣道和血管重塑、侵襲肺間質(zhì)導(dǎo)致肺水腫、對(duì)肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞造成氧化損傷等[4]。研究證實(shí),氧化應(yīng)激損傷主要建立在ALI 的發(fā)生發(fā)展過程中[5]。轉(zhuǎn)錄因子核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor-2,Nrf2)信號(hào)通路是一條保護(hù)性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,保護(hù)機(jī)體抵抗外界氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。未受刺激時(shí),Nrf2與Kelch 樣環(huán)氧氯丙胺相關(guān)蛋白1(Kelch-like epichlorohydrin-related protein 1,Keap1)存在細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)Nrf2受到氧化應(yīng)激時(shí)則與Keap1解離,Nrf2立即進(jìn)入細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,激活下游基因如抗氧化酶及Ⅱ相激酶的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而表達(dá)一系列相關(guān)蛋白如血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)等,發(fā)揮抗炎和抗氧化作用[7]。

    阿里紅為多孔菌科層孔菌屬植物苦白蹄的子實(shí)體,具有止咳平喘、祛風(fēng)利濕、消腫止痛的功效,民間常用于治療肺炎、慢性支氣管炎等疾病[8]。研究顯示,阿里紅的主成分之一三萜酸具有抗炎和抗氧化等藥理作用[9],但其是否對(duì)ALI具有保護(hù)作用鮮少見到報(bào)道。因此,本研究通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型,探討FOTa對(duì)ALI的作用及機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1 動(dòng)物

    60 只 SPF 級(jí)雄性昆明小鼠,6~8 周齡,體重為(20±2)g,購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(新)2018-0003,小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境,在室溫(20~25℃)和濕度40%~60%的環(huán)境下自由攝食飲水。

    2 主要試劑

    阿里紅藥材購(gòu)于自治區(qū)維吾爾醫(yī)院,由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天藥/生藥教研室帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為阿里紅(Fomes OfficinalsAmes)。地塞米松(dexamethasone,Dex)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;脂多糖(lipopolysoccharide,LPS)購(gòu)自sigma;小鼠丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)ELISA 試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司;血?dú)馄?gòu)自IDEXX;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司;TaKaRa試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;兔源Keap1、兔源Nrf2 和兔源HO-1 抗體購(gòu)自Abcam;兔源β-actin購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Keap1、Nrf2、HO-1 和β-actin 所用引物由上海生物工程有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成,序列見表1。

    表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

    3 主要方法

    3.1 FOTa 的提取及含量測(cè)定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]精密稱定阿里紅生藥材粗粉(30 目)約220 g,置圓底燒瓶中,加入95%乙醇2.2 L,稱定重量,加熱回流2 h,放冷,再稱定重量,用乙醇補(bǔ)足減失的重量,過濾,即得。采用紫外-分光光度法進(jìn)行FOTa 的含量測(cè)定,即Y=32.848X+0.0496,R=0.9992,含量為33.5%,得率為15.9%。給藥前,按照阿里紅藥材成人給藥劑量[11]與折算系數(shù) W 計(jì)算出 70 mg/kg、140 mg/kg 和280 mg/kg 3 個(gè)劑量,用氯化鈉注射液各配成相應(yīng)濃度的溶液。

    3.2 動(dòng)物分組及處理 將60 只雄性昆明小鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為6 組:對(duì)照(control)組、模型[12]組(LPS 5 mg/kg 組)、地塞米松[12]組(Dex 1 mg/kg 組)及FOTa 70 mg/kg、140 mg/kg和280 mg/kg 組,每組10只。FOTa 干預(yù)組連續(xù)灌胃相應(yīng)濃度FOTa 4 周,其余組灌胃同等體積生理鹽水,末次灌胃生理鹽水后,Dex 組腹腔注射1 mg/kg,30 min后除對(duì)照組外,其余各組腹腔注射5 mg/kg LPS 進(jìn)行造模。造模成功條件以處理動(dòng)物當(dāng)天PaO2/FiO2值與造模前后體重變化值來確定,即 PaO2:FiO2<300 mmHg 與造模后體重驟降作為成功標(biāo)志。造模后10 h,取血,脫頸處死小鼠,取左下肺葉檢測(cè)肺濕/干重比值(wet/dry weight ratio,W/D),取左上肺葉放于4%多聚甲醛中固定用于病理切片,取右肺組織放置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    3.3 小鼠血氧分壓、二氧化碳分壓及氧合指數(shù)分析 小鼠模型建立10 h 后,取小鼠腹主動(dòng)脈血液標(biāo)本行血?dú)夥治觯?]。

    3.4 肺組織W/D 檢測(cè) 用濾紙輕輕吸干肺組織表面水分并置于稱量瓶中精密稱取濕重,在80 ℃干燥箱內(nèi)烘烤48 h,精密稱取干肺重量并按照C=W濕/W干計(jì)算肺組織的濕干重比。

    3.5 試劑盒檢測(cè)血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD和GSH-Px 含量 取血,在4 ℃,1006 ×g的條件下分離血清,按照ELISA 方法,實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔,采用說明書進(jìn)行規(guī)范加樣,最后選擇450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)A值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值及相應(yīng)的濃度值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度值。

