高溫和皮質醇對黃顙魚性別分化的影響

齊飄飄 陳 敏 于 躍 常樂怡 李亞寧 王凌宇 袁勇超 樊啟學 沈志剛

(華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點實驗室,教育部長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展工程研究中心,池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室,武漢 430070)

黃顙魚(Tachysurus fulvidracoRichardson)隸屬于鯰形目、鲿科、黃顙魚屬[1],廣泛分布于我國長江、黃河和黑龍江等水域,是我國重要的淡水名優(yōu)魚類,因其肉質細嫩鮮美,無肌間刺,營養(yǎng)價值高,養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點,一直受到養(yǎng)殖者和消費者的青睞。黃顙魚2018年全國總產(chǎn)量51.0×107kg,從2012年開始年平均增長16.4%,是我國淡水名優(yōu)魚類中增長速度最快、增長速率最穩(wěn)定的養(yǎng)殖品種[2],2018年全國淡水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量排名第9位,是我國名副其實的淡水名優(yōu)第一魚。黃顙魚生長具有明顯的性別二態(tài)性,前期研究我們發(fā)現(xiàn),在相同養(yǎng)殖環(huán)境下,雄魚生長速度比雌魚快120%[3],達上市規(guī)格時雄魚體重可達雌魚的2—3倍[4]。

為了提高黃顙魚養(yǎng)殖群體的生長速度與養(yǎng)殖效益,我國科研人員做了大量工作,培育出了2個黃顙魚新品種,黃顙魚“全雄1號”(2010年認定)和雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號”(2019年認定),推動了黃顙魚產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步增長。在新品種的培育過程中,科研人員對黃顙魚的性別決定與性別分化機制、性別特異分子標記、性別控制技術、兩性生長異形進行了大量深入的研究,取得了較大的進展[3—14]。黃顙魚遺傳性別決定類型為雄性配子異形(XXXY),但是研究發(fā)現(xiàn)黃顙魚性別分化易受到環(huán)境因素的影響。雖然黃顙魚Y染色體上存在潛在性別決定基因pfpdz1[6],但本研究發(fā)現(xiàn),在性別分化關鍵時期,短期的高溫(33℃)處理能誘導部分XX個體發(fā)生性逆轉。高溫誘導遺傳型雌魚性逆轉的機制尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn),高溫[4,15,22—25]、高密度[26,27]等應激條件下引起魚苗雄性化的同時都伴隨著皮質醇水平的升高,使魚類的性腺都朝著雄性方向分化[20,28]。Hattori等[15]高溫處理銀漢魚(Odontesthes bonariensis)幼魚中有相當大比例的雌魚逆轉為雄魚,與對照組相比,在高溫飼養(yǎng)的幼魚中檢測到較高的皮質醇;Van den Hurk等[29]用皮質醇和皮質酮處理虹鱒(Oncorhynchus mykiss)仔魚30d,虹鱒仔魚出現(xiàn)明顯的雄性化,未發(fā)生性逆轉雌魚卵巢發(fā)育受到抑制;Hayashi等[21]報道高溫(33℃)處理青鳉(Oryzias latipes)仔魚引起皮質醇水平升高,抑制原始生殖細胞分化和fshrmRNA表達,青鳉仔魚高溫處理過程中加入皮質醇合成酶抑制劑(美替拉酮,metyrapone),雄性化完全被藥物所抵消。此外,XX青鳉孵化后暴露于高溫和皮質醇中(0—5日齡)抑制雌性生殖細胞的增值和卵巢芳香化酶(cyp19a1)的表達,而這些影響在高溫和皮質醇處理中加入雌二醇(17β-estradiol,E2)后雄性化被抵消[22]。高溫[15—18,20,24,30]和皮質醇[15,26,29,31]處理對性別調控的作用在許多魚類中得到證實,我們將這些證據(jù)總結如下:(1)環(huán)境應激條件在魚類性別分化關鍵時期誘導雄性化過程中無一例外地導致皮質醇水平升高;(2)皮質醇處理也能誘導雄性化;(3)而皮質醇合成酶抑制劑能抵消高溫等應激條件誘導的雄性化;(4)雌二醇處理能解救皮質醇或高溫誘導的雄性化。這4個方面的證據(jù)表明,皮質醇很可能是環(huán)境應激誘導雄性化過程的關鍵因子。因此我們推測皮質醇參與環(huán)境誘導雄性化的過程。

