流動注射-光度法自動測定多種植物樣品中過氧化物酶活性

杜璞，李永生

(四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，四川 成都 610065)

過氧化物酶(POD)是一種廣泛存在于真菌、細菌、陸生生物中以血紅素為輔基利用過氧化氫介導(dǎo)有機和無機底物氧化反應(yīng)的氧化還原酶[1-2]。POD在多個領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3-5]，商品POD多為辣根過氧化物酶(HRP)，但HRP產(chǎn)量低，價格昂貴，多種植物中POD的含量也較為可觀[6-9]，POD活性的準(zhǔn)確測定可以篩選富含POD的植物樣品，對POD的提純及應(yīng)用有重要意義。

POD活性測定方法多基于手工操作[10-12]，誤差大、效率低。流動注射分析(FIA)技術(shù)具有分析速度快、精密度高等特點[13-14]。本文基于GA/POD/H2O2反應(yīng)體系建立一種可快速測定POD的流動注射光度分析系統(tǒng)(FIA-SP)，在反應(yīng)非平衡態(tài)時準(zhǔn)確、快速測定植物樣品中POD活性。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

愈創(chuàng)木酚(GA)、過氧化氫(30%)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、濃鹽酸(質(zhì)量分數(shù)36%～38%)均為分析純；辣根過氧化物酶(HRP，≥250 U/mg)，Sigma公司；實驗用水為脫氣超純水。

FIA-3110流動注射裝置；傲藝紫外-可見分光光度計；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)/水式多用真空泵；艾柯KL-UP-IV-20超純水儀；CP224S電子天平；800-1離心機；pXJ-1C+型離子活度計。

1.2 溶液配制

1.2.1 磷酸鹽緩沖液(PBS，0.05 mol/L，pH=6.0) 用電子天平分別稱取7.8 g的NaH2PO3·2H2O和17.8 g的Na2HPO3·12H2O，充分溶解后，分別移入1 L的容量瓶中，用超純水定容得到0.05 mol/L的磷酸二氫鈉溶液和磷酸氫二鈉溶液。取123 mL的磷酸二氫鈉溶液和877 mL的磷酸氫二鈉溶液混合，得到pH為6.0，濃度為0.05 mol/L 的PBS。

1.2.2 GA母液(45 mmol/L) 使用移液槍準(zhǔn)確移取446 μL的GA于100 mL的容量瓶中，用PBS定容。

1.2.3 H2O2母液(15 mmol/L) 使用移液槍準(zhǔn)確移取165 μL的H2O2溶液(30%)于100 mL的容量瓶中，用PBS定容。

1.2.4 HRP母液(10 000 U/L) 使用萬分之一的分析天平準(zhǔn)確稱取0.001 g的HRP，溶解后移入 25 mL 的容量瓶中,用PBS定容。

1.2.5 植物粗酶液 將新鮮的植物樣品切成小塊，用榨汁機榨汁，于4 000 r/min 的離心機中離心 15 min。取出上清液，過濾，得到植物粗酶液。于冰箱中4 ℃下保存。

1.3 測定原理

本實驗基于H2O2/POD/GA的反應(yīng)體系，在POD的催化下，H2O2和GA反應(yīng)生成3，3′-二甲氧基-4，4′-聯(lián)苯二醌(2-GA)，該產(chǎn)物在470 nm處有最大吸收，反應(yīng)方程式[15]見公式(1)：

(1)

根據(jù)酶活性定義：每分鐘消耗1 μmol底物需要的酶量為1個酶單位(U)，得到測定酶活性濃度(cE，U/L)的計算公式(2)：

(2)

式中 ΔA——在酶促反應(yīng)一級階段產(chǎn)物2-GA吸光度的變化值，在FLA系統(tǒng)中為峰高；

Δt——一級反應(yīng)階段所用時間，在FIA系統(tǒng)中，為從注樣時間到最高峰出現(xiàn)的留存時間，0.67 min；

n——底物GA與反應(yīng)產(chǎn)物2-GA的物質(zhì)的量之比，即n=2；

L——流通池光程，1 cm；

V/v——樣品的稀釋體積，即FIA系統(tǒng)中樣品分散度，5.921；

ε——反應(yīng)產(chǎn)物2-GA的表觀摩爾吸光系數(shù)，

0.006 4 L/(μmol·cm)。

因此，在其他參數(shù)均確定的情況下，cE的值僅與ΔA/Δt有關(guān)，cE測定公式簡化為公式(3)：

(3)

