體外肺癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化三維模型的建立及其對(duì)順鉑抵抗的機(jī)制研究*

徐 煒， 王 劍， 宋 嘉， 陳清勇

（中國人民解放軍第903醫(yī)院，浙江杭州310013）

既往研究表明，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤的惡性生物學(xué)行為、藥物抵抗和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［1-2］。然而在經(jīng)典的腫瘤EMT及耐藥性研究方面，目前仍主要采用二維細(xì)胞培養(yǎng)（two-dimensional cell culture，2DCC）及動(dòng)物腫瘤模型。而隨著腫瘤研究的不斷深入，腫瘤微環(huán)境的重要性已備受人們關(guān)注［3］，由于二維培養(yǎng)缺少細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）環(huán)境，無法進(jìn)行腫瘤細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的交互研究；而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)周期較長，并且涉及到倫理道德、個(gè)體差異、免疫排斥和種屬差異等問題，導(dǎo)致許多人類腫瘤模型無法在動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制，而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)最終呈現(xiàn)的是實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但實(shí)驗(yàn)的中間過程是難以被觀察的。

體外三維細(xì)胞培養(yǎng)（three-dimensional cell culture，3DCC）是介于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與二維平面細(xì)胞培養(yǎng)之間的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，該技術(shù)滿足細(xì)胞培養(yǎng)的直觀和條件可控性的基礎(chǔ)上，盡可能模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞三維形態(tài)及功能，在模擬細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)微環(huán)境相互作用方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［4］。而體外肺癌三EMT 模型尚無文獻(xiàn)報(bào)道，本研究擬采用三維培養(yǎng)技術(shù)在體外構(gòu)建肺癌三維模型，并用轉(zhuǎn)化生長因子β1（transform growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)形成三維EMT肺癌模型，并對(duì)其形態(tài)、蛋白表達(dá)和藥物敏感性進(jìn)行研究，揭示三維培養(yǎng)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT 和順鉑抵抗的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系95D 購自中科院上海細(xì)胞生物研究所。

1.2 主要試劑 胎牛血清和RPMI-1640 培養(yǎng)液購自 Gibco；TGF-β1 購自 PeproTech；順鉑注射液購自齊魯制藥公司；瓊脂購自Gene；氯化鈣顆粒（分析純）購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；海藻酸鈉購自Sigma；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、vimentin、AKT、mTOR、p-AKT 和 p-mTOR 抗體均購自 Cell Signaling Technology；抗GAPDH 抗體購自Abcam；羊抗兔IgGⅡ抗購自杭州聯(lián)川生物有限公司；熒光羊抗兔IgGⅡ抗購自Jackson ImmunoResearch。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 95D 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素（終濃度為1×105U/L）和鏈霉素（終濃度0.1 mg/L）的 RPMI-1640 培養(yǎng)液，常規(guī)置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞支架制備 支架材料為瓊脂和海藻酸鈉混合物，材料終濃度為5%，外形為半徑4 mm、高度2 mm 的圓柱形米黃色干燥薄片。前期研究結(jié)果表明，該種材料的細(xì)胞支架具有無毒、生物兼容性好、降解率低、內(nèi)部孔隙率高、細(xì)胞成球快、成球率高等優(yōu)點(diǎn)［5］，可用于肺癌細(xì)胞三維培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞接種 支架在95%乙醇中浸泡1 h 后，用無菌鑷子轉(zhuǎn)移將支架至24 孔板中，超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射2 h，室溫下晾干，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L，取40 μL 細(xì)胞懸液，輕輕添加到支架上，37℃孵育45 min之后加入1 mL培養(yǎng)液，每24 h換液一次。

