沙眼衣原體DNA質控物的制備及評價

胥明勇，朱華強，吳泳樺，莊利東

（綿陽市中心醫(yī)院檢驗科，四川 綿陽 621000）

目前，實時熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）因其特異好、靈敏度高、快速方便、能有效避免擴增產物污染等優(yōu)點，已成為分子生物學研究的重要工具[1]。然而，為了確保PCR測定結果準確，必須有嚴格的室內質控措施[2]。臨床實驗室進行分子診斷項目室內質控時，應首先考慮質控物穩(wěn)定性，但目前尚未見基質與檢測樣本一致的沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis，CT）DNA質控物的相關報道。本PCR實驗室利用臨床陰、陽性樣本制備質控物，并對其穩(wěn)定性進行評價。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集綿陽市中心醫(yī)院無血性、無常見其他感染性疾病患者CT DNA為強陽性的宮頸分泌物樣本1例，檢測循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值）為25.53；另收集無血性、無常見其他感染性疾病患者CT DNA陰性宮頸分泌物樣本2例，混勻后檢測結果為陰性，且內標結果為陽性。

1.2 儀器與試劑

采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）進行檢測，CT DNA檢測試劑盒購自湖南圣湘生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 質控物制備 將強陽性宮頸分泌物進行56 ℃、30 min滅活后，用陰性樣本將強陽性樣本15倍稀釋后制備成陽性質控物，檢測Ct值為30.40；再用陰性樣本將陽性質控物15倍稀釋后制備成弱陽性質控物，檢測Ct值為35.30。將制備好的質控物分裝于0.6 mL離心管中，標記后分別于-20 ℃和-70 ℃保存。

1.3.2 穩(wěn)定性評價 （1）采用2種方法對質控物融解穩(wěn)定性進行評價。從-20℃冰箱中隨機抽取48支樣本，隨機分為A組和B組，每組各24支樣本，A組37 ℃水浴復融15 min，B組室溫（22 ℃）放置15 min復融，混勻后每支樣本測定1次。另外，再隨機抽取2支該質控物樣本，37 ℃水浴復融混勻，每支測定2次，再置于-20 ℃冰箱中冷凍保存1 d后再進行測定。如此重復3次，評價融解方式和融解次數對質控物穩(wěn)定性的影響，并計算融解次數的相對偏差范圍。（2）-20 ℃冷凍保存穩(wěn)定性評價。從-20 ℃冰箱中隨機抽取2支樣本，每月測定1次，每支樣本37 ℃水浴復融混勻檢測2次，連續(xù)測定3個月。采用一元線性回歸方法分析所測數據。（3）-70 ℃冷凍保存穩(wěn)定性評價。從-70 ℃冰箱中隨機抽取2支樣本，每2個月測定1次，每支樣本37 ℃水浴復融混勻檢測2次，連續(xù)測定12個月。采用一元線性回歸方法分析所測數據。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0軟件進行數據分析。融解方式對質控物穩(wěn)定性影響的計量資料比較采取配對t檢驗，計數資料比較采用連續(xù)校正χ2檢驗。冷凍保存穩(wěn)定性評價采取一元線性回歸方法進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 陽性質控物穩(wěn)定性評價

2.1.1 融解次數和融解方式對質控物穩(wěn)定性的影響 復融3次測定Ct值與初次測定Ct值的相對偏差為1.10%～5.03%，其偏差在《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》（CNAS-CL02-A009）文件規(guī)定的范圍內[3]，說明融解次數對測定結果并無明顯影響。對A組和B組進行配對樣本t檢驗，t值為-0.732，P值為0.483，說明融解方式對測定結果并無明顯影響。

2.1.2 -20 ℃冷凍保存穩(wěn)定性評價結果 一元線性回歸分析結果顯示，在3個月內，質控物隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化。見表1。

表1 -20℃冷凍保存穩(wěn)定性評價結果

2.1.3 -70 ℃保存條件下穩(wěn)定性評價結果 一元線性回歸分析結果顯示，在12個月內，質控物隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化。見表2。

表2 -70℃保存條件下穩(wěn)定性評價結果

2.2 弱陽性質控物穩(wěn)定性評價

2.2.1 融解次數和融解方式對質控物穩(wěn)定性的影響 復融3次測定Ct值與初次測定Ct值的相對偏差為-5.39%～-4.04%，其偏差在《醫(yī)學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》（CNAS-CL02-A009）文件規(guī)定的范圍內[3]，說明融解次數對測定結果并無明顯影響。對A組和B組進行χ2檢驗，χ2值為4.923，P值為0.027，說明融解方式對測定結果有明顯影響。A組和B組均有假陰性結果，其中A組有1例，B組有8例。

2.2.2 -20 ℃冷凍保存穩(wěn)定性評價結果 一元線性回歸分析結果顯示，在3個月內，質控物隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化。見表3。

2.2.3 -70 ℃保存條件下穩(wěn)定性評價結果 一元線性回歸分析結果顯示，在12個月內，質控物隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化。見表4。

