金絲桃苷對心力衰竭大鼠肝纖維化的影響及其分子機(jī)制

郭曉，曲鳳霞，辛越，王鑑萌，李海英，馬愛青，趙偉

1 青島阜外心血管病醫(yī)院，山東青島266000；2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院

心力衰竭（以下簡稱心衰）是以急性呼吸困難為癥狀的反復(fù)發(fā)作的心血管疾病，常并發(fā)肝功能紊亂，導(dǎo)致預(yù)后很差，病死率升高［1］。新近研究發(fā)現(xiàn)，心衰與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)［2-3］。TGF-β1/Smad 通路可活化肝星形細(xì)胞并高表達(dá)促纖維化因子［如結(jié)締組織生長因子（CTGF）］，從而加重肝纖維化；而TIMP/MMP 軸則是調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成和降解的分子軸，二者活性失衡是導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)展的重要因素。金絲桃苷是黃酮醇苷類化合物，具有廣泛的藥理作用。其對不同因素導(dǎo)致的肝損傷或肝纖維化均有抑制作用［4-6］。然而，金絲桃苷對心衰引起肝纖維化的作用及其相關(guān)分子機(jī)制尚不明確。2018年6 月—2020 年4 月，我們通過建立大鼠心衰模型，觀察金絲桃苷對大鼠心衰引起肝纖維化的影響，并從TGF-β1/Smad 通路和TIMP/MMP 軸的角度探討其分子機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用金絲桃苷治療心衰引起的肝纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量280～300 g，購自遼寧長生生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22 ± 1）℃、濕度45%～55%，循環(huán)照明12 h/12 h 模擬晝夜，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 金絲桃苷購自美侖生物公司，使用40%乙醇配置成相應(yīng)濃度的溶液；磷鉬酸、酸性品紅、麗春紅購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP、蘇木精、SYBR Green、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京Solarbio 公司；總RNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix 購自天根生化科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、羥脯氨酸（Hyp）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；CTGF、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、內(nèi)參GAPDH抗體購自中國proteintech 公司；p-Smad2/3、Smad2/3抗體購自美國CST 公司；Ⅲ型膠原（collagenⅢ）、金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP1）抗體購自英國Abcam 公司。顯微鏡（OLUMPUS）；紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科）；熒光定量PCR 儀（BIONEER）；多功能酶標(biāo)儀（TECAN）；高分辨率小動物超聲系統(tǒng)（VisualSonics）。

1.2 動物分組與模型建立 參照Garcia 等［7］的腹主動脈—腔靜脈分流術(shù)誘導(dǎo)制作大鼠心衰模型。將大鼠隨機(jī)分為Sham 組、心衰組、100 mg/kg 金絲桃苷組、200 mg/kg 金絲桃苷組，每組各6 只。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定。在腹部正中線偏左行縱切口，分離皮膚、皮下組織、肌肉及腹膜，充分暴露腹主動脈段。心衰組和金絲桃苷組用動脈夾將左腎起始部腹主動脈夾閉，以腹主動脈的左腎動脈起始部至其末端段的下2/3 處之左側(cè)壁為穿刺點(diǎn)，用18 G 針頭以45°角水平穿刺腹主動脈壁，整個針尖部進(jìn)入相鄰的下腔靜脈內(nèi)。固定針頭，縫合腹主動脈左側(cè)壁破口，拔出針頭，打結(jié)，移走動脈夾，觀察到下腔靜脈顏色由暗紅變紅，分流明顯。將腹腔內(nèi)器官復(fù)位，逐層縫合腹肌和皮膚。Sham 組充分暴露腹主動脈段后直接將腹腔內(nèi)器官復(fù)位，逐層縫合。待大鼠完全蘇醒后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3 藥物干預(yù) 100 mg/kg金絲桃苷組和200 mg/kg金絲桃苷組分別給予金絲桃苷100、200 mg/kg灌胃，每天1 次，連續(xù)4 周。Sham 組和心衰組給予等體積乙醇溶液灌胃。

1.4 心功能檢查 最后1 次給藥后，通過面罩吸入異氟烷麻醉，仰臥位固定，使用小動物超聲系統(tǒng)測量心輸出量（CO）、左心室末期舒張壓（LVEDP）、左心室收縮末壓（LVESP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）和最大下降速率（-dp/dtmax）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV），計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.5 血清肝功能指標(biāo)ALT、AST 檢測 收集大鼠腹主動脈血，離心分離血清，采用ELISA 法檢測ALT、AST活性。

