負(fù)載紫杉醇的絲素蛋白納米粒子對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤生長及凋亡蛋白表達(dá)的影響

夏凡林，沈磊瑩，曹陽，林子晶

1 上海城建職業(yè)學(xué)院健康與社會關(guān)懷學(xué)院，上海201415；2 上海交大醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院；3 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率迅速增長，在上海、北京等一線城市已居于女性惡性腫瘤之首位［1］，嚴(yán)重威脅女性健康。紫杉醇是廣譜抗腫瘤藥物，通過抑制細(xì)胞有絲分裂達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的，已廣泛用于卵巢癌、乳腺癌的臨床治療。但紫杉醇在血液中的溶解率低，不能達(dá)到最佳抑癌作用；目前常用的紫杉醇助溶劑聚氧乙烯蓖麻油易誘發(fā)嚴(yán)重的過敏、骨髓抑制、腎毒性等不良反應(yīng)，限制了紫杉醇的臨床應(yīng)用［2］。以納米材料為主的新型藥物載體可提高紫杉醇的血液溶解度和藥物穩(wěn)定性，增強(qiáng)治療靶向性和生物利用度，是紫杉醇抗癌治療的新方向［3］。絲素蛋白具有獨特的空間結(jié)構(gòu)，其含有的羥基與氨基能夠交聯(lián)形成骨架結(jié)構(gòu)，可很好地包載藥物，增加組織對藥物利用度。2019 年1 月—2020 年3 月，我們以絲素蛋白納米粒子制備紫杉醇載體，觀察其對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤生長及凋亡蛋白表達(dá)的影響，為乳腺癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 雌性昆明種小鼠100 只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，于重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物醫(yī)學(xué)中心清潔級動物飼養(yǎng)房進(jìn)行飼養(yǎng)，溫度20～25 ℃，濕度45%～55%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。

1.1.2 細(xì)胞 小鼠乳腺癌EMT6 細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，在重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室培養(yǎng)。采用10%胎牛血清RMPI 1640 培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3 d 換液1 次，并采用0.25%胰酶消化傳代，待細(xì)胞呈對數(shù)生長期后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.1.3 試劑與儀器 兔抗鼠Bcl-2、Bax 單克隆抗體、熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG 及β-actin 多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol 試劑購自美國Gibco 公司；蠶繭殼購自亳州市颯楓藥業(yè)銷售有限公司；Annexin V FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。高效液相色譜儀（HITACHI，日本），流式細(xì)胞儀（貝克曼，美國）。

1.2 空白微球與載藥微球的制備 取蠶繭殼10 g，加入0.02 mmol/L 碳酸鈉300 mL，煮沸30 min，蒸餾水洗3 遍。重復(fù)操作3 遍，將洗凈的蠶絲纖維烘干后，加入CaCl2混合溶劑，攪拌2 h。于透析袋中以純凈水透析48 h，得到絲素蛋白，4 ℃保存?zhèn)溆??？瞻孜⑶虻闹苽洌簩?%絲素蛋白溶液加入0.01 g/mL Span-80 的液體石蠟中進(jìn)行乳化，25 min 后緩慢加入戊二醛固化，2 h 后洗滌，冷凍干燥后獲得空白微球，即絲素蛋白納米粒子。載藥微球的制備：取紫杉醇（重慶美聯(lián)藥業(yè)有限公司，純度＞99%）2 mg 加入乙醇溶液，超聲5 min，待紫杉醇完全溶解后，按照空白微球的制備方法，將2%的絲素蛋白溶液和紫杉醇溶液逐步加入液體石蠟中，25 min 后緩慢加入戊二醛固化，2 h 后洗滌，冷凍干燥后獲得載藥微球［4］。

1.3 乳腺癌荷瘤小鼠模型的制備 取對數(shù)生長期EMT6 細(xì)胞，加入PBS 溶液稀釋，用0.25%胰酶消化后，制成5×106/mL 的細(xì)胞懸液。向小鼠右前肢腋皮下注射0.2 mL 乳腺癌細(xì)胞懸液，建立乳腺癌荷瘤小鼠模型。

1.4 動物分組與干預(yù) 取造模成功的80 只小鼠，隨機(jī)分為對照組、紫杉醇組、紫杉醇載體組、空白微球組各20只。紫杉醇組于接種后第8、11、14天給予紫杉醇5 mg/kg腹腔注射，紫杉醇載體組于相同時間點給予紫杉醇計算濃度為5 mg/kg 載藥微球溶液腹腔注射，空白微球組注射等體積空白微球溶液，對照組注射等體積生理鹽水。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 腫瘤生長抑制情況 造模后每5 d行B超檢查1次，測定瘤體長徑（a）、短徑（b），以體積（V）=ab2/2 計算瘤體體積，制作生長曲線。抑瘤率=［1-（治療組平均瘤體體積/對照組平均瘤體體積）］×100%。

1.5.2 肝腎功能 造模第22 天眶后靜脈取血，采用全自動生化分析儀測定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）水平。