本研究以我國重要經(jīng)濟魚類黃顙魚為研究對象,開展高溫與皮質醇誘導黃顙魚XX個體雄性化組織學進程研究,以期為解密環(huán)境應激誘導魚類雄性化的遺傳學與生理學機制提供基礎資料,并為建立環(huán)境友好型全雄黃顙魚的生產(chǎn)方法提供初步的實踐支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與實驗魚養(yǎng)殖

實驗魚親本均來自湖北省黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司,雌魚親本來源于江蘇地區(qū),雄性親本來源于湖北本地。選取規(guī)格大體一致、無損傷和體質健壯的黃顙魚親本,進行人工催產(chǎn),實驗魚苗經(jīng)人工授精孵化所得,出膜后3d用豐年蟲開口(天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司),然后逐漸轉食成微粒配合飼料(山東升索漁用飼料研究中心,主要成分:粗蛋白質≥50.0%,粗脂肪＞8.0%,粗纖維≤3.0%,灰分≤16.5%,水分≤12.0%,鈣≤5.0%,總磷≥1.0%,賴氨酸≥2.0%)。每100 g飼料拌30 mL 95%乙醇溶液,將皮質醇溶于乙醇溶液,濃度為300 mg每kg飼料,對照組和高溫組不添加藥物直接與乙醇混合,每100 g飼料伴入30 mL乙醇,均勻地噴灑在微粒配合飼料中,通風廚中過夜晾干,使酒精充分揮發(fā),將配好的飼料置于4℃條件下備用。實驗期間魚苗飼養(yǎng)在60 L的水箱中,在12—35日齡每天投喂3次,36日齡后每天投喂2次,每天清理殘餌糞便并及時換注清水。

1.2 實驗設計

實驗共3個組:對照組(CR)、高溫組(HT)和皮質醇組(CS),每組3個平行,每個平行隨機放入500尾魚苗。本次實驗在12—35日齡期間,皮質醇處理組投喂伴入皮質醇的飼料,對照組和高溫組僅加入95%乙醇伴入的飼料,皮質醇和對照組平均水溫為26℃,高溫組平均水溫為33℃。35日齡之后所有實驗魚轉喂未經(jīng)處理的顆粒飼料,水溫全部設置為26℃(高溫組水溫每天降低1℃)。實驗養(yǎng)殖階段分別在22、32、42、62、122日齡設置取樣點,每個平行隨機撈取相同或相近數(shù)量的實驗魚,用MS-222麻醉后測量全長(精確到0.1 mm),取每尾魚鰭條保存于95%乙醇中,取軀干部分(鰓蓋后緣之后,肛門之前)或性腺組織于Bouin’s液中固定,48h后轉入70%乙醇常溫保存。

1.3 性別鑒定

采用通用型柱式基因組試劑盒提取鰭條DNA(康為世紀),利用Dan等[5]開發(fā)的黃顙魚性別特異性分子標記(XY-F:5′-GATTGTAGAAGCCATC TCCTTAGCGTA-3′;XY-R:5′-CATGTAGATC ACTGTACAATCCCTG-3′),來鑒定每尾魚的遺傳型性別。PCR反應體系為10 μL:上下游引物各0.5 μL;模板DNA 1.0 μL;2×TaqPCR Master Mix 5.0 μL(康為世紀);ddH2O 3.0 μL。PCR反應程序為:95℃預變性3min,34個循環(huán)(95℃變性30s,59℃退火30s,72℃延伸40s),72℃延伸5min。擴增完成后,取PCR產(chǎn)物3 μL,以DL2000 Marker作為參照,利用凝膠成像系統(tǒng)依據(jù)片段長度鑒別出XY和XX,XY為2條帶(826和955 bp),XX為一條帶(955 bp)。