2.4 EMT 模型誘導(dǎo)及細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞在支架上培養(yǎng)96 h 后基本形成細(xì)胞球，此時(shí)將培養(yǎng)液更換為含有 5 μg/L TGF-β1、0.5 μmol/L LY294002 或 10 nmol/L rapamycin 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，每24 h換液一次。每日用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。72 h 后將支架取出，PBS 柔和漂洗3 次，4%甲醛固定24 h，梯度（50%→75%→95%→100%→100%）乙醇脫水，每次脫水15 min，室溫干燥12 h 后將樣品固定在導(dǎo)電臺(tái)上，表面噴金30 s 后在1.5 kV 電壓下用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.5 激光共聚焦觀察蛋白表達(dá) 棄掉培養(yǎng)液，用PBS 洗 2～3 次，每次 5 min。加 1 mL 濃度為 4% 多聚甲醛，固定細(xì)胞，室溫30 min。棄掉固定液，加PBS清洗3 次，每次5 min。棄液后加入1 mL 0.1%Triton X-100，室溫透膜 15 min。棄液后加 PBS 清洗 3 次，每次5 min。5%PBS脫脂乳封閉1 h。加Ⅰ抗，4℃孵育過夜，棄液后加PBS清洗3次，每次5 min。加熒光Ⅱ抗，避光孵育1.5 h，棄液后加PBS 清洗3 次，每次5 min。DAPI 染色 15 min，棄液后加 PBS 清洗 3 次，每次5 min。用鑷子挑起支架，用銳器輕輕刮下支架表面細(xì)胞至玻片上，蓋上蓋玻片后，再用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.6 MTT 法檢測(cè)三維培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性將支架均勻裁剪成4 份，95%乙醇浸泡消毒后，用無菌鑷子將支架轉(zhuǎn)移至96 孔板。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L，取10 μL 細(xì)胞懸液，輕輕添加到支架上，孵育30 min 后，加入含有 10%FBS 的培養(yǎng)液，每 24 h 換液1 次。待培養(yǎng)96 h 后，三維培養(yǎng)EMT 組更換為含有5 μg/L TGF-β1 的培養(yǎng)液和順鉑濃度分別為0、2、4、8、16和32 μmol/L 的培養(yǎng)液；三維培養(yǎng)組加入順鉑濃度分別為0、2、4、8、16和32 μmol/L的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，每24 h 換液1 次。兩組均設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，待培養(yǎng)結(jié)束后，于各孔加人20 μL MTT 溶液（5 g/L，無菌PBS配制），37℃溫箱孵育4 h，棄培養(yǎng)液，各孔加入150 μL 二甲基亞砜，搖床避光輕搖10 min，96 孔板離心機(jī)低速離心（200×g，5 min），分離支架與上清液，每孔吸100 μL 上清液置于另一96 孔板內(nèi)，酶標(biāo)儀在490 nm 處檢測(cè)A值，繪制細(xì)胞活力抑制率曲線，其中橫坐標(biāo)為藥物濃度（μmol/L），縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力抑制率（%）。

2.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞并加入裂解液充分裂解，低溫高速離心（4℃，13 800×g，15 min），提取上清-80℃保存。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，煮沸變性后每個(gè)泳道加入總蛋白10 μg，8% SDSPAGE 分離后，轉(zhuǎn)印（300 mA，120 min）到 PVDF 膜上。5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白室溫封閉1 h。洗膜后加入Ⅰ抗，4℃孵育過夜。Ⅱ抗（1∶3 000）孵育1.5 h 后洗膜，加入ECL 發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)照相，用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次。應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TGF-β1促進(jìn)三維培養(yǎng)95D細(xì)胞EMT

倒置熒光顯微鏡結(jié)果顯示，三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞呈聚集生長，細(xì)胞無偽足，細(xì)胞球表面較為光滑，細(xì)胞球之間存在明顯的界限；當(dāng)加入TGF-β1 后，原本表面緊實(shí)的細(xì)胞球出現(xiàn)了細(xì)胞離散、遷移，見圖1。

掃描電鏡結(jié)果顯示，三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞呈球形生長，細(xì)胞球表明圓滑，而在TGF-β1 刺激后，細(xì)胞球出現(xiàn)了塌陷，細(xì)胞間的黏附不再緊密，底部細(xì)胞有細(xì)小偽足出現(xiàn)，細(xì)胞向周圍遷移，見圖2。

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，TGF-β1刺激后E-cadherin 蛋白表達(dá)無明顯變化，而N-cadherin 和vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，見圖3。

Western blot 顯示，TGF-β1 刺激后 E-cadherin 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），而N-cadherin 和vimentin 蛋白表達(dá)上調(diào)（均P＜0.01），見圖4。

Figure 1.The effect of TGF-β1 on the morphological changes of three-dimensionally cultured 95D cells observed by inversed fluorescence microscopy（scale bar=200 μm）.A：control group；B：TGF-β1 group.圖1 倒置熒光顯微鏡觀察TGF-β1 對(duì)三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 3.The effect of TGF-β1 on the protein expression in three-dimensionally cultured 95D cells observed by laser confocal microscopy（scale bar=100 μm）.A，D：E-cadherin；B，E：N-cadherin；C，F(xiàn)：vimentin.A～C：control group；D～F：TGF-β1 group.圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察TGF-β1 對(duì)三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