1.6 肝臟系數(shù)測算 稱取大鼠體質(zhì)量（BW）后，取出肝臟并稱取肝臟質(zhì)量（LW），以LW/BW 計(jì)算肝臟系數(shù)。

1.7 肝臟組織病理檢查 取部分肝臟組織，加入4%甲醛溶液固定。常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切5 μm厚切片，二甲苯透明、梯度乙醇水化。肝臟組織行HE 光鏡下觀察組織病理變化。行Masson 染色，光鏡下觀察采集圖像，藍(lán)色為陽性染色。用Image pro-Plus6.0 軟件計(jì)算肝組織中的膠原形成面積，膠原形成面積=陽性染色面積/總面積×100%。

1.8 肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)Hyp、GSH-Px、MDA、T-SOD 檢測 取肝組織，采用堿水解法檢測Hyp，比色法檢測GSH-Px，硫代巴比妥酸法檢測MDA，羥胺法檢測T-SOD含量。

1.9 肝組織TGF-β1/Smad 通路和TIMP/MMP 軸相關(guān)基因表達(dá)檢測 采用Real-time PCR 法檢測TGFβ1/Smad 通路相關(guān)基因TGF-β1、CTGF 和TIMP/MMP軸相關(guān)基因TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢmRNA表達(dá)。取液氮凍存的肝臟組織樣本，提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1 μL cDNA 為模板，向體系中加入上下游引物各0.5 μL，SYBR GREEN 0.3 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，最后用dd H2O 補(bǔ)足至20 μL。以GAPDH 為內(nèi)參，置于ExicyclerTM96熒光定量PCR儀內(nèi)進(jìn)行實(shí)時熒光定量分析。引物序列：TGF-β1上游5"-AACAATTCCTGGCGTTACCT-3"，下游5"-GCCCTGTATTCCGTCTCCTT-3"；CTGF 上游5"-GTCTTCGGTGGGTCCGTGTA-3"，下游5"-GCGGTCCTTGGGCTCATCAC-3"； TIMP1 上 游 5"-CCTCTGGCATCCTCTTGTT-3"，下 游5"-CGAATCCTTTGAGCATCTTAG-3"；MMP1 上 游5"-GCCATTACTCACAACAATC-3"，下 游 5"-ATCACCTTCCTCCTCAAA-3"；MMP2上游5"-CCAAGAACTTCCGACTATCC-3"，下游：5"-GTCACTGTCCGCCAAATAAA-3"；collagenⅢ上游5"-GCCTTCTACACCTGCTCCTG-3"，下 游 5"-AGCCACCCATTCCTCCGACT-3"；GAPDH 上 游5"-GTGGAGTCTACTGGCGTCTT-3"， 下 游 5"-TTGCTGACAATCTTGAGGGA-3"。反應(yīng)條件：94 ℃5 min，94 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)后，72 ℃2 min 30 s，40 ℃1 min 30 s。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，常規(guī)行瓊脂糖凝膠電泳和成像系統(tǒng)掃描，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.10 肝組織TGF-β1/Smad 通路和TIMP/MMP 軸相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting 法。取肝臟組織標(biāo)本，提取組織總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。行SDS-PAGE 電泳，電壓80 V。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（稀釋比例：collagenⅢ一抗1∶5 000，p-Smad2/3、CTGF一抗1∶1 000，TGF-β1、Smad2/3、TIMP1、MMP1、MMP2 一抗1∶500），4 ℃孵育過夜。加入二抗（稀釋比例均為1∶3 000），37 ℃孵育45 min。ECL 底物發(fā)光后，掃描膠片，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的灰度值。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組心功能指標(biāo)比較 見表1。與Sham 組相比，心 衰 組CO、LVEF、+dp/dtmax及-dp/dtmax降 低，LVESP、LVEDP、LVESV 升高（P＜0.01）；與心衰組相比，金絲桃苷100 mg/kg組LVESP、LVEDP、LVESV降低（P 均＜0.01）；與心衰組相比，金絲桃苷200 mg/kg組LVESP、LVEDP、LVESV 降低（P 均＜0.01），CO、LVEF、+dp/dtmax及-dp/dtmax升高（P均＜0.05或＜0.01）。

表1 四組心功能指標(biāo)比較（±s）

表1 四組心功能指標(biāo)比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.01；與心衰組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2 四組血清ALT、AST比較 見表2。與Sham組相比，心衰組ALT、AST水平升高（P均＜0.01）；與心衰組相比，100 mg/kg金絲桃苷組AST水平下降，200 mg/kg金 絲桃 苷 組ALT、AST 水平 均 下 降（P＜0.05 或＜0.01）。