    3.6 HE 染色觀察肺組織病理學(xué)變化 將肺組織置于4%甲醛溶液中固定,石蠟包埋,切成約5 μm 厚的薄片之后用二甲苯脫蠟,經(jīng)梯度乙醇脫水置換。按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行蘇木精-伊紅染色,清洗、脫水、封片,于400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。分別以肺泡水腫、肺泡內(nèi)充血、肺泡內(nèi)充血、肺間質(zhì)水腫程度評(píng)分:無改變或非常輕微為0 分,輕度改變?yōu)? 分,中度改變?yōu)? 分,重度改變?yōu)? 分,極重度改變?yōu)? 分,累計(jì)上述4 項(xiàng)的平均分值即為肺損傷評(píng)分[13]。

    3.7 RT-qPCR 檢測(cè)肺組織 Nrf2、Keap1 及 HO-1 的mRNA 表達(dá)量 肺組織用Trizol 法提取總RNA,按照試劑盒操作說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,RT-qPCR擴(kuò)增條件為:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 31 s,40 個(gè)循環(huán)。用目的基因的Ct 值減去內(nèi)參照的Ct 值,得出ΔCt 值,然后用待測(cè)組分的ΔCt 值減去正常組的ΔCt值,得出 ΔΔCt 值,采用 2-ΔΔCt分析方法分析目的基因表達(dá)量。

    3.8 Western blot 檢測(cè)肺組織中 Nrf2、Keap1 及 HO-1的蛋白表達(dá)量 取50~100 mg 肺組織在液氮中進(jìn)行研磨,并立刻放入RIPA 緩沖液中,待組織與緩沖液充分反應(yīng)后,離心取上清,用BCA 法進(jìn)行蛋白定量,每孔等量加樣,依次進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉溶液封閉,洗膜并依次加入到Keap1、Nrf2、HO-1(1:1000)和β-actin Ⅰ抗(1∶5 000),4℃孵育過夜。次日洗膜,加入Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育60 min,洗膜,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒顯影。用ImageJ圖像分析方法進(jìn)行灰度值分析。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用單因素方差分析結(jié)合多組間方差分析,以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 FOTa 對(duì)ALI 小鼠血氧分壓、二氧化碳分壓及氧合指數(shù)影響

    與對(duì)照組相比,模型組PaO2與PaO2/FiO2降低(P <0.05),PaCO2升高(P <0.05);與模型組相比,F(xiàn)OTa-280 mg/kg 組 及 Dex 組 PaO2與 PaO2/FiO2升 高(P <0.05),PaCO2降低(P <0.05),見圖1。

    2 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織W/D的影響

    與對(duì)照組相比,模型組的W/D 升高(P <0.05);與模型組相比,F(xiàn)OTa-280 mg/kg組及Dex組的W/D降低(P <0.05),見圖2。

    3 FOTa 對(duì)小鼠血清中 MDA、SOD 和 GSH-Px 水平的影響

    與對(duì)照組比較,模型組小鼠的MDA 水平升高(P <0.05),SOD 及 GSH-Px 水平降低(P <0.05);與模型組比較,F(xiàn)OTa 280 mg/kg 組及Dex 組均能降低血清中 MDA 水平(P<0.05),升高 SOD 及GSH-Px 水平(P<0.05),見圖3。

    4 FOTa對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)的影響

    結(jié)果顯示,對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡結(jié)構(gòu)未見明顯異常;模型組肺泡腔和間質(zhì)可見大量紅細(xì)胞滲出,并伴有肺間質(zhì)水腫、肺泡結(jié)構(gòu)被破壞、肉眼見片狀血灶;FOTa-280 mg/kg組及Dex組肺組織紅細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,肺泡結(jié)構(gòu)有所改善,肺間質(zhì)水腫減輕,片狀血灶明顯減少,與對(duì)照組相比,模型組肺組織損傷評(píng)分升高(P<0.05)。與模型組相比,F(xiàn)OTa-280 mg/kg 組及Dex 組肺組織損傷評(píng)分降低(P<0.05),見圖4、5。

    Figure 1.The effect of FOTa on indexes of arterial blood gas analysis in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖1 FOTa對(duì)ALI小鼠動(dòng)脈血中血?dú)夥治鱿嚓P(guān)指標(biāo)的影響

    Figure 2.The effect of FOTa on the wet-to-dry weight ratio(W/D)of the lung tissue in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖2 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織濕干重比例的影響

    5 FOTa 對(duì) ALI 小鼠肺組織 Nrf2、Keap1 及 HO-1 mRNA表達(dá)量的影響

    與對(duì)照組相比,模型組Keap1 mRNA 表達(dá)水平升高(P<0.05),Nrf2 與 HO-1 mRNA 表達(dá)水平降低(P<0.05);與模型組相比,F(xiàn)OTa-280 mg/kg 組及Dex組 Keap1 mRNA 表達(dá)水平降低(P<0.01),Nrf2 與HO-1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05),見圖6。

