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    p300/p53/Smad3通路參與人心房成纖維細胞衰老相關(guān)心房纖維化*

    2021-02-05 01:02:24賴穎瑜高小燕周慧珊王釗煜彭德威鄧春玉
    中國病理生理雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:姜黃纖維細胞代數(shù)

    賴穎瑜 , 高小燕 , 周慧珊 , 李 昕 , 王釗煜 ,彭德威 , 饒 芳 △, 鄧春玉 ,3△

    (1南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,廣東廣州510515;2廣東省心血管病研究所心內(nèi)科,廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部,廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,廣東廣州510080;3華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510006)

    衰老是隨著壽命增長所發(fā)生的一個不可避免的過程,而心房纖顫(簡稱房顫,atrial fibrillation,AF)是臨床上最常見的心律失常之一,也是一種“老年病”,其發(fā)病率隨年齡增長而增加,但目前治療效果仍不理想,其發(fā)病機制需要深入研究。心房結(jié)構(gòu)重塑是AF 的主要發(fā)病機制之一,心房纖維化是其主要特征。研究表明衰老與心房纖維化密切相關(guān),與年齡較大者(>70歲)相比,年齡較小者(<50歲)右心耳纖維化明顯減少,年齡是影響纖維化發(fā)生的主要因素之一[1]。在快速起搏誘發(fā)AF 的動物模型中發(fā)現(xiàn),與成年組相比,老年犬左心房纖維化更嚴重[2],但衰老相關(guān)心房纖維化的具體分子機制尚未完全闡明。

    轉(zhuǎn)錄輔激活因子p300 是一種細胞內(nèi)普遍存在的核磷酸蛋白,具有內(nèi)在的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,在細胞增殖,凋亡和胚胎發(fā)育中都發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),p300參與纖維化,如在特發(fā)性肺纖維化患者的肺成纖維細胞中,p300 明顯上調(diào),而抑制p300 能減輕纖維化[4-5];p300 還影響細胞衰老,研究顯示在微血管內(nèi)皮細胞中,高糖誘導(dǎo)的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,Sirt1)下調(diào),p300 表達上調(diào),導(dǎo)致細胞快速衰老[6]。我們的前期研究結(jié)果也顯示,p300 隨著體外培養(yǎng)的小鼠心臟成纖維細胞衰老而升高,伴隨有纖維化指標的增加[7]。因此,p300可能參與心臟衰老相關(guān)纖維化的病理過程。

    Smads 是纖維化通路的重要信號分子[8],衰老通路中的重要因子p53 也與纖維化相關(guān)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn),在人腎小管上皮細胞株HK-2 和角化細胞株Ha-CaT中,轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β 1,TGF-β1)通過調(diào)控p53 活性進而促進 p53 與Smads相互作用,隨后結(jié)合到纖溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)啟動子上,導(dǎo)致纖維化[11]。而 p300 可通過乙?;{(diào)控 p53[12]。這些研究提示,p300 可通過調(diào)控p53,促進p53-Smad3相互作用進而參與衰老相關(guān)纖維化。

    因此,本研究采用人心房成纖維細胞(human atrial fibroblasts,HAFs)作為研究對象,通過傳代建立細胞衰老模型,比較不同代數(shù)的細胞中p300、p53、Smad3 和其他衰老及纖維化相關(guān)因子的變化,并通過干預(yù)p300 的表達,觀察其對p53 和Smad3 等衰老和纖維化指標的影響,探索p300 在衰老相關(guān)纖維化中的作用及其可能機制,以期發(fā)現(xiàn)治療衰老相關(guān)心房纖維化的新靶點。

    材 料 和 方 法

    1 患者組織標本

    本研究收集患者于心臟體外循環(huán)手術(shù)中或經(jīng)胸腔鏡AF 外科消融手術(shù)中需切除的心耳組織,分離培養(yǎng)原代心房成纖維細胞并進行傳代培養(yǎng)。所有患者均簽署知情同意書,并獲廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)倫理委員會批準,批準號為No.GDREC2016128H。有肺炎或者其他感染性疾病的患者不入選。