1.5.3 腫瘤組織中紫杉醇藥物濃度 采用高效液相色譜（HPLC）法檢測。造模第22 天，取紫杉醇載體組、紫杉醇組小鼠，頸椎脫臼法處死，取腫瘤組織100 mg，以1∶5 的比例加入生理鹽水制備成組織勻漿，9 000 g 離心10 min，取上清液0.5 mL，依次加入內(nèi)標(biāo)EPI、硫酸胺、飽和碳酸氫鈉、氯仿/甲醇，混勻后600 g 離心10 min 后，轉(zhuǎn)移下層有機(jī)相至另一試管中，再加入氯仿/甲醇，同法萃取3 次后，直至下層有機(jī)相合并，氮氣吹干，取殘留物加入流動相溶解，13 000 g離心10 min 后，取上清液15 μL 進(jìn)行檢測紫杉醇的藥物濃度。

1.5.4 腫瘤細(xì)胞凋亡情況 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。應(yīng)用網(wǎng)措法將100 mg 腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為1×107/mL。取單細(xì)胞懸液0.1 mL，依次加入5 μL的AnnexinV-FIT及5 μL PI，混勻后室溫避光反應(yīng)10 min。上流式細(xì)胞儀，采用Annexin V FITC/PI復(fù)染法檢測細(xì)胞凋亡比例。

1.5.5 腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 采用Western blotting 法檢測。取腫瘤組織，液氮研磨后，TRIzol 法提取總蛋白。經(jīng)過上樣、SDS 電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉。加入1∶500 的兔抗鼠cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入1∶1 000 的帶有熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h。洗膜，ECL 發(fā)光法顯色，以β-actin 作為內(nèi)參，采用GIS1000 分析軟件檢測蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以-x ± s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腫瘤生長抑制情況比較 接種8 d 后對照組、空白微球組、紫杉醇組、紫杉醇載體組瘤體體積分 別 為（219.35 ± 94.51）、（220.43 ± 69.81）、（217.57±95.72）、（218.57±85.26）mm3，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。藥物干預(yù)后，對照組、空白微球組、紫杉醇組、紫杉醇載體組瘤重分別為（2.76 ± 0.55）、（2.69 ± 0.67）、（1.59 ± 0.27）、（1.19±0.21）g，紫杉醇載體組、紫杉醇組瘤重低于對照組和空白微球組，紫杉醇載體組瘤重低于紫杉醇組（P 均＜0.05）?？瞻孜⑶蚪M、紫杉醇組、紫杉醇載體組的抑瘤率分別為0.15%、51.24%、64.21%，紫杉醇載體組的抑瘤率高于紫杉醇組和空白微球組，紫杉醇組高于空白微球組（P均＜0.05）。

2.2 各組血清肝、腎功能指標(biāo)比較 與對照組比較，其他三組血清肝、腎功能指標(biāo)均無明顯變化（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組血清肝、腎功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組血清肝、腎功能指標(biāo)比較（±s）

注：與對照組比較，P均＞0.05。

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2.3 紫杉醇載體組與紫杉醇組腫瘤組織中紫杉醇濃度比較 紫杉醇載體組、紫杉醇組腫瘤組織中的紫杉醇濃度分別為（1.86±0.21）、（1.47±0.17）μg/mL，紫杉醇載體組高于紫杉醇組（P＜0.05）。

2.4 各組腫瘤細(xì)胞凋亡率比較 對照組、空白微球組、紫杉醇組、紫杉醇載體組腫瘤細(xì)胞凋亡率分別為18.2%、19.5%、34.3%、45.1%。紫杉醇載體組、紫杉醇組細(xì)胞凋亡率均高于對照組和空白微球組，且紫杉醇載體組高于紫杉醇組（P均＜0.05）。

2.5 各組腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對照組和空白微球組相比，紫杉醇載體組、紫杉醇組cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)升高，Bcl-2 表達(dá)降低（P 均＜0.05）；且紫杉醇載體組cleaved Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)高于紫杉醇組，Bcl-2 表達(dá)低于紫杉醇組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與空白微球組比較，&P＜0.05；與紫杉醇組比較，#P＜0.05。

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3 討論

紫杉醇是一種二萜類化合物，其具有較好腫瘤細(xì)胞抑制作用，但由于水溶性差、生物利用度低而難以發(fā)揮最佳臨床抗癌效果［2，5］。紫杉醇與聚氧乙烯蓖麻油等比例制成紫杉醇制劑可在一定程度上增加紫杉醇水溶性，但是聚氧乙烯蓖麻油容易引起過敏反應(yīng)、骨髓抑制作用、腎毒性、心臟毒性等，并且制劑稀釋后容易沉淀，可導(dǎo)致局部正常組織損傷，臨床應(yīng)用受到限制。近年來，紫杉醇脂質(zhì)體、白蛋白紫杉醇等多種新劑型均被廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床治療，具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、存儲時間長、不良反應(yīng)少等優(yōu)點［6］。SHANG 等［7］通過體外研究證實，將紫杉醇負(fù)載于羧甲基殼聚糖納米載體可在短時間內(nèi)增加局部腫瘤組織藥物濃度，提升抑瘤效果。本研究成功構(gòu)建負(fù)載紫杉醇的絲素蛋白納米粒子，分析其對乳腺癌小鼠模型抑癌效果，目前這方面還鮮見報道。通過HPLC 法檢測藥物濃度，發(fā)現(xiàn)紫杉醇載體組小鼠腫瘤組織中紫杉醇濃度明顯高于以紫杉醇常規(guī)治療的小鼠，提示負(fù)載紫杉醇的絲素蛋白納米粒子可通過提高紫杉醇的血液溶解度，提高腫瘤組織局部的藥物濃度。