表3 -20℃冷凍保存穩(wěn)定性評價結果

表4 -70℃保存條件下穩(wěn)定性評價結果

3 討論

CT是一種性傳播疾病的病原體，在細胞內寄生，易感染柱狀上皮細胞，會引起男、女性生殖道及泌尿道感染，從而導致盆腔炎、輸卵管損傷，甚至不孕不育[4]。在CT的諸多檢測方法中，實時熒光PCR已經成為醫(yī)學實驗室主要的檢測方法，為了得到準確的檢測結果，室內質控尤為重要。要做好室內質控，首先要有穩(wěn)定、可靠的質控物，可應用于醫(yī)學PCR實驗室的質控物應具備以下幾個條件[5]：（1）基質與檢測樣本一致；（2）所含待測物濃度接近實驗的控制水平；（3）靶值或者預期結果已定；（4）無已知的生物傳染危險；（5）單批可大量獲得；（6）有很好的穩(wěn)定性。本研究制備的質控物基本具備以上條件：質控物基質同樣本一致，能夠防止質控物基質中的抑制物對檢測結果產生影響；制備的陽性質控物能敏感地反映核酸提取有效性；為了確保無常見感染性疾病病原體，將質控物經56 ℃、30 min滅活；一次性可獲得使用1年以上的質控物量，可起到長期監(jiān)測實驗室檢測質量的作用。

目前，醫(yī)學實驗室常見的CT DNA質控物一般為尿液、細胞培養(yǎng)物和含有單一目的片段的質粒，均存在不同缺點[6]。因臨床常見樣本為生殖道分泌物，若質控物為尿液樣本，其基質與檢測樣本不一致，可能對常規(guī)質控產生影響。細胞株作為質控物有許多優(yōu)點，如能夠模擬臨床樣本進行全程監(jiān)控、穩(wěn)定性好、無生物傳染性等[7]，但其制備的周期長、成本較高。若質控物以質粒作為樣本，不需要裂解提取所需要的模板，無法模擬臨床樣本提取過程，所以起不到全程質控的作用。本實驗室制備的CT DNA質控物均能避免這些缺點。

Ct值是實時熒光PCR擴增過程中熒光信號達到指數擴增時的循環(huán)數，其大小與病原體載量呈負相關[8]。蔣義等[9]在血液病毒核酸篩查室內質控方法的研究中發(fā)現，質控物濃度與Ct值呈高度相關，因此Ct值能夠作為實時熒光PCR定量參數，也可以作為統(tǒng)計學計量資料。根據CNAS-CL02-A009文件規(guī)定[3]：定性檢測項目每次試驗應設置陰性、弱陽性和/或陽性質控物，因此將質控物制備成陽性和弱陽性進行評價，符合實驗室室內質控的要求。

本研究制備的質控物評價結果表明，陽性和弱陽性質控物復融3次對測定結果并無明顯影響；陽性和弱陽性質控物在-20 ℃冷凍保存3個月和-70 ℃冷凍保存12個月，隨保存時間的延長沒有顯著趨向變化，說明質控物在該溫度下保存穩(wěn)定。在室溫（22 ℃）、37 ℃水浴條件下復融，各隨機抽取48支陽性和弱陽性質控物樣本，隨機分為A組和B組，每組各24支樣本，進行復融方式評價，結果顯示，陽性質控物檢測結果全部為陽性，統(tǒng)計學分析結果顯示，復融方式對檢測結果無影響。弱陽性質控物在37 ℃水浴條件下復融混勻檢測，有1例假陰性樣本，而在室溫（22 ℃）條件下復融混勻檢測，卻有8例假陰性樣本，提示弱陽性分泌物樣本復融應采取37 ℃水浴融解方式，其穩(wěn)定性最好。弱陽性質控物在2種條件下復融后均出現了假陰性結果，即使在其他條件下的穩(wěn)定性評價結果是通過，也不能應用于醫(yī)學實驗室。產生假陰性結果的原因可能與細胞本身易聚集黏附的性質有關[10]，還可能與質控物本身濃度高低有關[11]，具體分析后，推測原因可能為：（1）37 ℃水浴可能會消除細胞間以及細胞與管壁之間聚集黏附問題，基本上不會造成漏取感染細胞，而室溫（22 ℃）融解卻不能完全消除細胞聚集黏附問題，可能會漏取感染細胞；（2）陽性質控物比弱陽性質控物濃度高，即使漏取少許感染細胞也不影響定性結果，而弱陽性質控物本身濃度低，漏取少許感染細胞有可能會導致假陰性結果。標準物質在保證核酸檢測準確性方面起非常重要的作用[12]，當陽性質控物檢測結果為假陰性時，通過檢測該標準物質能夠盡快查找失控原因。

本研究制備的質控物基質與檢測樣本相同，能夠防止基質效應的影響，而且制備質控物樣本易收集，能夠單批大量獲得，從而極大地降低成本。陽性質控物因穩(wěn)定性達到標準，可以應用于臨床實驗室，能起到監(jiān)測實驗室檢測質量的作用。

本研究不足之處在于在評價融解次數和冷凍保存對穩(wěn)定性的影響方面，質控物評價樣本量不足，不能完全保證評價準確性，后續(xù)研究將擴大樣本量，以得到更科學、更客觀的結果。