    2 試劑

    特級澳洲胎牛血清和0.25% 胰蛋白酶-EDTA(Gibco);成纖維細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(fibroblast basal medium,F(xiàn)BM)(Lonza);p300 小發(fā)卡(small-hairpin,sh)RNA 質(zhì)粒和 p300 過表達質(zhì)粒 pCMV p300 CHA(吉凱基因);Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen);姜黃素(Cayman);蛋白 Marker(Fermentas);4×蛋白上樣緩沖液(BIO-RAD);RIPA 裂解液(強)(Beyotime);抗p300 抗體(Millipore);抗I 型膠原蛋白α1 鏈(collagen type I α1 chain,Col1A1)抗體和抗Ⅲ型膠原蛋白α1 鏈(collagen type Ⅲ α1 chain,Col3A1)抗體(Abcam);抗基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase-2/9,MMP-2/9),p21 和 p16 抗體(Santa Cruz);抗p53,Smad3,p-Smad3,GAPDH,PAI-1 和 TGF-β 抗體及衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated βgalactosidase,SA-β-Gal)染色試劑盒(Cell Signaling Technology);其他生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

    3 方法

    3.1 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 人心耳組織經(jīng)PBS 漂洗后去除多余脂肪組織和內(nèi)外膜,加入幾滴FBM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),細剪成約1 mm ×1 mm ×1 mm 小塊,用吸管將組織塊均勻涂布于25 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面上,靜置約15 min,輕翻培養(yǎng)瓶從側(cè)面加入4 mL FBM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),培養(yǎng)面朝上于37 ℃,5%CO?的培養(yǎng)箱中靜置2 h,組織塊貼牢后,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)面朝下放置使培養(yǎng)基浸過所有組織塊,繼續(xù)培養(yǎng)。每隔5 d換液,待細胞游離、生長至基本融合成片達瓶底80%后,進行消化傳代。傳代至P3 和P7 的細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中,待細胞密度達70%~80%,使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒按說明操作進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒稀釋液:125 μL Op-ti-MEM 培養(yǎng)基稀釋 2.5 μg 質(zhì)粒和 5 μL P3000 試劑,輕輕混勻;脂質(zhì)體稀釋液:125 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋 6 μL Lipofectamine 3000 試劑,高速震蕩 3 s 混勻。然后將這兩份分別含有質(zhì)粒和脂質(zhì)體的溶液混合,輕輕混勻,室溫孵育15 min,均勻滴加到細胞新鮮更換的1 mL FBM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中,輕輕搖勻,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2~3 d。

    3.2 SA-β-Gal 染色 β-半乳糖苷酶是衰老細胞的標志物。將細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中,待密度達到50%~70%,按試劑盒操作說明進行SA-β-Gal 染色。棄培養(yǎng)基后用PBS 漂洗1 次。加入固定液室溫固定15 min,去除固定液后PBS 漂洗2次。按照說明配制染色液,調(diào)節(jié)pH 值為6,每孔加1 mL 染色液,密封,于37 ℃,無CO2的干燥恒溫箱孵育過夜。在顯微鏡下觀察,核周藍染的即為衰老細胞。

    3.3 Western blot實驗 細胞棄去培養(yǎng)基,PBS洗3次后加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液(強),冰上裂解5 min,用刮刀刮細胞,用移液槍收集細胞混合物至 EP 管中,冰上繼續(xù)裂解 20 min。4 ℃,12 000 r/min 離心15 min,取上清分裝至EP 管,儲存于-80 ℃。BCA法測定蛋白濃度。加入4×蛋白上樣緩沖液稀釋30 μg 蛋白,55 ℃煮 10 min。行 8%~10% SDS-PAGE分離蛋白樣品,轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。蛋白面向上用5%脫脂牛奶于室溫封閉1 h。TBST 洗3 次,每次5 min。加入稀釋好的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜,TBST 洗3次,每次5 min。加入稀釋好的Ⅱ抗室溫孵育1 h,TBST 洗3 次,每次5 min。蛋白面朝上均勻滴加ECL孵育30 s,平鋪在托盤上送入機器自動曝光。

    3.4 細胞免疫熒光染色 待細胞密度達到70%~80%時,用預(yù)溫PBS 洗2 次。4%多聚甲醛固定15 min,PBS 浸洗 3 次,每次 10 min。0.2% TritonX-100通透20 min,4%BSA 封閉30 min,去除封閉液直接滴加稀釋好的Ⅰ抗放入濕盒,4 ℃孵育過夜。PBS 浸洗3 次,每次10 min。滴加稀釋好的熒光Ⅱ抗,濕盒中避光室溫孵育45 min。PBS 浸洗3 次,每次10 min。避光滴加封片劑(含DAPI)后在熒光顯微鏡下觀察。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 分析處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。兩組間比較用t檢驗。多組間比較用單因素方差分析,各組均數(shù)的兩兩比較采用 LSD-t或 SNK-q檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 不同代數(shù)人心房成纖維細胞SA-β-Gal 染色結(jié)果以及p300、p53 和Smad3 等衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的變化

