尾加壓素Ⅱ在高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用及機(jī)制研究

支杏敏，張捷，盧東，戴紅艷

尾加壓素Ⅱ是一種生長(zhǎng)抑素樣神經(jīng)環(huán)肽，最早發(fā)現(xiàn)于硬骨魚(yú)尾部下垂體中，是目前已知最有效的縮血管活性物質(zhì)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，尾加壓素Ⅱ高表達(dá)于糖尿病性心肌?。―CM）的心肌組織中[2]，提示其可能在DCM發(fā)病過(guò)程中起重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚。尾加壓素Ⅱ在多種細(xì)胞中表現(xiàn)出誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、活性氧產(chǎn)生的作用[3]，如尾加壓素Ⅱ可以通過(guò)誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生活性氧，發(fā)揮促增殖作用。活性氧已被證實(shí)可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上游信號(hào)分子的產(chǎn)生，從而參與調(diào)節(jié)并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過(guò)程[4]，而心肌細(xì)胞凋亡是DCM發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機(jī)制[5]。因此，尾加壓素Ⅱ/氧化應(yīng)激/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路很可能是DCM發(fā)病過(guò)程中的重要機(jī)制之一。本研究為體外實(shí)驗(yàn)，觀察高糖刺激對(duì)心肌細(xì)胞中尾加壓素Ⅱ及其受體的表達(dá)變化，并通過(guò)尾加壓素Ⅱ受體拮抗劑Urantide阻斷尾加壓素Ⅱ系統(tǒng)，觀察心肌細(xì)胞中氧化應(yīng)激/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通道及細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的改變。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

新生1～2 d清潔級(jí)Wistar大鼠乳鼠，由山東魯抗醫(yī)藥公司提供；羊抗尾加壓素Ⅱ多克隆抗體、羊抗尾加壓素Ⅱ受體多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體、兔抗大鼠葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein，GRP78）多克隆抗體、小鼠抗大鼠活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）單克隆抗體、兔抗大鼠CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合同源蛋白（C/EBPhomologous protein，CHOP）單克隆抗體、兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase-12）多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；尾加壓素Ⅱ受體拮抗劑Urantide購(gòu)自美國(guó)Peptides公司；GAPDH以及二氯熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihy-drofluorescin diacetate，DCFHDA）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TAKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。

1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，取乳鼠心臟剪碎，用0.125%胰蛋白酶反復(fù)消化至組織全部消化，收集每次消化后的胰蛋白酶，用含20%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。將收集的細(xì)胞懸液用200目濾網(wǎng)過(guò)濾后離心、重懸，通過(guò)差速貼壁方法獲取心肌細(xì)胞，接種到35 cm3培養(yǎng)瓶或六孔板上，于37℃，5%二氧化碳（CO2）孵箱培養(yǎng)36 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞36 h后，將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：低糖組（5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25 mmol/L葡萄糖）[6]、高滲組（5 mmol/L葡萄糖+20 mmol/L甘露糖）、高糖+Urantide組，其中高糖+Urantide組用Urantide（10-5mol/L）預(yù)刺激45 min，每組6孔，培養(yǎng)24 h后收集心肌細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè)[7]

收集各組心肌細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基清洗3次，加入30 μmol/L DCFH-DA 37℃下孵育20 min，不發(fā)光的DCFH-DA可以自由透過(guò)細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)的活性氧可將DCFH-DA氧化成具有熒光的DCFH-DA，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧的量成正比。再用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用共聚焦顯微鏡獲得各組細(xì)胞圖像。采用image-pro plus 6.0軟件進(jìn)行熒光密度分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

按說(shuō)明用TRIzol提取心肌細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度計(jì)在260 nm下測(cè)量并計(jì)算RNA的濃度及純度。根據(jù)TAKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。采用Promega的SYBR?Green Ⅰ在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)步驟：95℃，10 s，35個(gè)循環(huán)，62℃退火10 s；72℃延伸10 s進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在每個(gè)循環(huán)的延伸期收集熒光信號(hào)，并通過(guò)熔解曲線分析PCR擴(kuò)增的特異性。所獲數(shù)據(jù)通過(guò)2-ΔΔCt法進(jìn)行處理，引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 免疫印跡 （Western blot）檢測(cè)

RIPA細(xì)胞裂解液與蛋白酶抑制劑Aprotinin按250：1比例消化收集的各組心肌細(xì)胞，冰上裂解30 min，劇烈震蕩3次，高速離心機(jī)離心后取上清，加入適量蛋白上樣緩沖液，10 min煮沸。用二喹啉甲酸法[8]測(cè)定所得蛋白濃度。用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，然后分別用GRP78多克隆抗體（1：1 000）、ATF6單克隆抗體（1：160）、CHOP單克隆抗體（1：1 000）和caspase-12多克隆抗體（1：1 000）、GAPDH單克隆抗體（1：1 000）4℃搖床孵育過(guò)夜，再與相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法（ECL顯色法）處理蛋白條帶。以GAPDH為內(nèi)參，用Gelpro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

圖1 Western blot法檢測(cè)高糖刺激對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)尾加壓素Ⅱ及其受體蛋白表達(dá)量的影響（n=3）

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，兩組間的數(shù)據(jù)比較采用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖刺激對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)尾加壓素Ⅱ及其受體水平的影響（圖1）

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與低糖組和高滲組相比，高糖組心肌細(xì)胞內(nèi)尾加壓素Ⅱ及其受體蛋白表達(dá)量顯著增高（P＜0.05）。