1.4 性腺組織學觀察

性腺組織學樣品通過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后,連續(xù)切片(切片厚度5—6 μm),用于蘇木精伊紅染色(HE染色),中性樹膠封片,組織切片在光學顯微鏡下用成像系統(tǒng)進行檢查和拍照(Olympus DP73,Japan)。各階段性腺中生殖細胞的鑒別參照前人對黃顙魚性腺分化的組織學觀察研究[31—33]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件(version 20.0)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)差異顯著性檢驗,方差分析前進行數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性檢驗,如不符合方差分析的條件,將數(shù)據(jù)進行對數(shù)或正弦轉換。用Duncan’s多重比較來確定組間差異的顯著性,P＜0.05時視為顯著性差異。文中的數(shù)據(jù)均以均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果

2.1 性別鑒定

黃顙魚遺傳性別決定類型為雄性配子異形(XX-XY)。利用黃顙魚性別特異性的分子標記,以黃顙魚基因組為模板擴增出兩段不同大小的片段(X-955 bp;Y-826 bp),電泳檢測結果擴增出兩條帶(955和826 bp)的為雄魚,只有一條帶(955 bp)的為雌魚。

圖1A顯示的是對照組62日齡利用黃顙魚性別特異性分子標記的瓊脂糖凝膠電泳圖(部分),檢測結果可以清楚地鑒定出每一尾魚的遺傳型性別,并無模糊條帶,跟我們前期研究結果一致[3]。因此利用黃顙魚性別特異性的分子標記可以100%準確鑒定遺傳型性別。部分結果如下:62日齡取樣組織學觀察發(fā)現(xiàn)1、3、4、5、6、7、8、9為雌魚,2、10、11、12、13、14為雄魚,與圖1A所表現(xiàn)的遺傳型性別完全一致。

圖1B顯示的是高溫組62日齡瓊脂糖凝膠電泳圖(部分),62日齡取樣組織學觀察發(fā)現(xiàn)5、8、9、11、14為雌性,1、2、3、4、6、7、10、12、13為雄性,說明4、12、13個體XX雌魚性逆轉為XX偽雄魚,其中7是YY超雄魚。

圖1 黃顙魚雌雄基因型鑒定電泳圖(X-955 bp;Y-826 bp)Fig.1 Genotypic sex identification by using sex-linked markers in yellow catfish(X-955 bp;Y-826 bp)

我們統(tǒng)計了62日齡時各處理組的存活率,對照組存活率(79.4±3.2)%顯著高于高溫組(63.6±1.5)%,而高溫組顯著高于皮質醇處理組(59.0±0.6)%。

2.2 高溫和皮質醇處理對黃顙魚生長的影響

利用黃顙魚性別特異分子標記和組織學結合的方法,我們分別在各處理組間和各處理組之內比較了XX偽雄魚、XX雌魚與XY雄魚生長方面的差異(表1)。高溫或皮質醇處理結束4周,即黃顙魚幼魚62日齡時,我們發(fā)現(xiàn)不論是高溫組還是皮質醇組,XX偽雄魚全長均顯著大于XX雌魚,也較XY雄魚大。這種生長優(yōu)勢一直延續(xù)至122日齡,但這種優(yōu)勢沒有統(tǒng)計學上的顯著差異。

表1 高溫和皮質醇處理對黃顙魚幼魚生長的影響Tab.1 The effects of high temperature and cortisol treatments on the growth of yellow catfish