    體外培養(yǎng)的HAFs 連續(xù)傳代至P11 代,行Western blot 檢測不同代數(shù)(P3、P7 和P11)細胞的 p300、p53和Smad3等衰老和纖維化相關(guān)因子的蛋白水平,結(jié)果如圖1A、1B所示,隨著細胞代數(shù)增加,p300和衰老相關(guān)因子p53表達水平逐漸升高,以P11代細胞最高(P<0.05;P<0.01)。與P3 代細胞相比,P7 代細胞的p21 和p16 表達水平都明顯升高(P<0.01),且p16在P11 代達最高水平(P<0.01)。Smad3 是公認的促纖維化因子,隨著細胞傳代,總Smad3 有下降趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義,p-Smad3 的蛋白水平在P7 和P11代細胞中均明顯增高(P<0.05),其他纖維化指標MMP-2/9 和PAI-1 表達均隨著代數(shù)逐漸增加,以P11代細胞最高(P<0.01),但Col1A1和Col3A1的表達在各組間無明顯差異,TGF-β 在P11 代細胞中表達較P3 和P7 有所下降,但無統(tǒng)計學(xué)差異。另外,分別取P3、P7和P11代細胞進行SA-β-Gal染色,觀察細胞衰老情況,結(jié)果如圖1C 所示,隨著傳代代數(shù)增加,核周藍染的衰老細胞逐漸增加(P<0.01)。由此可見,隨著 HAFs 衰老,p300 和 p53 表達增加,Smad3 被激活,一些纖維化相關(guān)因子表達增加。

    2 姜黃素處理高代數(shù)人心房成纖維細胞對衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的影響

    為了進一步探索p300 在HAFs 衰老以及衰老相關(guān)的纖維化中的作用,我們給予不同濃度(6、9 和12 μmol/L)的 p300 抑制劑姜黃素處理高代數(shù)(P7)HAFs,使用 Western blot 檢測細胞中 p300、p53 和Smad3 以及其他衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的變化。結(jié)果如圖2 所示,不同濃度姜黃素處理后,P7 代細胞的p300 水平呈現(xiàn)濃度依賴性下降(P<0.05),以12 μmol/L 濃度處理組達最低水平(P<0.01);衰老相關(guān)指標p53、p21 及p16 表達水平也呈逐漸下降趨勢,Smad3 及p-Smad3 的蛋白水平明顯下降,以高濃度處理組下降最為明顯(P<0.05);其他纖維化指標Col1A1、MMP-2、TGF-β 和PAI-1 在高濃度姜黃素(12 μmol/L)處理后,亦明顯下降(P<0.05;P<0.01);而Col3A1 和MMP-9 的蛋白水平也有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。因此,p300 抑制劑姜黃素處理抑制高代數(shù)HAFs的p300,可明顯降低衰老和部分纖維化因子的蛋白水平,提示p300 在HAFs 衰老和纖維化中發(fā)揮著重要作用。

    3 敲減p300 的表達對高代數(shù)人心房成纖維細胞衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的影響

    為了確定p300 在HAFs 衰老相關(guān)的纖維化中發(fā)揮的關(guān)鍵作用,我們對高代數(shù)(P7)細胞進行p300 shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲減p300的表達,觀察衰老和纖維化相關(guān)因子的變化,結(jié)果如圖3 所示。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后p300 的表達水平下降(P<0.05),伴隨p53、Smad3 及p-Smad3 的蛋白水平顯著降低(P<0.01),同時其他纖維化相關(guān)指標如Col1A1、Col3A1 和MMP-2 的蛋白水平也降低(P<0.05;P<0.05),MMP-9、TGF-β 和PAI-1 水平也有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。由此說明,敲減HAFs 的p300表達可以抑制衰老及纖維化相關(guān)因子的分泌。

    Figure 1.The results of SA-β-Gal staining and the protein expression levels of p300,senescence and fibrosis associated proteins in human atrial fibroblasts of different passages.A:the protein levels of p300,Smad3/p-Smad3,p53/p21 and p16;B:the protein expression of Col1A1/3A1,MMP-2/9,TGF-β and PAI-1;C:the images of SA-β-Gal staining(×100)and SA-β-Gal positive rate of HAFs at passage 3,passage 7 and passage 11,respectively.Mean±SEM. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs P3 group.圖1 不同代數(shù)人心房成纖維細胞SA-β-Gal染色結(jié)果及p300、衰老和纖維化相關(guān)蛋白的表達水平