    Figure 3.The effect of FOTa on the oxidative stress(serum MDA,SOD and GSH-Px levels)in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖3 FOTa對(duì)ALI小鼠血清中氧化應(yīng)激水平的影響

    Figure 4.Effect of FOTa on the histopathological changes of the lung tissue in ALI mice(HE staining,scale bar=50 μm).圖4 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織病理學(xué)改變的影響

    Figure 5.Effect of FOTa on the lung injury score of the lung tissue in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖5 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織損傷評(píng)分的影響

    6 FOTa 對(duì) ALI 小鼠肺組織 Nrf2、Keap1 及 HO-1蛋白表達(dá)的影響

    與對(duì)照組相比,模型組Keap1 蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),Nrf2 與HO-1 蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與模型組相比,F(xiàn)OTa 低、中、高劑量組及Dex組 Keap1 蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05),Nrf2 和HO-1蛋白水平升高(P<0.05),見圖7。

    討 論

    ALI 以發(fā)病機(jī)制繁瑣,病情進(jìn)展迅猛為特點(diǎn),被稱為臨床常見的危急重疾病之一[14]。研究顯示,革蘭陰性細(xì)菌感染引發(fā)膿毒癥是ALI 的主要原因[15],也因此而引發(fā)肺部炎癥細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)[16]。外膜是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要致病因素,而脂多糖正是存在于外膜的內(nèi)毒素主成分[17],它在很大程度上可以模擬膿毒癥和ALI。在動(dòng)物模型中,因?yàn)闅夤茏⑸淇赡馨橛袊?yán)重出血和壞死的可能性,因此通過腹腔注射以誘發(fā) ALI[18]。

    Figure 6.Effects of FOTa on the mRNA expression of Keap1,Nrf2 and HO-1 in the lung tissue of ALI mice.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖6 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織Keap1,Nrf2及HO-1 mRNA表達(dá)的影響

    Figure 7.Effect of FOTa on the Keap1,Nrf2 and HO-1 protein expression in the lung tissue of ALI mice.Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.圖7 FOTa對(duì)ALI小鼠肺組織中Keap1、Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)的影響

    本實(shí)驗(yàn)中,W/D 升高及病理切片中大量紅細(xì)胞滲出、片狀血灶,可視為L(zhǎng)PS 成功誘發(fā)了炎癥反應(yīng)。根據(jù)柏林定義[2],將 PaO2:FiO2<300 mmHg 稱作為ALI。本實(shí)驗(yàn)血?dú)庵笜?biāo)顯示,模型組小鼠PaO2:FiO2<300 mmHg(PaO2/FiO2≈250,F(xiàn)iO2=0.21),PaCO2升高。而動(dòng)脈血中PaCO2的升高嚴(yán)重影響了機(jī)體的換氣功能。綜合上述結(jié)果,該實(shí)驗(yàn)建立模型成功。給藥組中,PaCO2明顯降低說明機(jī)體換氣功能有所改善。FOTa 對(duì)PaCO2的升高有了明顯緩解作用,這可能是FOTa 抑制了肺部炎癥反應(yīng),提高了血氧結(jié)合比,從而改善了肺部功能。

    在LPS 誘導(dǎo)下,炎癥細(xì)胞可通過浸潤(rùn)肺組織引發(fā)炎癥因子聚集而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[19],外源性和內(nèi)源性ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是引發(fā)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞損傷的重要因素[20],其中,SOD 與 GSH-Px 兩種酶在肺組織內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中起重要作用,而MDA 作為自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物,反映肺組織的損傷程度[21]。ELISA 法顯示,模型組血清中 SOD與GSH-Px 濃度降低,此結(jié)果可能與LPS 引發(fā)的肺部氧化應(yīng)激有關(guān),而MDA 濃度升高也證明了這一結(jié)果。FOTa 的應(yīng)用降低了MDA,升高了SOD 與GSHPx 的水平,從而阻止了氧化應(yīng)激對(duì)正常肺組織細(xì)胞的損傷,降低了肺組織炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)。

    Nrf2 介導(dǎo)的信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)維持氧化應(yīng)激的重要信號(hào)通路。此外,研究表明Keap1 是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵傳感器[22]。經(jīng)LPS刺激,模型組中Keap1蛋白表達(dá)水平升高,此結(jié)果表明Keap1 參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘發(fā)。接著,在氧化脅迫下Nrf2 從Keap1 中釋放出來,從而激活其在核中下游調(diào)控的基因—HO-1[23]。研究顯示,HO-1 具有較強(qiáng)的抗炎作用[24]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)FOTa 增加HO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平的結(jié)果推測(cè)FOTa 與HO-1 共同協(xié)調(diào)了抗炎作用。而Nrf2 通過調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)蛋白的功能來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[24]。研究顯示,Nrf2 未激活時(shí)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)水平極高,也是ALI 發(fā)展迅猛的時(shí)期[25]。給藥組中FOTa 升高了Nrf2 的蛋白表達(dá)水平,表明當(dāng)藥物發(fā)揮保護(hù)作用時(shí),Nrf2 是以激活的狀態(tài)存在體內(nèi)的。綜上所述,Nrf2 信號(hào)通路參與了FOTa 減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI的病理生理過程。

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