空腹血糖受損患者KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)多態(tài)性與特異組織胰島素抵抗的關(guān)系

文靜翟琪張藝博何燕

1 首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京100069；2 臨床流行病學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

糖尿病的危險(xiǎn)因素包括環(huán)境因素（如飲食模式、 生活方式等）、遺傳因素和表觀修飾等，2 型糖尿?。═2DM）的遺傳度為30%～70%［1］。目前，連鎖分析、候選基因法和全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已經(jīng)成功確認(rèn)了全球主要人種的100 多個(gè)T2DM 易感基因，其中大部分在歐洲人群中發(fā)現(xiàn)［2］。Li 等［3］報(bào)道，中國(guó)漢族人群PAX4 rs10229583 多態(tài)位點(diǎn)在胰島β細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用，可能會(huì)使T2DM 風(fēng)險(xiǎn)增加18%。KCNB1基因編碼由857個(gè)氨基酸組成的電壓門控性鉀通道2.1亞型（Kv2.1通道），主要分布于腦皮質(zhì)、海馬等腦內(nèi)組織，心房、心室、骨骼肌、肺動(dòng)脈平滑肌等肌肉組織，胰島β 細(xì)胞及視網(wǎng)膜等［4］。其主要功能是控制膜電位，參與神經(jīng)及內(nèi)分泌物質(zhì)的釋放、細(xì)胞的分化、活化、增殖及凋亡等生理過(guò)程。我們的前期研究顯示，中國(guó)漢族人群中KCNB1基因3"非翻譯區(qū)（3" UTR）的rs1051295 位點(diǎn)的基因多態(tài)性與T2DM 的發(fā)生相關(guān)，基因型TT 通過(guò)降低外周胰島素敏感性進(jìn)而導(dǎo)致T2DM 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高［5］。由于外周胰島素抵抗來(lái)源于特異組織，在人體內(nèi)最主要的胰島素敏感組織包括肝臟、肌肉和脂肪組織［6］；因此我們推測(cè)，KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)多態(tài)性與胰島素敏感的特異組織即肝臟和骨骼肌組織胰島素抵抗之間可能存在關(guān)聯(lián)。本研究探討了空腹血糖受損患者KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)基因多態(tài)與特異組織胰島素抵抗之間的關(guān)聯(lián)，旨在識(shí)別rs1051295 發(fā)揮其功能影響胰島素敏感性的特異組織。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年9月—2010年11月在北京宣武醫(yī)院就診的76例空腹血糖受損患者，其中男33例、女43例。納入標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖6.1～7.0 mmol/L，收縮壓（SBP）＜140 mmHg，舒張壓（DBP）＜90 mmHg，BMI 18.5～24.0 kg/m2。排除腫瘤、器質(zhì)性疾病患者及妊娠婦女。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 KCNB1基因rs1051295位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 禁食8～12 h后，采集肘靜脈血2 mL，加入EDTA 抗凝管中，-4 ℃冰箱保存，用于提取全血DNA。①基因組DNA 提?。菏褂肨aKaRa 的全基因組DNA 提取試劑盒，按操作說(shuō)明進(jìn)行基因組DNA 的提取。②引物合成：根據(jù)基因庫(kù)（GeneBank）上公布的KCNB1基因序列（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/）設(shè)計(jì)引物，此序列在GeneBank 中的編號(hào)為NT_002370。運(yùn)用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物：biotin-GCGCAAAACCCTTACTCAAAT，下 游 引 物 ：GCCAGGGGGCAATTAGAAT。③基因型檢測(cè)：擴(kuò)增目的基因片段，PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：100 ng 基因組DNA，0.5 pmol 引物，2×Master Mix（反應(yīng)緩沖液，MgCl2和DNA 聚合酶，日本ToYoBo）。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃30 s，59 ℃30 s，72 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。使用PSQ96全自動(dòng)焦磷酸測(cè)序儀進(jìn)行基因型測(cè)定及分型。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物制備生物素標(biāo)記的單鏈DNA模板，再將洗脫分離的單鏈DNA 模板在PSQ96 Plate 內(nèi)與測(cè)序引物混合，80 ℃孵育2 min，自然冷卻至室溫后放入PSQ96MA 儀器上進(jìn)行等位基因序列測(cè)定。通過(guò)PSQ96MA 系統(tǒng)進(jìn)行等位基因分型分析，將實(shí)際所得測(cè)序峰圖與軟件自動(dòng)生成的3 種基因型對(duì)應(yīng)的模式峰圖比較，最終判斷該樣本的基因型?；蚍中蜋z出率為100%（76/76）。在5%的隨機(jī)樣品中重復(fù)進(jìn)行基因分型以進(jìn)行驗(yàn)證和質(zhì)量控制，基因型數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率＜1%。