1.4 實驗方法

FIA流路見圖1。FIA系統(tǒng)由蠕動泵(P)、多功能閥(V)、流通式光度檢測器和計算機組成。

當(dāng)V處于“采樣”位時，P1、P2同時運行，酶樣和GA/H2O2混合試劑R在P2的抽吸作用下充滿樣品定量環(huán)(SL)和試劑定量環(huán)(RL)，多余液體從W1和W2排廢，PBS作為載流推動清洗劑定量環(huán)(CL)中的HCl清洗液塞，流經(jīng)反應(yīng)盤管(RC)和流通池清洗管路，得到一條基線，此時吸光度值為A0。

V轉(zhuǎn)到“注入”位，P2停止運行，P1繼續(xù)運行，PBS推動SL中的酶試樣塞追趕RL中的GA/H2O2混合試劑塞，并與之合并，進入RC中反應(yīng)，GA和H2O2在POD的催化作用下反應(yīng)生成2-GA，流經(jīng)流通池時，得到產(chǎn)物吸光度值(A)，最后從W4流出，同時，清洗液HCl被注入CL中，多余液體從W3排廢。ΔA=A-A0，從注入到最高峰出現(xiàn)的時間即留存時間Δt，將ΔA/Δt代入公式(3)中可求出cE。

圖1 測定POD的FIA-光度法系統(tǒng)(RC反應(yīng)盤管)Fig.1 FIA-spectrophotometry system for determination of POD

2 結(jié)果與討論

2.1 FIA系統(tǒng)參數(shù)的優(yōu)選

基于前期手工法[9]將FIA系統(tǒng)初始參數(shù)設(shè)定如下：GA濃度為1.5 mmol/L，H2O2濃度為 0.5 mmol/L，兩者等體積混合為混合試劑R；SL體積為40 μL，RL體積為150 μL，CL體積為100 μL；PBS濃度為0.05 mol/L，pH為5.5；清洗液HCl濃度為0.4 mol/L；RC長度為100 cm；系統(tǒng)流速為 1.64 mL/min。采用單因素法優(yōu)選FIA系統(tǒng)的各參數(shù)。

2.1.1 FIA系統(tǒng)流速優(yōu)選 蠕動泵為FIA系統(tǒng)的流體驅(qū)動裝置，流速的大小影響反應(yīng)進程和分析速度，用HRP標(biāo)液作為樣品，考察系統(tǒng)流速對ΔA的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 FIA系統(tǒng)流速對產(chǎn)物吸光度的影響Fig.2 Effect of flow velocity of FIA system onabsorbance of product

由圖2可知，ΔA隨著流速的提高先增大后減小，流速為1.91 mL/min時，ΔA最大。其原因是流速較低時，隨著流速的增加，樣品塞追上試劑塞后能更快地融合反應(yīng)，ΔA也增大，當(dāng)流速過大，樣品塞和試劑塞結(jié)合后的反應(yīng)速度小于流動速度，未充分反應(yīng)就從流通池流出。因此，優(yōu)選系統(tǒng)流速為1.91 mL/min。

2.1.2 樣品進樣體積優(yōu)選 FIA系統(tǒng)樣品定量環(huán)SL即加入POD體積，不同體積POD會使酶促反應(yīng)速率不同，影響系統(tǒng)靈敏度。用HRP標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品，考察不同體積SL對ΔA的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 樣品進樣體積對產(chǎn)物吸光度的影響Fig.3 Effect of sample injection volume onabsorbance of product

由圖3可知，隨著SL體積的增大，ΔA逐漸升高至穩(wěn)定，當(dāng)SL的體積超過40 μL，其對ΔA不再造成影響。原因是當(dāng)SL體積過小時，隨著酶液體積的增加，反應(yīng)速率也增加，當(dāng)SL體積超過40 μL后，酶液過量，GA和H2O2的反應(yīng)已到達平衡。為節(jié)省試劑，優(yōu)選SL體積為40 μL。