    Figure 2.Effect of curcumin on the expression of p300,senescence and fibrosis associated proteins in human atrial fibroblasts of passage 7.A:the protein levels of p300,Smad3/p-Smad3,p53/p21 and p16 before and after treated with curcumin of different concentrations(6,9 and 12 μmol/L);B:the protein expression of Col1A1/3A1,MMP-2/9,TGF-β and PAI-1 before and after treated with curcumin.Mean±SEM. n=4.*P<0.05,**P<0.01 vs DMSO group.圖2 姜黃素處理對人心房成纖維細胞p300及衰老和纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

    4 人心房成纖維細胞過表達p300 對衰老和纖維化相關(guān)蛋白水平的影響

    對低代數(shù)(P3)HAFs進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達p300,觀察衰老和纖維化相關(guān)指標的變化,結(jié)果如圖4 所示,轉(zhuǎn)染后p300 的表達顯著增加(P<0.05),p53 和Smad3 的水平也明顯升高(P<0.05),纖維化指標MMP-2的水平也隨p300而增加(P<0.05),而Col1A1無明顯變化。此部分研究結(jié)果顯示,低代數(shù)的HAFs過表達p300,可促進衰老和纖維化相關(guān)因子的分泌。

    討 論

    以上研究結(jié)果表明,隨著HAFs 衰老,p300 及其他衰老和纖維化相關(guān)因子水平升高;姜黃素處理或p300 shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲減p300的表達可降低p53和Smad3 的表達,抑制細胞衰老和纖維化相關(guān)因子分泌;而過表達p300 則可促進細胞衰老和纖維化相關(guān)因子分泌,說明p300 在HAFs 衰老相關(guān)纖維化中起重要作用,可能通過調(diào)控p53/Smad3通路參與其相關(guān)病理機制。

    心臟纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程,相關(guān)病理因素包括,遺傳因素,代謝障礙,肥胖和高血壓等。近年來研究表明,除卻病理因素,衰老亦會導(dǎo)致心肌細胞外基質(zhì)的改變,如心臟成纖維細胞的增殖和膠原蛋白含量增加,交聯(lián)增強,導(dǎo)致心臟順應(yīng)性下降[13]。AF 的主要病理機制包括心房肌細胞的電重塑和結(jié)構(gòu)重塑,心房纖維化是結(jié)構(gòu)重塑的主要表現(xiàn)。而進行性心房纖維化亦與心臟衰老相關(guān)[14],與年幼大鼠相比,老年大鼠的左房纖維化增加,且具有更高的 AF 誘發(fā)性[15]。因此,AF 的發(fā)生率隨年齡的增長而增加,與增齡相關(guān)的心房纖維化有關(guān),心房組織呈現(xiàn)年齡依賴的間質(zhì)纖維化,心肌細胞間的電通訊受阻,異位或折返活動的可能性增加,使老年人容易發(fā)生AF[15]。目前雖然衰老相關(guān)的心房纖維化研究已獲關(guān)注,但其相關(guān)機制尚未得到很好闡明。因此,本研究以HAFs 為研究對象通過傳代建立復(fù)制性細胞衰老模型,探究其相關(guān)機制。

    轉(zhuǎn)錄輔激活因子p300 是體內(nèi)重要的表觀遺傳調(diào)控分子,具有內(nèi)的在乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,可通過乙?;M蛋白和非組蛋白參與調(diào)控多種基因的表達[3,16]。研究表明,p300 可調(diào)控膠原蛋白表達,促進纖維化,如在糖尿病大鼠心肌肥厚模型中,p300 通過調(diào)控 Smad2 乙?;?,增加 TGF-β 活性,促進膠原合成,導(dǎo)致心肌纖維化和肥厚[17];p300 HAT 特異性抑制劑—L002 在體內(nèi)和體外均能有效抑制纖維化反應(yīng),如減弱體外培養(yǎng)的人心臟成纖維細胞分化,增殖,遷移及膠原合成能力,逆轉(zhuǎn)高血壓誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化和肥大[18-19]。雖然,直接關(guān)注p300 在細胞衰老中作用的研究不多,但在人原代包皮成纖維細胞中發(fā)現(xiàn),p300 對原癌基因Ras誘導(dǎo)的細胞早衰至關(guān)重要,抑制p300 活性可阻止p53 活化,有助于腫瘤轉(zhuǎn)移中的衰老逃逸[20]。而在人臍帶來源的間充質(zhì)基質(zhì)細胞中,敲減p300的表達或抑制其乙酰轉(zhuǎn)移酶活性將誘導(dǎo)細胞早衰并降低增殖潛能,提示p300 通過激活p53/p21 信號途徑,在誘導(dǎo)細胞衰老過程中起重要作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn),p300 的表達水平隨著HAFs 傳代代數(shù)的增加而升高,同時伴隨其他衰老和纖維化相關(guān)因子增加。姜黃素處理或p300 shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲減p300的表達可抑制衰老信號通路和纖維化因子分泌,而過表達p300 則相反。由此證實p300 在HAFs 衰老相關(guān)纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