2.3 高溫和皮質醇對黃顙魚性腺發(fā)育和性別分化的影響

我們將每一尾黃顙魚個體通過性別特異性分子標記進行遺傳性別鑒定,并對相應的性腺進行組織學觀察,22日齡性腺組織學如圖2所示。22日齡皮質醇和高溫處理組均未發(fā)現(xiàn)XX個體發(fā)生性逆轉。高溫組、對照組和皮質醇組中的卵巢組織與精巢組織可明顯區(qū)分,標志著卵巢解剖學上分化的開始。高溫組卵巢組織由卵原細胞組成,精巢組織仍處在發(fā)育最初期(由少量原始生殖細胞及體細胞組成)。對照組卵巢(圖2C、2c)和皮質醇組卵巢(圖2E、2e),卵原細胞細胞核染色較淺,細胞質呈網(wǎng)狀或絲狀,卵圓形或橢圓形,細胞處于有絲分裂期,高溫組卵巢(圖2A、2a)發(fā)育比對照組(圖2C、2c)和皮質醇組(圖2E、2e)快。高溫組(圖2B、2b)、對照組(圖2D、2d)和皮質醇組(圖2F、2f)精巢由原始生殖細胞(Primordial germ cells)和性腺體細胞(Somatic gonadal cells)組成。

圖2 黃顙魚XX與XY遺傳型幼魚22日齡性腺組織學Fig.2 Representative gonadal histology at 22 days post-hatching(DPH)of XX and XY yellow catfish

黃顙魚32日齡性腺組織學如圖3所示,我們觀察到,高溫組、對照組和皮質醇組中的卵巢組織與精巢組織可明顯區(qū)分。高溫和皮質醇處理誘導了一部分XX遺傳型雌魚雄性化,并且這些XX雄魚保留了原有的卵巢腔結構;而另一部分雌魚保持了原有的卵巢結構和細胞。在對照組(圖3D、3d)中觀察到卵原細胞,在高溫組(圖3A、3a)部分XX雌魚(未性逆轉)中觀察到較大的初級卵母細胞,初級卵母細胞的出現(xiàn)標志著卵巢細胞學上分化的開始,因此高溫促進了卵巢發(fā)育。皮質醇組(圖3F、3f)部分XX雌魚(未性逆轉)中也觀察到卵原細胞和初級卵母細胞,在發(fā)生性逆轉的XX個體性腺中(圖3G、3g),性腺中充滿大量原始生殖細胞。高溫組(圖3C、3c)與皮質醇組(圖3H、3h)XY個體精巢與對照組(圖3E、3e)XY個體相比,形態(tài)上無明顯區(qū)別。

圖4是黃顙魚62日齡組織學,在結束處理4周之后(35日齡處理結束),高溫組(圖4B、4b)和皮質醇組(圖4G、4g)性逆轉的XX偽雄魚精巢結構仍然保留32日齡時觀察到的卵巢腔結構。對照組XY雄魚(圖4E、4e)精原細胞有絲分裂大量增值充滿整個精巢,精小葉的形成標著著精巢解剖學水平上的分化。高溫組(圖4C、4c)、對照組(圖4E、4e)和皮質醇組(圖4H、4h)XY雄魚精巢處于發(fā)育的第Ⅰ期,精巢中精原細胞細胞核較大,位于細胞中央。高溫組(圖4B、4b)和皮質醇組(圖4G、4g)性逆轉的XX偽雄魚精巢組織較大,精巢組織充滿大量無明顯核仁的初級精母細胞,說明性逆轉XX偽雄魚精巢比正常XY雄魚大。高溫組(圖4A、4a)和皮質醇組(圖4F、4f)XX雌魚與對照組XX雌魚(圖4D、4d)相比,初級卵母細胞的形態(tài)結構、大小等無明顯差異。