表2 四組血清ALT、AST比較（IU/L，±s）

表2 四組血清ALT、AST比較（IU/L，±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與心衰組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.3 四組肝臟系數(shù)比較 心衰組、Sham 組及金絲桃苷100、200 mg/kg 組肝臟系數(shù)分別為（50.10 ±5.79）、（43.91 ± 0.40）、（47.49 ± 5.27）、（45.41 ±3.31）mg/g。心衰組肝臟系數(shù)較Sham 組有升高趨勢，金絲桃苷組肝臟系數(shù)較心衰組有降低趨勢，但各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.4 四組肝臟組織病理結(jié)果比較 Sham 組肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤及膠原纖維沉積；心衰組彌漫性的炎癥浸潤及脂肪變性，肝細(xì)胞變大，形狀不均，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝板破壞及中央靜脈坍塌，視野內(nèi)廣泛藍(lán)染纖維間隔形成。與心衰組相比，金絲桃苷100 mg/kg 組及金絲桃苷200 mg/kg 組肝臟脂肪變性有不同程度的減輕，小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列規(guī)則，肝內(nèi)炎細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞壞死程度減輕，纖維化程度減輕。與金絲桃苷100 mg/kg 組相比，金絲桃苷200 mg/kg 組上述病理變化均減輕。心衰組、Sham 組及金絲桃苷100、200 mg/kg 組肝臟組織膠原形成面積分別為26.17% ±2.90%、1.84%±0.25%、21.08%±2.69%、11.74%±1.83%，心衰組和金絲桃苷組膠原形成面積均高于Sham 組，金絲桃苷組低于心衰組，其中金絲桃苷200 mg/kg組低于100 mg/kg組（P均＜0.05）。

2.5 四組肝組織Hyp、GSH-Px、MDA、T-SOD 比較 見表3。

2.6 四組肝組織TGF-β1、CTGF 及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢmRNA表達(dá)比較 見表4。

2.7 四 組 肝 組 織TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、CTGF 及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢ蛋白表達(dá)比較 見表5。

表3 四組肝組織Hyp、GSH-Px、MDA、T-SOD比較（±s）

表3 四組肝組織Hyp、GSH-Px、MDA、T-SOD比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與心衰組相比，#P＜0.05。

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表4 四組肝組織TGF-β1、CTGF及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢmRNA相對表達(dá)量比較（±s）

表4 四組肝組織TGF-β1、CTGF及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢmRNA相對表達(dá)量比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與心衰組相比，#P＜0.05；與金絲桃苷100 mg/kg組相比，△P＜0.05。

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表5 四組肝組織TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、CTGF及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢ蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

表5 四組肝組織TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、CTGF及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢ蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與心衰組相比，#P＜0.05；與金絲桃苷100 mg/kg組相比，△P＜0.05。

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3 討論

心臟泵血功能衰竭常導(dǎo)致其他器官的損害，尤其是肝臟。心功能障礙合并肝功能障礙增加了患者的病死率。這類疾病通常治療困難，且療效有限。因此，從中藥中尋找治療心臟合并肝臟功能障礙的新藥是十分必要的。既往研究表明，由于心臟衰竭，靜脈回流受阻，引起肝臟淤血，進(jìn)而出現(xiàn)肝臟腫大，同時使肝細(xì)胞缺血得不到營養(yǎng)而壞死，導(dǎo)致肝臟受損及纖維化，在肝臟受損時，炎癥和一些細(xì)胞因子的分泌增加，這時處于靜息狀態(tài)的肝星形細(xì)胞被激活，進(jìn)而分泌大量ECM，并表達(dá)一些促纖維化因子，從而進(jìn)一步促進(jìn)膠原纖維結(jié)締組織增生造成肝臟纖維化的加重［8］。本研究采用腹主動脈—腔靜脈分流術(shù)誘導(dǎo)制作大鼠心衰模型，觀察金絲桃苷對心衰導(dǎo)致的肝纖維化的影響及機(jī)制。結(jié)果顯示，與Sham組相比，心 衰 組CO、LVEF、+dp/dtmax及-dp/dtmax降 低，LVESP、LVEDP、LVESV 升高，提示大鼠出現(xiàn)心臟收縮和舒張功能障礙［9］。與心衰組相比，金絲桃苷100 mg/kg組LVESP、LVEDP、LVESV降低，金絲桃苷200 mg/kg 組LVESP、LVEDP、LVESV 降 低，CO、LVEF、+dp/dtmax及-dp/dtmax升高，表明金絲桃苷可改善心衰大鼠的血流動力學(xué)指標(biāo)異常，進(jìn)而改善心臟收縮和舒張功能。