1.3 糖耐量檢查及肝臟組織胰島素抵抗指數(shù)（Hepa-IRI）和骨骼肌組織胰島素敏感指數(shù)（Mus-ISI）測(cè)算 患者禁食10 h后，口服75 g葡萄糖溶液，實(shí)施OGTT，檢測(cè)0、30、60、120 min 的血糖（Glu0、Glu30、Glu60、Glu120）和 胰 島 素（Ins0、Ins30、Ins60、Ins120）。根據(jù)血糖和胰島素濃度繪制曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC）。Hepa-IRI=GlutAUC（0-30）×InstAUC（0-30），GlutAUC（0-30）和InstAUC（0-30）分別為OGTT 前30 min 內(nèi)血糖 和胰 島素 的AUC。Mus-ISI=（dG/dt）/I，dG/dt 為OGTT 血糖濃度從最高峰到最低點(diǎn)的衰減速率，I 為OGTT過(guò)程中血漿平均胰島素濃度［6］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Epidata、SPSS23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）和四分位間距（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)，對(duì)不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用log變換。采用多重線性回歸模型分析不同基因型與Heap-IRI和Mus-ISI 的關(guān)聯(lián)，并校正T2DM 相關(guān)的性別、年齡和BMI 等因素對(duì)其的影響，給出偏回歸系數(shù)（b）及95%可信區(qū)間（95%CI）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果KCNB1 基因的rs1051295 位點(diǎn)存在T 和C 兩種等位基因，基因頻率分別為50.65%（77/152）、49.35%（75/152）。TT、TC、CC 基因型的分布頻率分別為23.68%（18/76）、53.95%（41/76）和22.37%（17/76）。

2.2 KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)不同基因型Hepa-IRI、Mus-ISI 比較 由于TC 和CC 基因型的Hepa-IRI、Mus-ISI 水平相近，為了觀察TC 與CC 的累加效應(yīng)，我們將TC+CC 進(jìn)行聯(lián)合分析。TT 基因型Hepa-IRI 高于TC、CC、TC+CC，Mus-ISI 低于TC、CC、TC+CC（P均＜0.05），TC與CC比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 KCNB1基因rs1051295位點(diǎn)不同基因型患者Hepa-IRI、Mus-ISI比較［M（P25，P75）］

2.3 KCNB1基因rs1051295位點(diǎn)不同基因型患者的臨床資料比較 見表2和表3。TT、TC、CC基因型之間比較以及TT與TC+CC 比較，性別、年齡、BMI、TC、TG、SBP、DBP、血糖均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。OGTT 結(jié)果顯示，TT 基因型Ins30 水平高于TC、CC、TC+CC，Ins120水平高于CC和TC+CC（P均＜0.05）。

表2 KCNB1基因rs1051295位點(diǎn)不同基因型患者的性別、年齡、BMI、血壓、血脂比較［mmol/L，±s/M（P25，P75）］

表2 KCNB1基因rs1051295位點(diǎn)不同基因型患者的性別、年齡、BMI、血壓、血脂比較［mmol/L，±s/M（P25，P75）］

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表3 KCNB1基因rs1051295位點(diǎn)不同基因型患者的血糖、胰島素比較［±s/M（P25，P75）］

表3 KCNB1基因rs1051295位點(diǎn)不同基因型患者的血糖、胰島素比較［±s/M（P25，P75）］

注：與TT基因型比較，*P＜0.05。

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2.3 KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)不同基因型與Hepa-IRI、Mus-ISI 的相關(guān)性 見表4。將基因型TT 分別與TC、CC 和TC+CC 相比較，結(jié)果顯示基因型TT 與Hepa-IRI 存 在 正相關(guān)、與Mus-ISI 存在負(fù)相關(guān)。校正性別、年齡、BMI 后，將基因型TT分別與TC、CC 和TC+CC 相比較，結(jié)果顯示基因型TT 與Hepa-IRI 存 在 正 相 關(guān)、與Mus-ISI 存 在 負(fù)相關(guān)。

表4 rs1051295位點(diǎn)不同基因型與Hepa-IRI及Mus-ISI的相關(guān)性

3 討論

外周組織胰島素抵抗是2 型糖尿病的重要病理生理學(xué)機(jī)制，特異組織胰島素抵抗是外周組織胰島素抵抗的重要來(lái)源［6］。我們的前期研究證實(shí)，KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)多態(tài)性與外周組織胰島素抵抗之間存在關(guān)聯(lián)［5］。本研究結(jié)果顯示，空腹血糖受損患者KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)的TT 基因型與TC、CC 和TC+CC 相比較，Hepa-IRI 和Mus-ISI水平升高，在校正性別、年齡和BMI 后，TT 基因型與Hepa-IRI 正相關(guān)、與Mus-ISI 負(fù)相關(guān)，即TT 基因型與Hepa-IRI 升高、Mus-ISI 降低相關(guān)。表明TT 基因型與特異組織胰島素抵抗存在關(guān)聯(lián)。