2 LY294002 和 rapamycin 逆轉(zhuǎn) TGF-β1 誘導(dǎo)的三維培養(yǎng)95D細(xì)胞EMT

熒光倒置顯微鏡觀察顯示，PI3K 抑制劑LY294002 及 mTOR 抑制 劑 rapamycin 可顯 著 抑制TGF-β1刺激后細(xì)胞球的離散和遷移，見圖5。

Figure 4.The effect of TGF-β1 on the protein expression in three-dimensionally cultured 95D cells detected by Western blot.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs control group.圖4 Western blot檢測(cè)TGF-β1對(duì)三維培養(yǎng)95D細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

Figure5.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced mesenchymal phenotype of three-dimensionally cultured 95D cells.A：control group；B：TGF-β1 group；C：TGF-β1+LY294002 group；D：TGF-β1+rapamycin group.Scale bar=200 μm.圖5 LY294002和rapamycin逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)三維培養(yǎng)95D細(xì)胞的間充質(zhì)表型

Western blot 結(jié)果顯示，與 control 組比較，TGF-β1 處理三維培養(yǎng)95D細(xì)胞可誘導(dǎo)AKT和mTOR磷酸化水平升高（P＜0.05），同時(shí)E-cadherin 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與TGF-β1 組比較，LY294002 可抑制 AKT 和 mTOR 磷酸化（P＜0.05），上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)（P＜0.05），下調(diào) N-cadherin 和 vimentin 表達(dá)（P＜0.01）；與 TGF-β1 組比較，rapamycin 不能抑制 AKT 磷酸化（P＞0.05），但可抑制 mTOR 磷酸化（P＜0.01），上調(diào) E-cadherin 蛋白表達(dá)（P＜0.05），下調(diào) N-cadherin 和 vimentin表達(dá)（P＜0.01），見圖6。

3 LY294002 和 rapamycin 逆轉(zhuǎn) TGF-β1 誘導(dǎo)的三維培養(yǎng)95D細(xì)胞順鉑抗性

MTT 結(jié)果表明，TGF-β1 可增強(qiáng)三維培養(yǎng) 95D 細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗，而LY294002 和rapamycin 可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象；計(jì)算 IC50值顯示，與 TGF-β1 組［（8.42±0.61）μmol/L］相比，空白組［（6.12±0.54）μmol/L］、LY294002 組［（6.34±0.28）μmol/L］和 rapamycin 組［（6.56±0.03）μmol/L］95D 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性均較高（P＜0.01），見圖7。

討 論

肺癌已成為死亡率最高的腫瘤，轉(zhuǎn)移和耐藥是肺癌治療失敗的重要原因之一，而EMT 與此密切相關(guān)［6］。目前關(guān)于EMT 的研究基本停留在二維細(xì)胞培養(yǎng)模型層面，與二維模型相比，三維培養(yǎng)可以更好地模擬腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，提供更準(zhǔn)確的擴(kuò)散率和細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征［7］。從本質(zhì)上講，三維培養(yǎng)具有與體內(nèi)相似的腫瘤條件。例如，它們表現(xiàn)出缺氧區(qū)、靜止區(qū)（干細(xì)胞樣）和增殖細(xì)胞區(qū)、電化學(xué)梯度以及細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-微環(huán)境相互作用，這與實(shí)體腫瘤微環(huán)境相似［8］。

三維培養(yǎng)條件下EMT發(fā)生時(shí)細(xì)胞形態(tài)是與二維培養(yǎng)不同。EMT 發(fā)生后，細(xì)胞球可長出鹿角樣和樹枝樣的“觸角”，這些“觸角”是由多個(gè)細(xì)胞構(gòu)成管狀三維結(jié)構(gòu)，可向周圍侵襲生長［9］。在蛋白表達(dá)方面雖也表現(xiàn)為E-cadherin 下調(diào)，vimentin 和N-cadherin等蛋白上調(diào)，但與二維培養(yǎng)條件下發(fā)生的EMT相比，同種細(xì)胞在三維培養(yǎng)條件下發(fā)生EMT時(shí)表現(xiàn)出偏向于上皮形態(tài)，即更高的E-cadherin 和更低的vimentin表達(dá)，并且具有類似腫瘤干細(xì)胞的特性，這種特性是二維培養(yǎng)細(xì)胞不具備的［10］。