圖5是黃顙魚122日齡組織學,在結束處理11周之后,高溫組(圖5B、5b)和皮質醇組(圖5G、5g)性逆轉的XX偽雄魚并未觀察到32日齡和62日齡時觀察到的卵巢腔結構,而具有典型精小葉和精小囊結構。對照組XY雄魚(圖5E、5e)精巢處于發(fā)育第Ⅲ期,精原細胞和精母細胞有絲分裂大量增值充滿整個精巢。高溫組(圖5C、5c)和皮質醇組(圖5H、9h)XY雄魚精巢處于發(fā)育的第Ⅳ期,精巢的精小囊內除了有精原細胞外,還有大量的精母細胞,并向腹壺腔內推進,腹壺腔中央充滿大量精子細胞。高溫組(圖5B、5b)性逆轉的XX偽雄魚精巢處于發(fā)育的第Ⅳ期,精巢中充滿大量的精子細胞。皮質醇組(圖5G、5g)性逆轉的XX偽雄魚精巢處于發(fā)育第Ⅲ期,精細小管出現(xiàn)管腔,精細小管內充滿大量精原細胞和精母細胞,細胞圓形或橢圓形,細胞質嗜堿性。高溫組(圖5A、5a)、對照組XX雌魚(圖5D、5d)和皮質醇組(圖5F、5f)卵巢發(fā)育至第Ⅱ期,細胞呈圓形或橢圓形,處于初級卵母細胞小生長期細胞,細胞核中核仁數(shù)量增多,靠近核膜內側分布,卵母細胞膜外包圍一層由濾泡細胞構成的濾泡膜。

圖3 黃顙魚XX與XY遺傳型幼魚32日齡性腺組織學Fig.3 Representative gonadal histology at 32 days post-hatching(DPH)of XX and XY yellow catfish

圖4 黃顙魚XX與XY遺傳型幼魚62日齡性腺組織學Fig.4 Representative gonadal histology at 62 days post-hatching(DPH)of XX and XY yellow catfish

此外,我們逐條檢查了具有生殖突的個體21尾,利用性別特異分子標記鑒定發(fā)現(xiàn),其中10尾魚為XX基因型。表明XX偽雄魚具有雄魚特有的生殖突結構,可能具有正常的生殖能力。

2.4 溫度和皮質醇處理對黃顙魚性比的影響

黃顙魚幼魚發(fā)育至62和122日齡,通過組織學鑒定生理型性別,并統(tǒng)計各處理組雌雄性別比例。如圖所示(圖6A、6B)對照組沒有個體發(fā)生性逆轉,高溫和皮質醇處理組中均有一定比例的XX雌魚性逆轉為XX偽雄魚,62日齡高溫組中幼魚雄性率為63.3%,其中XX雌性個體中有26.7%發(fā)生性逆轉,皮質醇組中幼魚的雌、雄比例為1﹕29,其中皮質醇組XX雌性個體中有96.7%發(fā)生性逆轉。122日齡高溫組中幼魚的雌、雄比例為1﹕5.3,其中XX雌性個體中有62.5%發(fā)生性逆轉,皮質醇組中幼魚的雄性率為77.8%,其中皮質醇組XX雌性個體中有55.6%發(fā)生性逆轉。

圖5 黃顙魚XX與XY遺傳型幼魚122日齡性腺組織學Fig.5 Representative gonadal histology at 122 days post-hatching(DPH)of XX and XY yellow catfish

