人工合成的亞硝基化合物MNNG 致人胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立及機制分析

王霞，葉景鴻，許尤琪

南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（江蘇省第二中醫(yī)院），南京210017

胃癌的病因復(fù)雜，其中飲食習(xí)慣是一個相當(dāng)重要的影響因素。在中國人偏愛的腌制食品中含有大量亞硝胺類化合物，而亞硝胺類化合物是胃癌發(fā)生的高危因素。N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）是人工合成的亞硝基化合物，常作為典型的模式化學(xué)誘變劑和致癌劑用于研究N-亞硝基類致癌物的致癌機制。我們前期的研究證實，MNNG 能誘導(dǎo)大鼠胃癌前病變的發(fā)生，是研究天然植物預(yù)防胃癌的最常用致癌劑［1］。人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 具有正常人胃上皮細(xì)胞的特性和功能，可以在體外穩(wěn)定傳代，常被用于研究胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化以及胃癌的發(fā)生。2017 年7 月—2018 年7 月，我們采用MNNG誘導(dǎo)GES-1 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，觀察其對GES-1 細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力的影響，探討MNNG構(gòu)建胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的可行性及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 人胃黏膜上皮細(xì)胞GSE-1由酶聯(lián)生物公司提供。MNNG（士鋒生物），RNA 提取試劑（康為世紀(jì)），RIPA 細(xì)胞裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），PVDF 膜（Millipore），超敏發(fā)光液（賽默飛），小鼠抗人GAPDH 單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（中杉金橋，1∶2 000），兔抗人LC3Ⅱ多克隆抗體（博奧森生物，1∶1 000），兔抗人Beclin1 多克隆抗體（Abcam 公司，1∶2 000）。顯微鏡（OLYMPUS），CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），熒光PCR 儀、超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)［伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］，蛋白垂直電泳儀（北京市六一儀器廠），倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取GES-1 細(xì)胞，加入DMEM 培養(yǎng)液，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時，PBS沖洗，加入0.25%胰酶消化。收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心3 min，棄上清液，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入6孔板中，加入10%DMEM調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/孔，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組與處理 待細(xì)胞完全貼壁后，將細(xì)胞分為空白對照組、溶劑對照組和MNNG 誘導(dǎo)組。MNNG 加入適量DMSO 溶解，配成0.17 mmol/L 的MNNG溶液，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成2 μmol/L 的MNNG 溶液?？瞻讓φ战M正常培養(yǎng)，MNNG 誘導(dǎo)組用含2 μmol/L MNNG 的培養(yǎng)液培養(yǎng)，溶劑對照組加入等體積的DMSO［2］。持續(xù)4 周，其間正常傳代培養(yǎng)；第5周觀察細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化情況。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 采用伊紅染色。向細(xì)胞中加入細(xì)胞固定液固定15 min，PBS浸洗3次。蘇木精染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，返藍(lán)液返藍(lán)15 s，流水沖洗。伊紅染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，超凈高級封片膠，200倍顯微鏡下觀察。

1.5 細(xì)胞增殖能力觀察 采用平板克隆實驗。取細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入0.25%胰蛋白酶消化，離心，制成細(xì)胞懸液，按3×102/孔接種于6 孔板中。加入20% DMEM 培養(yǎng)10 d，待集落形成后，棄培養(yǎng)液，PBS浸洗，加入甲醇—醋酸固定液（甲醇∶醋酸=3∶1）固定15 min。棄固定液，加入Giemsa 染液染色10～30 min，流水洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置，疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，在倒置顯微鏡（×100）下計數(shù)大于10個細(xì)胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.6 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實驗。取細(xì)胞加入6 孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到90%以上。使用無菌10 μL槍頭沿6孔板底部做“一”形劃痕，保證每孔寬度盡量一致。棄培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次，換成無血清培養(yǎng)基后拍照。將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于24、48 h 時再次拍照。根據(jù)0、24、48 h 的劃痕寬度計算24 h 和48 h 的細(xì)胞遷移速度，細(xì)胞遷移速度=遷移距離/遷移時間。