2.1.3 試劑進樣體積優(yōu)選 試劑定量環(huán)RL即加入GA/H2O2混合試劑體積，加入不同體積的底物會影響酶催化反應(yīng)，從而影響產(chǎn)物的吸光度值。HRP標(biāo)液作為樣品，考察不同體積RL對ΔA的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著RL體積逐漸增大，ΔA先升高后降低，RL體積為150 μL時，ΔA最大。因此，優(yōu)選RL體積為150 μL。

圖4 試劑進樣體積對產(chǎn)物吸光度的影響Fig.4 Effect of reagent injection volume onabsorbance of product

2.1.4 反應(yīng)盤管長度優(yōu)選 RC的長度影響反應(yīng)進程和分析速度。HRP標(biāo)液作為樣品，考察RC對ΔA的影響。結(jié)果表明，ΔA隨著RC長度增加先升高后降低，RC在200 cm時ΔA最大。原因是隨著RC長度的增加，反應(yīng)時間增加，ΔA也逐漸增加，當(dāng)RC超過200 cm時，反應(yīng)產(chǎn)物的稀釋速率大于生成速率，導(dǎo)致ΔA下降。由于RC長度為150 cm時與200 cm時的ΔA相差不大，但HRP標(biāo)液線性更好(ΔA=0.003 8x-0.242 2，r=0.999)，為加快系統(tǒng)分析速度，優(yōu)選RC長度為150 cm。

2.1.5 載流濃度及pH優(yōu)選 PBS的pH值和濃度會影響酶促反應(yīng)。因此在上述優(yōu)選條件下，分別考察PBS的酸度和濃度對ΔA的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 PBS的pH值(a)和濃度(b)對產(chǎn)物吸光度的影響Fig.5 Effect of pH (a) and concentration (b) of PBS onabsorbance of product

由圖5可知，ΔA隨著PBS的pH增大而先增大再減小，pH為6.0時，產(chǎn)物吸光度值最大，而PBS的濃度對ΔA沒有影響，這說明POD的最適pH值為6.0。因此，優(yōu)選PBS的濃度為0.05 mol/L，pH為6.0。

2.1.6 清洗劑HCl濃度及進樣體積優(yōu)選 HCl作為清洗劑起到清洗殘留在系統(tǒng)中的褐色產(chǎn)物2-GA，進而降低系統(tǒng)基線漂移率的作用，因此需要優(yōu)選HCl的濃度和CL體積。在上述優(yōu)選的條件下，分別考察HCl的濃度和CL體積對系統(tǒng)基線漂移率的影響。結(jié)果表明，隨著HCl濃度和CL體積的增加，系統(tǒng)基線漂移率逐漸降低。進樣體積一定時，HCl濃度超過 0.24 mol/L 后對基線漂移率的影響較小，而CL體積過大會影響溶液折射率進而影響產(chǎn)物吸光度值。因此，優(yōu)選HCl濃度為0.24 mol/L，CL體積為150 μL。

2.1.7 底物濃度優(yōu)選 在上述優(yōu)選條件下考察H2O2濃度(0.1～2 mmol/L)和GA濃度(0.1～5.5 mmol/L)對酶催化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 H2O2濃度(a)和GA濃度(b)對產(chǎn)物吸光度的影響Fig.6 Effect of concentration of H2O2 (a) andGA (b) on absorbance of product

由圖6可知，H2O2和GA對ΔA的影響趨勢相同，隨著H2O2和GA濃度的增大，ΔA逐漸增大至穩(wěn)定，當(dāng)H2O2濃度達到1.5 mmol/L，GA達到 4.5 mmol/L 時，ΔA不再變化。因此，優(yōu)選底物濃度為H2O2濃度1.5 mmol/L，GA濃度4.5 mmol/L。分別以H2O2和GA為底物做Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，得到以H2O2為底物時，HRP的米氏常數(shù)(Km)值為2.73 mmol/L，最大反應(yīng)速率(Vm)為 2.84 mmol/(L·min)。以GA為底物時，HRP的Km為7.32 mmol/L，Vm為3.54 mmol/(L·min)。