3 討論

3.1 皮質醇可能在高溫誘導XX遺傳型雌魚性逆轉中起關鍵作用

高等脊椎動物,性別通常由基因決定,而在魚類中,性別由基因或環(huán)境或它們共同決定[35]。魚類的性別分化極易受到環(huán)境因素的影響,包括溫度、密度[26,27,41]、pH[42,43]、餌料豐度、環(huán)境背景色[31]、溶氧水平[44]和鹽度[45]等,因此,對于很多魚類來說,性別最終是遺傳基因和環(huán)境因素相互作用的結果[46]。研究表明,幾乎在所有的應激條件下,魚類的性腺都朝著雄性方向分化[47]。應激條件主要通過以下三個方面引起魚類雄性化[8,9]:(1)提高雄激素水平及相關基因表達;(2)抑制卵巢分化通路;(3)抑制原始生殖細胞的增值。研究發(fā)現(xiàn),高溫和皮質醇處理會導致魚類芳香化酶活性升高,抑制生殖細胞的增殖和卵母細胞的發(fā)育,同時導致體內皮質醇、11-甲基睪酮(11-KT)和睪酮(Testosterone,T)水平升高,使魚類雄性化[15,21,24,29,30]。通過4個方面的證據(jù):(1)環(huán)境應激條件在魚類性別分化關鍵時期誘導雄性化過程中無一例外地導致皮質醇水平升高[47];(2)皮質醇處理也能誘導雄性化[15];(3)而皮質醇合成酶抑制劑能抵消高溫等應激條件誘導的雄性化[22],(4)雌二醇處理能解救皮質醇或高溫誘導的雄性化[23],我們推測皮質醇很有可能是環(huán)境應激誘導雄性化過程中的關鍵因子。同時,從單細胞動物偶爾通過有性生殖來抵御不良環(huán)境,到水生甲殼類通過無性生殖轉變?yōu)橛行陨硜矶蛇^環(huán)境壓力[48],再到環(huán)境應激普遍性誘導魚類與爬行動物雄性化[47],這些證據(jù)將個體抵御環(huán)境應激的通路與性起源與維持聯(lián)系在一起,而皮質醇作為個體最主要的抗應激激素,在其中可能起到關鍵作用。

本實驗高溫和皮質醇處理黃顙魚幼魚有部分XX遺傳型雌魚性逆轉為XX偽雄魚,皮質醇組雌性個體中85.7%發(fā)生性逆轉,高溫組中有39.2%發(fā)生雄性化,說明部分XX遺傳型雌魚個體對皮質醇與高溫處理并不敏感。這種同樣基因型個體存在溫度敏感性差異現(xiàn)象,在斑馬魚(Danio rerio)[26]和羅非魚(Oreochromis niloticus)[49]中有報道,但是這其中的機制卻不得而知。我們發(fā)現(xiàn),對照組32日齡雌性性腺中觀察到卵原細胞,而此時高溫組未發(fā)生性逆轉的XX雌性個體中觀察到較大的初級卵母細胞,且高溫處理組的細胞數(shù)量較對照組更多。劉菲菲[50]將孵化后5d的尼羅羅非魚(Nile Tilapia)高溫(36±1)℃處理12d,25日齡高溫組未發(fā)生性逆轉的個體也同樣觀察到較大的卵母細胞,與本實驗結果相似,說明高溫對未發(fā)生性逆轉個體的生殖細胞的發(fā)育具有促進作用,使卵巢發(fā)育比對照溫度提前。同樣是XX基因型個體,同樣在高溫處理下,一部分個體卵巢發(fā)育加快,而另一部分卵巢發(fā)育受到抑制繼而發(fā)育成精巢,這背后的機制需要我們進一步挖掘。溫度型性別決定兩大問題還未知:(1)溫度型性別決定的遺傳機制;(2)溫度如何進行信號傳遞從而決定性別或者引起性逆轉。而遺傳-環(huán)境共同性別決定的魚類如黃顙魚、羅非魚等是研究這一問題的最好材料。我們推測,相同基因型的XX個體對溫度處理表現(xiàn)出完全相反的表型,是因為它們在遺傳上存在差異,因此尋找這些差異是我們應當重點關注的研究方向,是解開性別決定進化與性別決定機制轉換的重要途徑。

圖6 高溫與皮質醇處理對黃顙魚性別比例的影響Fig.6 Effects of high temperature and cortisol treatments on sex ratios of yellow catfish