肝臟系數(shù)即肝臟質(zhì)量與體質(zhì)量之比，當(dāng)肝臟質(zhì)量增加，肝臟系數(shù)就會隨之增大，提示肝臟可能發(fā)生水腫、增生、纖維化或肥大。本研究結(jié)果顯示，心衰組肝臟系數(shù)較Sham組有升高趨勢，金絲桃苷組肝臟系數(shù)較心衰組有降低趨勢，提示金絲桃苷可能改善肝纖維化；但各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與檢測樣本量較少、病變時間較短有關(guān)。肝臟組織病理結(jié)果顯示，心衰組肝組織發(fā)生彌漫性的炎癥浸潤及脂肪變性，肝細(xì)胞變大，形狀不均，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝板破壞及中央靜脈坍塌，大量膠原纖維沉積，膠原形成面積顯著增加。在應(yīng)用金絲桃苷治療后，大鼠肝臟脂肪變性、肝內(nèi)炎細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞壞死程度、纖維化程度均減輕，膠原形成顯著被抑制，表明金絲桃苷可以改善心衰引起的肝臟病變及纖維化程度。

血清AST 和ALT 是反映肝損傷和肝纖維化程度的指標(biāo)，在發(fā)生肝纖維化時顯著升高。膠原中Hyp 含量最高，檢測肝組織中Hyp 可反映肝臟纖維化程度。肝臟發(fā)生纖維化時常伴隨著脂質(zhì)過氧化，MDA 是脂質(zhì)代謝終產(chǎn)物，檢測其含量可反映組織損傷程度［10］。SOD 是機(jī)體的氧自由基清除劑，反映機(jī)體的抗氧化能力，GSH-Px可保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，清除體內(nèi)的過多的脂質(zhì)過氧化物［11］。本研究結(jié)果顯示，心衰組血清ALT、AST 及肝組織Hyp、MDA 較Sham 組升高，肝組織SOD、GSH-Px 較Sham 組下降，提示心衰引起肝臟發(fā)生纖維化損傷并伴隨著抗氧化能力下降，發(fā)生功能障礙。經(jīng)金絲桃苷治療后，血清ALT、AST 及肝組織Hyp、MDA 顯著降低，肝組織SOD、GSH-Px 顯著升高，提示金絲桃苷能夠顯著改善心衰引起的肝纖維化，并恢復(fù)或緩解因肝纖維化引起的肝臟抗氧化能力的下降和肝臟功能障礙。

TGF-β1是一種強(qiáng)致纖維化細(xì)胞因子，其與下游的Smad 蛋白的磷酸化形式結(jié)合形成TGF-β1/Smad通路，激活該通路可將肝星形細(xì)胞活化為成纖維細(xì)胞，活化的肝星形細(xì)胞高表達(dá)CTGF，促進(jìn)肝臟纖維化［12-13］。本研究結(jié)果顯示，心衰組肝組織中TGF-β1、p-Smad2/3 及CTGF 表達(dá)顯著升高，表明心衰可能通過激活TGF-β1/Smad 通路引起肝纖維化；金絲桃苷組肝組織中TGF-β1、p-Smad2/3 及CTGF 的表達(dá)較心衰組降低，提示金絲桃苷可能通過抑制TGF-β1/Smad通路的活化發(fā)揮對肝纖維化的抑制作用。

ECM 生成增加與降解減少與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。TIMP1 與MMP1、MMP2 能夠調(diào)節(jié)ECM的生成與降解，目前在不同因素誘導(dǎo)的大鼠纖維化模型中均證實(shí)TIMP1、MMP2 表達(dá)升高［13-14］，且研究表明TIMP1 主要抑制MMP1 對collagenⅠ、collagenⅢ的降解，促進(jìn)纖維化過程［15］。本研究顯示，在心衰引起的肝纖維化模型中TIMP1、MMP2 及collagenⅢ表達(dá)顯著升高，而MMP1表達(dá)顯著下降，金絲桃苷能夠顯著抑制TIMP1、MMP2及collagenⅢ的表達(dá)，并顯著促進(jìn)MMP1 的表達(dá)，進(jìn)而改善了肝臟的纖維化程度。

綜上所述，金絲桃苷對心衰引起的肝纖維化具有保護(hù)作用，其可能的分子機(jī)制是調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad 通路的活化及TIMP/MMP 軸的平衡，這一結(jié)果可為臨床上更合理的利用金絲桃苷治療心衰引起的肝纖維化提供一定的理論依據(jù)。