2.2 2-GA表觀摩爾吸光系數(shù)的測定

為計算POD的酶活性需要在給定條件下準(zhǔn)確測定2-GA的表觀摩爾吸光度值(ε)。由朗伯-比爾定律(A=εbc)可知，ε=A/bc，其中ε為表觀摩爾吸光系數(shù)[L/(μmol·cm)]，b為吸收光程(cm)，c為物質(zhì)濃度(mol/L)，對于特定的有色物質(zhì)，通過繪制濃度/吸光度的曲線，得到曲線斜率，可求出ε。由于反應(yīng)產(chǎn)物2-GA不穩(wěn)定，無法測得其濃度，由(1)式可知，通過增大H2O2和HRP的量，使化學(xué)平衡向右移動，使GA完全轉(zhuǎn)化為2-GA，可以通過GA的濃度間接獲得2-GA的濃度，再繪制2-GA濃度/吸光度曲線求出斜率，即ε2-GA。通過優(yōu)選得到CH2O2/CGA>1.5，HRP濃度>800 U/L 時，GA可以完全轉(zhuǎn)化為2-GA。配制出H2O2濃度恒為1.2 mmol/L、GA濃度在200～600 μmol/L范圍內(nèi)的混合試劑(CH2O2/CGA恒大于1.5)，用800 U/L的HRP溶液作為樣品，用FIA系統(tǒng)在溫度分別為18，40，60 ℃的條件下測出2-GA的吸光度值，求出對應(yīng)的ε2-GA分別為0.006 4，0.006，0.006 L/(μmol·cm)，結(jié)果表明溫度對ε2-GA的測定無影響。在優(yōu)選條件下，在FIA系統(tǒng)中測得的ε2-GA為0.006 4 L/(μmol·cm)，因此取ε2-GA為0.006 4 L/(μmol·cm)。

2.3 分析系統(tǒng)穩(wěn)定性及工作曲線

在上述優(yōu)選條件下，對本系統(tǒng)的穩(wěn)定性及線性響應(yīng)進行評價。對兩種不同濃度的HRP溶液(555，1 770 U/L)連續(xù)測定11次，實測曲線見圖7a，得到RSD分別為3.38%和1.40%，均小于5%，這說明FIA系統(tǒng)穩(wěn)定性好、精密度高。

配制一系列HRP標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品，考察本系統(tǒng)的線性響應(yīng)范圍，實測曲線見圖7b，通過數(shù)學(xué)回歸處理，得到HRP濃度在153～2 752 U/L的范圍內(nèi)線性良好(ΔA=0.000 35CE(HRP)+0.007 16，R2=0.998 8)。另外計算得到系統(tǒng)分析速度為90樣/h，檢出限為25.7 U/L。

圖7 FIA光度法系統(tǒng)重現(xiàn)性/線性響應(yīng)評價Fig.7 Evoluation of repeatability and linearity forFIA-spectrophotometry system

2.4 實樣測定

從商場購買長白蘿卜、紫茄子、西胡瓜、嫩南瓜和大白菜，制備樣品粗酶液，用本方法測定酶活性，結(jié)果見表1。為進一步評價系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，進行加標(biāo)回收實驗，在植物樣品中按照1+1體積比例添加HRP標(biāo)液，用本系統(tǒng)測出加標(biāo)后酶活，每次實驗前對HRP標(biāo)準(zhǔn)溶液的活性進行校正，結(jié)果表明回收率在95%～105%之間。

表1 植物樣品POD測定及回收結(jié)果Table 1 Results for determination of the real plantsamples and the recovery test

3 結(jié)論

基于H2O2/POD/GA反應(yīng)體系建立一種新的可快速測定多種植物所含POD的FIA分析流路，在優(yōu)化條件下，該方法檢測范圍為153～2 752 U/L，RSD≤3.38%，檢出限為25.7 U/L，分析速度為90樣/h。本方法的優(yōu)點是：操作簡單、無人為誤差、分析速度快、精密度高、對試劑和樣品的消耗量小，可以快速篩選POD含量較高的植物樣品，對過氧化物酶的提純及應(yīng)用有重要意義。