    本研究還對p300 參與衰老相關(guān)纖維化的分子機制進行初步探索。p53 是一種序列特異性DNA 結(jié)合蛋白,是調(diào)控細胞增殖,凋亡和衰老的重要轉(zhuǎn)錄激活子[22]。乙?;钦{(diào)控p53 功能的關(guān)鍵共價修飾,乙酰轉(zhuǎn)移酶p300 介導(dǎo)的p53 乙?;粌H可增加其蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性,還可以增強其反應(yīng)性基因,如細胞周期依賴性激酶抑制劑p21等的啟動子激活促進細胞周期停滯或衰老[23],這可能是p300 參與細胞衰老的重要途徑。有研究發(fā)現(xiàn),高糖刺激可通過Sirt1/p300/p53/p21 途徑誘導(dǎo)持續(xù)的內(nèi)皮細胞衰老[24]。同時,p53與Smad3都是纖維化反應(yīng)的效應(yīng)因子[25],在 TGF-β1 刺激腎纖維化中 p53 與 Smad3 有明顯協(xié)同作用,p53 通過與受體激活的Smads 結(jié)合而充當(dāng)TGF-β1 誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑中的輔助因子和TGF-β1 纖維化反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子[26],促進腎纖維化疾病進展。本研究中也發(fā)現(xiàn),p300 隨著細胞傳代而增加,且在過表達p300 時,p53 和Smad3 的活性隨之增加,并伴隨纖維化因子增加;降低p300水平后,p53 和Smad3 的水平也下降,同時纖維化因子分泌減少。因此,p300可能通過調(diào)控p53和Smad3參與衰老相關(guān)纖維化。

    Figure 3.The protein levels of senescence and fibrosis associated proteins in human atrial fibroblasts of passage 7 after p300 shRNA transfection.The protein levels of p300,p53,Smad3/p-Smad3,Col1A1/3A1,MMP-2/9,TGF-β and PAI-1 in passage 7 HAFs after transfected with p300 shRNA plasmid were determined by Western blot.Mean±SEM. n=4.*P<0.05,**P<0.01 vs control group.圖3 高代數(shù)(P7)人心房成纖維細胞敲減p300的表達對衰老和纖維化相關(guān)蛋白表達的影響

    Figure 4.The protein levels of senescence and fibrosis associated proteins in human atrial fibroblasts of passage 3 after p300 over-expression.The protein levels of p300,p53,Smad3,Col1A1 and MMP-2 in passage 3 HAFs after transfected with p300 over-expression plasmid were determined by Western blot.Mean±SEM.n=4.*P<0.05 vs vector control group.圖4 低代數(shù)(P3)人心房成纖維細胞過表達p300對衰老和纖維化相關(guān)因子表達的影響

    此外,本研究具有以下局限性:雖然我們發(fā)現(xiàn)敲減p300的表達可明顯降低纖維化相關(guān)因子,如Col 1A1/3A1 和 MMP-2 的 表 達 ,同 時 p53 和 Smad3/p-Smad3 的水平亦明顯降低,而p300 過表達后p53 和Smad3 水平明顯升高,纖維化指標MMP-2 的表達亦明顯增加,但對Col 1A1 的表達無明顯影響。其原因可能是因為本研究中的HAFs來源于人體心房組織,均為接受心臟手術(shù)的患者,其心房可能均有一定程度的病理改變,在這個基礎(chǔ)上分離的心房成纖維細胞可能已有一定程度的纖維化,導(dǎo)致其膠原的表達已經(jīng)比較高,故過表達p300 不能使膠原合成進一步增加。

    綜上所述,本研究初步證實p300 可能通過激活p53/Smad3 通路參與人心房成纖維細胞衰老相關(guān)心房纖維化,最終導(dǎo)致AF的發(fā)生和發(fā)展。

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