2.2 高糖刺激下尾加壓素Ⅱ?qū)π募〖?xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響（圖2）

細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，與低糖組相比，高糖組心肌細(xì)胞中活性氧表達(dá)水平明顯增高（P＜0.0001）；與高糖組相比，高糖+Urantide組心肌細(xì)胞中活性氧表達(dá)水平明顯降低（P＜0.0001）。

圖2 細(xì)胞免疫熒光法分析高糖刺激下尾加壓素Ⅱ?qū)π募〖?xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響（n=3）

2.3 高糖刺激及阻斷尾加壓素Ⅱ受體后心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)分子的變化（圖3、4）

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot法檢測(cè)各組中ATF6、GRP78、CHOP和 caspase-12的表達(dá)變化。與低糖組比，高糖組中ATF6、GRP78、CHOP和 caspase-12的mRNA及蛋白的表達(dá)量均明顯增高（P＜0.05）；和高糖組比，高糖+Urantide組中ATF6、GRP78、CHOP和caspase-12的mRNA及蛋白的表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)高糖刺激下尾加壓素Ⅱ?qū)Ω鹘M細(xì)胞ATF6、GRP78、CHOP和caspase-12的mRNA表達(dá)的影響（n=3）

圖4 Western blot法檢測(cè)高糖刺激下尾加壓素Ⅱ?qū)Ω鹘M細(xì)胞ATF6、GRP78、CHOP和 caspase-12的蛋白表達(dá)的影響（n=3）

3 討論

目前，我國(guó)死于糖尿病并發(fā)癥的人數(shù)比例日益增加，其中DCM已成為加速糖尿病患者死亡的重要原因之一。DCM組織形態(tài)學(xué)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞凋亡、變性、炎癥反應(yīng)[9]等，其中心肌細(xì)胞凋亡是其最重要的病理改變[5]。研究證實(shí)，不論是糖尿病患者[10]，還是糖尿病動(dòng)物模型[5]，其心肌細(xì)胞凋亡均明顯增加。而采用不同手段降低心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡后，可預(yù)防或減輕DCM患者心功能惡化[11]。因此，心肌細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病變過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，但其相關(guān)機(jī)制尚不完全明了。

尾加壓素Ⅱ是生長(zhǎng)抑素類(lèi)似的環(huán)狀血管收縮肽，其縮血管效能可達(dá)內(nèi)皮素-1的10倍[1]。在終末期心力衰竭患者心肌組織及心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌組織[2]中，均檢測(cè)到尾加壓素Ⅱ及其受體表達(dá)增高。DCM時(shí)尾加壓素Ⅱ及其受體表達(dá)明顯增高[12]。因此，尾加壓素Ⅱ系統(tǒng)的激活很可能參與并調(diào)控DCM過(guò)程中心肌細(xì)胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是近年才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑，參與多種疾病及病理狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶如GRP78、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（glucose-regulated protein 94，GRP94）和鈣網(wǎng)蛋白的產(chǎn)生都會(huì)相應(yīng)增加[10]，其中GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志蛋白[13]，會(huì)與錯(cuò)誤折疊的蛋白或未折疊的蛋白相結(jié)合，阻止這些蛋白的合成并使它們?cè)趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)中重新排列折疊或進(jìn)入降解途徑，以便能夠修復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通?？梢约せ钷D(zhuǎn)錄因子ATF6[14]。ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡和自噬途徑中的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，嚴(yán)重或長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能時(shí)，它能夠啟動(dòng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的下游凋亡信號(hào)通路包括[15-17]：CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白或生長(zhǎng)停滯及DNA損傷誘導(dǎo)基因153（CHOP/GADDl53）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspase）通路。內(nèi)環(huán)境平穩(wěn)狀態(tài)下，CHOP和caspase-12的表達(dá)很弱，當(dāng)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，CHOP和caspase-12的表達(dá)明顯升高，過(guò)度表達(dá)的CHOP和caspase-12會(huì)促使細(xì)胞周期停滯或甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不但與糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)[18]，還參與糖尿病多種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，如糖尿病大血管病變、糖尿病腎病及糖尿病視網(wǎng)膜病變。在體外，高糖能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞[19]、大鼠系膜細(xì)胞[20]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生；游離脂肪酸通過(guò)CHOP通路促進(jìn)小鼠足細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活[21]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在DCM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Li等[22]發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)小鼠心肌組織CHOP、GRP78、GRP94、激活型ATF6及磷酸化α 亞基的真核起始因子2表達(dá)均明顯增加，進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在DCM發(fā)展過(guò)程中的重要作用。體外研究證實(shí)，高糖可以通過(guò)激活氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[23]。

本研究顯示，給予高糖刺激后，心肌細(xì)胞中尾加壓素Ⅱ及其受體表達(dá)明顯增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78、轉(zhuǎn)錄因子ATF6、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡信號(hào)分子CHOP、caspase-12的表達(dá)均明顯增加，而尾加壓素Ⅱ受體拮抗劑Urantide可以部分阻止這一過(guò)程，提示高糖刺激下尾加壓素Ⅱ可能通過(guò)與其特異性受體結(jié)合，激活氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，尾加壓素Ⅱ除了具有較強(qiáng)的血管活性外，還可以在高糖刺激下表達(dá)增加，進(jìn)一步激活氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡通路，從而參與DCM的發(fā)病過(guò)程。本研究結(jié)果豐富了DCM的病理生理學(xué)機(jī)制，為糖尿病并發(fā)癥的防治提供了新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突