Figure 6.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transformation and activation of PI3K/AKT/mTOR pathway in three-dimensionally cultured 95D cells.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TGF-β1 group.圖6 LY294002和rapamycin逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的三維培養(yǎng)95D細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及PI3K/AKT/mTOR 通路活化

三維培養(yǎng)條件下構(gòu)建EMT 模型的報(bào)道極少，主要受培養(yǎng)方法、生物材料和細(xì)胞本身對(duì)三維環(huán)境及誘導(dǎo)因子敏感性等因素的影響，因此構(gòu)建EMT 模型較難。例如Pal 等［11］觀察不同生物材料對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT 的誘導(dǎo)作用，結(jié)果顯示細(xì)胞接種在聚乳酸-乙醇酸［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］和明膠甲基丙烯酰胺（gelatin methacrylamide，GelMA）混合材料支架后，相比單用這兩種材料更易誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。Essid等［12］采用無血清懸浮培養(yǎng)方法獲得腫瘤細(xì)胞球，再用EGF 和FGF 等細(xì)胞因子和低氧條件誘導(dǎo)頭頸部鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT，而常氧和正常血清條件可逆轉(zhuǎn)EMT 過程。然而上述實(shí)驗(yàn)方法構(gòu)建EMT模型耗時(shí)較長，需3～14 d，過程也較為繁瑣，此外上述研究多集中在細(xì)胞表型、蛋白表達(dá)，對(duì)功能及相關(guān)信號(hào)通路的研究較少。本研究期望采用一種快速、簡便的方法構(gòu)建體外肺癌三維EMT 模型，并對(duì)其表型、蛋白表達(dá)以及功能、信號(hào)通路進(jìn)行研究。我們前期在3D 打印支架上培養(yǎng)肺癌95D 細(xì)胞可快速構(gòu)建體外肺癌三維模型［5］，可在該研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索EMT及藥敏的分子機(jī)制。

Figure 7.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced resistance to cisplatin in three-dimensionally cultured 95D cells.A：the cell viability was detected by MTT assay；B：the IC50 values of each group.Mean±SD. n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TGF-β1 group.圖7 LY294002和rapamycin逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的三維培養(yǎng)肺癌95D細(xì)胞順鉑抗性

我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，95D 細(xì)胞在二維培養(yǎng)條件下，對(duì)TGF-β1 刺激無反應(yīng)，但在三維培養(yǎng)條件下有明顯反應(yīng)，12 h 即可觀察到細(xì)胞球離散現(xiàn)象，這表明三維環(huán)境可改變細(xì)胞的生物學(xué)行為。在加入TGF-β1 刺激 3 d 后，三維培養(yǎng) 95D 細(xì)胞球出現(xiàn)了明顯的塌陷，細(xì)胞球中的細(xì)胞發(fā)生離散、遷移。電鏡檢測(cè)，加入TGF-β1 刺激后，細(xì)胞球底部的細(xì)胞生長出偽足，并向周圍遷移。進(jìn)一步用Western blot 驗(yàn)證顯示，TGF-β1 刺激后的三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞出現(xiàn)了E-cadherin 下調(diào)，N-cadherin 和 vimentin 上調(diào)，表明確實(shí)發(fā)生了EMT，與激光共聚焦觀察到的結(jié)果基本一致。

既往研究表明，PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路與腫瘤EMT 及耐藥密切相關(guān)［13］，但在三維培養(yǎng)條件下是否有影響需進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EMT組的p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而加入PI3K及mTOR抑制劑后，p-AKT、pmTOR 蛋白表達(dá)較EMT明顯下降，并且EMT被逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為 E-cadherin 上調(diào)，N-cadherin 和 vimentin 下調(diào)，細(xì)胞球未出現(xiàn)細(xì)胞離散現(xiàn)象。這表明TGF-β1 誘導(dǎo)三維培養(yǎng)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT 可能是通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。MTT 結(jié)果顯示，發(fā)生EMT 的三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著低于對(duì)照組，而加入PI3K及mTOR抑制劑后，可重新增強(qiáng)三維培養(yǎng)95D 細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，進(jìn)一步凸顯了PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在三維培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)藥物抵抗機(jī)制中的作用。

綜上所述，本研究在3D 打印技術(shù)構(gòu)建體外肺癌三維模型基礎(chǔ)上利用TGF-β1 成功將其誘導(dǎo)為EMT模型，該方法具有簡單、快速成型、條件可控等特點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT及對(duì)順鉑抵抗可能是通過PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。這一新型的體外腫瘤模型可為腫瘤轉(zhuǎn)移和藥敏研究提供有力工具。