1.7 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin1 表達(dá)檢測采用Western blotting 法。取細(xì)胞加入裂解液，冰上裂解30 min 后，4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，獲得總蛋白。BCA 法測定總蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸使蛋白變性。取總蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，4%脫脂奶粉封閉。加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1～2 h。滴加ECL曝光液，凝膠成像系統(tǒng)中曝光。采用Quantity One 軟件分析抗體條帶灰度值。以目標(biāo)條帶與內(nèi)參的灰度比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表達(dá)檢測 采用熒光定量PCR 法。提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板，在熒光定量PCR 儀上進行擴增。擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下：LC3 Ⅱ上游引物5"-AGCAGCATCCAACCAAAAT-3"，下游引物5"-CGTCTCCTGGGAGGCATA-3"，產(chǎn)物長度281 bp；Beclin1 上游引物5"-AAAACCAGATGCGTTATGCC-3"，下游引物5"-CAGCCTGAAGTTATTGATTGTG-3"，產(chǎn) 物 長 度 為119 bp。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：RNase Free dH2O 9.5 μL，cDNA/DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×ULtra SYBR Mixture 12.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃10 min，變性95 ℃10 s，退火57 ℃30 s，延伸72 ℃30 s；循環(huán)40 次。以GAPDH 為內(nèi)參，計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.9 裸鼠成瘤情況觀察 取4～6 周齡裸鼠15 只，隨機分成3 組，每組各5 只。取空白對照組、溶劑對照組和MNNG 誘導(dǎo)組細(xì)胞株，加入0.25%胰酶消化，PBS離心洗滌，配制成細(xì)胞密度為5×106/mL的細(xì)胞懸液。取0.2 mL 細(xì)胞液（約1×106個細(xì)胞），接種于裸鼠右前肢皮下。繼續(xù)飼養(yǎng)4周，每隔4 d測量裸鼠體質(zhì)量，觀察瘤體生長情況。4 周末處死裸鼠，取出瘤體，觀察瘤體情況；行HE 染色，200 倍光鏡下觀察瘤體病理變化。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s 表示，組間兩兩比較采用t 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞形態(tài)改變情況 空白對照組、溶劑對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列有序，多成單層生長，形狀以多邊形為主，MNNG誘導(dǎo)組細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，部分細(xì)胞呈團塊狀生長，部分細(xì)胞呈梭形。HE 染色后，MNNG 誘導(dǎo)組可見核分裂像，多數(shù)細(xì)胞具有單核，也出現(xiàn)多核巨大細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)可見空泡，細(xì)胞周邊毛刺狀。

2.2 三組細(xì)胞增殖能力比較 空白對照組、溶劑對照組、MNNG 誘導(dǎo)組細(xì)胞克隆形成率分別為7.44%± 0.12%、10.12% ± 1.45%、18.61% ± 2.01%，MMNG 誘導(dǎo)組細(xì)胞克隆形成率高于其他兩組（P 均＜0.05）。

2.3 三組細(xì)胞遷移能力比較 24 h時空白對照組、溶劑對照組、MNNG 誘導(dǎo)組細(xì)胞遷移速度分別為（4.84 ± 1.12）、（5.09 ± 1.22）、（5.70 ± 0.27）μm/h；48 h 時三組細(xì)胞遷移速度分別為（6.57 ± 0.93）、（6.21±0.51）、（8.35±0.50）μm/h。MNNG誘導(dǎo)組細(xì)胞遷移率高于空白對照組、溶劑對照組（P均＜0.05）。

2.4 三組細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表達(dá)水平比較 與空白對照組、溶劑對照組比較，MNNG誘導(dǎo)組LC3Ⅱ、Beclin1 蛋白及mRNA 表達(dá)水平均降低（P均＜0.05）。見表1。

2.5 三組細(xì)胞成瘤情況 三組裸鼠均存活，攝食、活動量、精神狀態(tài)正常，體質(zhì)量無明顯變化?？瞻讓φ战M、溶劑對照組未成瘤，MNNG 組成瘤4 只。MNNG 組接種1 周后注射局部可觸及腫物，呈局限膨脹性生長，3 周左右瘤體不再繼續(xù)增大，未觀察到明顯的浸潤或轉(zhuǎn)移灶。瘤體剝離后見完整包膜，血供豐富，表面光滑，邊界清楚。HE染色顯示，腫瘤組織炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，排列不規(guī)整。