Kv2.1 通道由KCNB1 基因編碼，其主要功能是控制膜電位，參與神經(jīng)及內(nèi)分泌物質(zhì)的釋放、細(xì)胞的分化、活化、增殖及凋亡等生理過(guò)程［4］。KCNB1基因多態(tài)性可能會(huì)影響Kv2.1通道表達(dá)量及細(xì)胞膜上功能性通道的組裝［7］，與多種疾病相關(guān)。美國(guó)一項(xiàng)針對(duì)高血壓疾病的研究發(fā)現(xiàn)，在非裔美國(guó)人群中，位于KCNB1 內(nèi)含子區(qū)的rs756529 位點(diǎn)與左心室肥厚有關(guān)，提示高血壓患者左心室肥厚發(fā)展的潛在機(jī)制［8］。另一項(xiàng)研究證實(shí)，在日本人群中，位于KCNB1 外顯子區(qū)的1071 C＞T 以及768 G＞A 位點(diǎn)突變與長(zhǎng)QT 間期綜合征發(fā)生相關(guān)［9］。PEREZ 等［10］研究顯示，位于KCNB1 編碼區(qū)的c. 1133T＞C 位點(diǎn)突變與特發(fā)性癲癇腦病的發(fā)病直接相關(guān)，該變異導(dǎo)致Kv2.1 V378A通道表達(dá)以及亞細(xì)胞定位缺陷是癲癇腦病的遺傳病病因之一。除此之外，美國(guó)另一項(xiàng)GWAS 研究還報(bào)道了位于KCNB1 的3" UTR 的rs1051295 位點(diǎn)通過(guò)與HLA-DRB1基因的相互作用而與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)，為Kv2.1 通道蛋白與炎癥反應(yīng)相關(guān)的作用機(jī)制提供了遺傳學(xué)證據(jù)支持［11］。在人類［12-13］和嚙齒動(dòng)物［12，14］中，由KCNB1 編碼的Kv2.1 通道是主要的β細(xì)胞Kv 通道，70%的K+由此外流，小鼠Kv2.1 缺失會(huì)引起嚴(yán)重的胰島素釋放和血糖紊亂。我們的前期研究顯示，編碼Kv2.1 通道蛋白的KCNB1 基因rs1051295位點(diǎn)TT基因型與外周胰島素抵抗相關(guān)［5］，TT通過(guò)降低外周胰島素敏感性導(dǎo)致T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。進(jìn)一步探討KCNB1 基因多態(tài)與脂代謝和胰島素抵抗之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)許多KCNB1基因非連鎖標(biāo)簽基因多態(tài)性與TC、TG、LDL 和外周胰島素抵抗相關(guān)，提示KCNB1 基因編碼的Kv2.1 通道蛋白可能參與脂代謝的調(diào)控過(guò)程，進(jìn)而影響胰島素敏感性［15］，為深入認(rèn)識(shí)遺傳因素在T2DM 發(fā)病過(guò)程中的作用提供了依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，基因型TT 在OGTT 30 min 時(shí)Ins 水平均高于TC 和CC，并且TT 在30 min 和120 min 時(shí)Ins 水平高于TC+CC。這可能與胰島素抵抗導(dǎo)致的β細(xì)胞代償分泌胰島素相關(guān)?？崭寡钱惓Ｅc肝臟組織胰島素抵抗相關(guān)，餐后血糖異常與脂肪組織胰島素抵抗相關(guān)。TT 基因型與肝臟組織胰島素抵抗相關(guān)，肝臟組織胰島素抵抗導(dǎo)致過(guò)多的肝糖原分解成甘油和葡萄糖，引起空腹血糖的升高，進(jìn)一步引起β 細(xì)胞代償分泌胰島素，引起高胰島素血癥［16］。骨骼肌組織胰島素敏感性降低引起骨骼肌組織胰島素抵抗，導(dǎo)致糖原無(wú)法儲(chǔ)存在骨骼肌組織中，引起餐后血糖升高，導(dǎo)致胰島素代償分泌，引起胰島素水平升高［6］。肝臟和骨骼肌組織的胰島素抵抗進(jìn)一步促進(jìn)外周組織胰島素抵抗，血糖水平升高和胰島素分泌增加進(jìn)一步加重，最終導(dǎo)致β 細(xì)胞功能的失代償，引起T2DM的發(fā)生。

綜上所述，空腹血糖受損患者KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)TT 基因型與特異組織胰島素抵抗存在關(guān)聯(lián)；KCNB1 基因rs1051295 位點(diǎn)TT 基因攜帶者肝臟和肌肉組織胰島素抵抗風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。本研究存在的局限性：首先，樣本量較少，未來(lái)需要在大樣本的人群中驗(yàn)證這種關(guān)聯(lián)；其次，本研究是在漢族人群中進(jìn)行的，是否在其他的種族也存在這樣的關(guān)聯(lián)尚不清楚；最后，由于數(shù)據(jù)收集過(guò)程缺乏游離脂肪酸等指標(biāo)，因此無(wú)法對(duì)脂肪組織胰島素抵抗指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，故本研究只納入了肝臟和肌肉組織胰島素抵抗，下一步我們將繼續(xù)研究TT基因型與脂肪組織胰島素抵抗的關(guān)聯(lián)。