3.2 XX遺傳型個體中存在溫度敏感型與溫度不敏感型

目前,溫度對于黃顙魚性別分化的報道存在分歧,游鑫等[33]發(fā)現(xiàn)32℃處理黃顙魚受精卵至60日齡能顯著提高雄魚比例,而Zhang等[51]報道稱,用高溫32℃和34℃處理黃顙魚幼魚45d對性比沒有顯著影響;而Xiong等[52]報道稱32℃和34℃能導致XX全雌種群(芳香化酶抑制劑誘導的XX雄魚與XX雌魚的后代)的雄性化,并且在Zhang等[51]研究結果的基礎上,推測人工誘導性逆轉可能導致黃顙魚從GSD轉變成了TSD。我們的研究結果與這種推測不相符。同一種魚類不同地理種群對溫度的敏感性具有較大的差異[53,54],可能是造成實驗不同結果的原因,后續(xù)實驗我們也將關注這方面的問題,區(qū)分不同種群對于溫度處理的敏感性。在本研究中,通過對每尾實驗魚進行遺傳型性別鑒定(性別特異分子標記)和生理型性別鑒定(組織學切片),明確在我們實驗種群中,一定比例的XX遺傳型個體性腺發(fā)育為精巢樣結構。并且在122日齡時可明顯觀察到高溫組(圖5B、5b)和皮質醇組(圖5G、5g)性逆轉的XX偽雄魚具有雄性特有的生殖突,組織學顯示其具有典型精小葉和精小囊結構,精巢的精小囊內除了有精原細胞外,還有大量的精母細胞和精子細胞。因此,我們用確切的證據(jù)證明,高溫處理能導致XX遺傳型個體性逆轉為生理型雄魚,并且推測XX偽雄魚可能具有生殖能力,這些XX偽雄魚生殖能力有待進一步研究確認。

在之前的報道中,經(jīng)皮質醇(26℃)和高溫(33℃)處理XX青鳉仔魚,皮質醇處理組中48%的XX雌性個體性逆轉為XX偽雄魚,而高溫組中只有25%雌性發(fā)生性逆轉,皮質醇處理過的青鳉仔魚皮質醇水平明顯高溫處理組[22]。此外,用不同濃度的皮質醇(0、100、300 mg/kg)處理Southern flounder(Paralichthys lethostigma)幼魚,性逆轉的比例具有明顯的濃度依賴性[27]。血漿中皮質醇激素的清除依賴于結合蛋白、靶組織受體等,外源激素在體內消除相對較慢[28,55],因此,外源皮質醇激素比魚體內應激而導致皮質醇激素具有更明顯的性逆轉作用,這可能是外源皮質醇處理黃顙魚比高溫更能引起魚類雄性化的原因之一。青鳉仔魚用皮質醇和高溫處理均可引起雌魚向雄魚的性別逆轉,組織學觀察表明性逆轉的XX雄魚具有典型的精巢[21]。黃顙魚62日齡組織學,高溫組和皮質醇組性逆轉的XX偽雄魚精巢結構仍然保留32日齡時觀察到的卵巢腔結構,說明高溫和皮質醇處理對黃顙魚性腺分化具有持續(xù)性。在高溫和皮質醇處理組中,62日齡時XX偽雄魚的精巢與對照組XY雄魚相比性腺較大,精巢中充滿著無明顯核仁的初級精母細胞,但細胞排列疏松,存在較多的體細胞,而此時對照組XY雄魚精巢組織充滿大量的精原細胞。122日齡時,精巢中并未觀察到之前32日齡和62日齡時觀察到的卵巢腔結構。我們對比發(fā)現(xiàn),62日齡時,XX偽雄魚的卵巢腔較32日齡時明顯縮減,精巢結構朝卵巢腔內延展,開始出現(xiàn)黃顙魚精巢典型的分枝狀結構,這可能是122日齡時卵巢巢消失的主要原因。Kitano等[23]在早期報道中表示高溫和皮質醇處理能使XX青鳉發(fā)生性逆轉,性逆轉的XX偽雄魚精巢生殖細胞數(shù)目少于正常XY雄魚,高溫和皮質醇誘導魚類雄性化,性逆轉的個體性腺細胞發(fā)育比對照組快,說明XX偽雄魚精巢發(fā)育比正常XY雄魚快,但性逆轉性腺中體細胞較多而生殖細胞較少。