絲素蛋白是目前應(yīng)用前景非常好的一種藥物緩釋載體［8-9］。作為天然高分子纖維蛋白，絲素蛋白主要由18 種氨基酸組成，與人體的部分組織結(jié)構(gòu)相似，具有良好的組織親和性，且安全無毒。同時，絲素蛋白帶有氨基和羧基，兩性解離性質(zhì)的特征創(chuàng)造了獨特的空間結(jié)構(gòu)，不但能夠很好地包載藥物，并且具有較好可塑性，能夠設(shè)計溶液、凝膠、粉末等多種形態(tài)［9-10］。因此，其與藥物制成絲素蛋白納米載體，可迅速穿透組織間隙，進(jìn)入機(jī)體的細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，提高藥物的利用率，提升抑瘤效果。本研究結(jié)果顯示，紫杉醇載體組抑瘤率明顯高于紫杉醇組，提示負(fù)載紫杉醇的絲素蛋白納米粒子對乳腺癌瘤體生長有更佳的抑制作用，與紫杉醇在腫瘤組織濃度升高的研究結(jié)果基本一致。此外，我們推測紫杉醇載體組有更佳的抑瘤效果，可能也與絲素蛋白的緩釋功能有關(guān)。絲素蛋白進(jìn)入人體后，由于pH、溫度等環(huán)境改變，絲素蛋白所帶電荷、自身結(jié)構(gòu)及相互作用可發(fā)生動態(tài)變化，影響藥物復(fù)合體中藥物的釋放能力［11］；同時，在載體制作過程中，乙醇可增加絲素蛋白膜β-折疊，提其高結(jié)晶度及膜表面疏水性，減少藥物“暴釋”現(xiàn)象［12］。負(fù)載紫杉醇的絲素蛋白納米粒子可能通過緩釋功能延長藥物釋放，增加組織對藥物的生物利用時間，從而提高抑瘤效果。

促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖是抗腫瘤的重要機(jī)制［13］。紫杉醇主要作用靶點在細(xì)胞微管蛋白/微管系統(tǒng)，通過促進(jìn)微管聚合、抑制微管降解將細(xì)胞阻滯在G2/M 期，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［14-15］。本研究分析乳腺癌小鼠模型腫瘤細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示紫杉醇載體組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯高于紫杉醇組小鼠，表明負(fù)載紫杉醇的絲素蛋白納米粒子可明顯增加腫瘤細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步檢測凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，紫杉醇載體組凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3 及Bax 明顯高于紫杉醇組，抗凋亡蛋白Bcl-2 明顯低于紫杉醇組，與細(xì)胞凋亡研究結(jié)果一致。Bax 是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白，其通過改變線粒體膜通透性、促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，經(jīng)Caspase通路激活Caspase-3等途徑引起細(xì)胞凋亡［16］。此外，Bax 表達(dá)增加還可以促進(jìn)Bax-Bax 二聚體形成，抑制Bcl-2 的抗細(xì)胞凋亡作用［17］。TAN 等［17］通過動物模型研究證實，納米粒子載體能夠增加化療藥物治療靶向性，認(rèn)為其可能原因在于：納米粒子載體通過激活腫瘤組織局部相關(guān)巨噬細(xì)胞吸收作用，從單細(xì)胞藥物荷載到逐步釋放藥物至鄰近腫瘤細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮殺傷效應(yīng)。我們推測，負(fù)載紫杉醇的絲素蛋白納米粒子能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，可能與其提高紫杉醇的治療靶向性有關(guān)。

本研究觀察了各組小鼠的一般情況，結(jié)果顯示給藥后各組小鼠肝腎功能無明顯差異，提示基于絲素蛋白的納米粒子紫杉醇載體對機(jī)體一般情況影響較小，無明顯肝腎毒性，安全性較高。

綜上所述，負(fù)載紫杉醇的絲素蛋白納米粒子能夠提高乳腺癌腫瘤組織局部的藥物濃度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，較單純使用紫杉醇抑癌效果更佳，且具有較高的安全性。但本研究僅進(jìn)行體外動物實驗，缺少細(xì)胞實驗的機(jī)制研究作為支撐，部分推論可能存在局限性。本課題組后期會進(jìn)一步完善相關(guān)實驗理論研究，加強(qiáng)和其他研究機(jī)構(gòu)合作進(jìn)行臨床研究，為乳腺癌的臨床治療提供新方向。