表1 三組細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表達(dá)（±s）

表1 三組細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白及mRNA表達(dá)（±s）

注：與MNNG誘導(dǎo)組比較，*P＜0.05。

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3 討論

胃癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時已發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳，晚期胃癌的5年生存率僅為15%左右［3］。研究胃癌發(fā)病的影響因素，對早期預(yù)防胃癌、減少腫瘤相關(guān)死亡具有重要意義。流行病學(xué)資料顯示，亞硝基化合物與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。人體中的亞硝基化合物主要通過亞硝胺腌制和加工的肉制品、其他食物和乙醇飲料以及體內(nèi)細(xì)菌還原硝酸鹽而產(chǎn)生［4］。MNNG 是人工合成的亞硝基化合物，常作為典型的模式化學(xué)誘變劑和致癌劑用于研究N-亞硝基類致癌物的致癌機制［5-7］。本研究結(jié)果顯示，GES-1 細(xì)胞在MNNG 的刺激下，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，細(xì)胞無序化生長，大小不一，排列紊亂，可見多核巨細(xì)胞，成團塊狀生長。細(xì)胞體積增大，周邊可見毛刺狀，胞質(zhì)內(nèi)空泡增多。細(xì)胞集落形成數(shù)增加，克隆形成率增加，證實細(xì)胞的增殖活性增加。細(xì)胞愈合面積變大，表明其遷移能力增強。細(xì)胞形態(tài)向畸形和不規(guī)則改變，細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增強，提示其轉(zhuǎn)化為具有惡性增殖和轉(zhuǎn)移特征的細(xì)胞。

自噬是細(xì)胞維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以進行正常增殖和分化的重要方式，同時也能幫助細(xì)胞度過應(yīng)激狀態(tài)而生存下來。細(xì)胞內(nèi)自噬功能的異?？蓪?dǎo)致腫瘤等一系列疾病的發(fā)生。正常情況下，自噬有利于細(xì)胞保持自穩(wěn)狀態(tài)；發(fā)生應(yīng)激時，自噬防止有毒或致癌物損傷蛋白質(zhì)及細(xì)胞器的積累，抑制細(xì)胞癌變［8］。如細(xì)胞自噬功能缺陷，損傷的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)可以在細(xì)胞內(nèi)積聚，誘發(fā)氧化應(yīng)激、DNA 損傷和染色體不穩(wěn)定等，從而誘導(dǎo)原癌基因突變，增加癌變風(fēng)險［9］。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌前病變期肝細(xì)胞自噬活動降低至正常的50%，肝癌細(xì)胞中自噬降低至正常的20%，胰瘤向胰癌轉(zhuǎn)化過程中自噬活性明顯降低［10］。

微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）是自噬體標(biāo)記蛋白，可作為自噬的檢測標(biāo)志物。細(xì)胞內(nèi)新合成的LC3加工后成為胞質(zhì)可溶形式的LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化修飾和剪切后，結(jié)合自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺，形成自噬體形式的LC3-Ⅱ，細(xì)胞自噬過程進行到自噬泡即將形成閉合結(jié)構(gòu)時，只有膜結(jié)合形式的LC3-Ⅱ定位于自噬泡膜上。因此可以根據(jù)Ⅱ型LC3 表達(dá)的水平或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值判斷細(xì)胞自噬水平［11］。Beclin-1 是自噬核心復(fù)合物中重要的組成部分，在調(diào)節(jié)自噬起始囊泡形成的過程中起關(guān)鍵作用，是自噬第一階段不可或缺的基因［12］，表達(dá)缺失使細(xì)胞自噬活性降低從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常生長［13］。Beclin-1 表達(dá)缺陷能夠降低細(xì)胞的自噬水平，誘導(dǎo)乳腺癌、肝細(xì)胞癌等的癌前病變，更易誘發(fā)腫瘤［14］。實驗證實Beclin-1 在慢性非萎縮性胃炎、癌前病變、胃癌組織中的表達(dá)活性逐漸減弱［15-16］，可以通過促進細(xì)胞凋亡和減少細(xì)胞遷移來抑制胃癌的進展［17］。

裸鼠體內(nèi)腫瘤生長與接種細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MNNG誘導(dǎo)的胃黏膜上皮細(xì)胞不影響裸鼠的生活狀態(tài)，能促進瘤體的發(fā)生，組織學(xué)病理顯示腫瘤組織炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，排列不規(guī)整，這些都和胃癌前期的發(fā)展有相似之處。

本研究利用小劑量MNNG 持續(xù)刺激GES-1細(xì)胞模擬人類攝入亞硝酸鹽類食物，結(jié)果顯示GES-1 細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯增強，發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化；其作用機制可能與細(xì)胞自噬相關(guān)。本研究為后續(xù)研究中藥對胃黏膜細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用機理建立了一個可行的細(xì)胞模型。