3.3 個體生長取決于生理型性別而非遺傳型性別

本實驗中高溫和皮質醇組性逆轉XX偽雄魚全長高于XX雌魚和XY雄魚,表明高溫或皮質醇誘導的XX偽雄魚生長比正常XY雄魚快。在此之前的報道中虹鱒仔魚用皮質醇處理,性逆轉的XX虹鱒偽雄魚的平均體重和平均性腺重明顯增加[29],在尼羅羅非魚也發(fā)現(xiàn)高溫處理XX雄魚比正常XY雄魚生長快[50],說明高溫和皮質醇的作用并不局限性腺,對魚類的生長也有一定的促進作用。研究發(fā)現(xiàn),高溫處理抑制cyp19a1 mRNA表達,導致雄激素和皮質醇水平顯著升高[16],外源皮質醇和皮質酮激素可以轉化為雄激素[15,29],精巢分泌雄激素對魚類的生長有促進作用[56]。此外,皮質醇作為一種糖皮質激素可以直接作用于腎上腺,加強腎上腺皮質細胞類固醇合成能力[57],這些可能是導致XX雄魚比正常XY雄魚生長快的原因。另一方面,我們發(fā)現(xiàn),62日齡時XX偽雄魚精巢組織遠比正常XY雄魚大(圖4),可能產(chǎn)生更多的雄激素和生長激素,表明性腺大小也可能是決定同一性別個體大小的重要因素。在羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn),性腺切除顯著抑制雌雄個體生長,而這種抑制作用可以通過性腺植入而獲得挽救[58],表明性腺在生長中的重要作用。

魚類的性腺發(fā)育有2種類型:一種是性腺直接發(fā)育為卵巢或精巢;另一種性腺最初是雌性同體,但隨后發(fā)育為卵巢或者精巢[59]。斑馬魚屬于第二種類型,性腺最初發(fā)育為卵巢,隨后一部分個體卵巢組織退化,卵母細胞凋亡,最終發(fā)育為雄性,卵母細胞凋亡是斑馬魚卵巢-精巢轉化的重要原因[60]。本實驗黃顙魚32日齡性腺組織學我們觀察到高溫和皮質醇處理誘導了一部分XX遺傳型雌魚雄性化,一部分未發(fā)生性逆轉的XX雌魚正常發(fā)育為生理型雌魚,有趣的是另一部分性逆轉的XX偽雄魚保留了原有的卵巢腔結構,內部結構卻是雄性生殖細胞。32日齡組織學觀察皮質醇組未發(fā)生性逆轉的個體中也觀察到卵原細胞和部分初級卵母細胞,其中有部分未發(fā)生性逆轉的XX雌魚性腺中,卵巢含有空泡化組織,細胞邊緣皺縮,無論從大小還是形狀上,似乎是卵原細胞退化而形成的,可能是退化的卵巢向精巢分化的過渡階段。在性別分化時期將青鳉仔魚暴露在高溫(33℃)下,通過提高皮質醇水平,抑制雌性生殖細胞的增值和fshrmRNA的表達,從而導致XX雌性發(fā)生性逆轉[22]。研究發(fā)現(xiàn),高溫導致雌性斑馬魚雄性化是由于抑制芳香化酶表達[19],從而誘導早期卵母細胞凋亡。高溫處理尼羅羅非魚性腺具有很強的凋亡信號[50],孵化后的青鳉暴露于高溫和皮質醇下會抑制雌性生殖細胞的增值和cyp19ala表達,此結果也在Olive flounder(Paralichthys olivaceus)[21,30]、虹鱒[29]有相應報道。因此,抑制雌性性別分化相關通路,抑制原始生殖細胞發(fā)育或誘導其凋亡,在應激條件誘導雄性化過程中起關鍵作用。

本實驗主要研究高溫和皮質醇處理對黃顙魚性別分化的影響,研究表明高溫和皮質醇處理通過抑制卵母細胞發(fā)育,導致性腺細胞發(fā)生凋亡,啟動精巢發(fā)育通路,從而誘導XX遺傳型個體雄性化。XX遺傳型個體受到高溫處理后,一部分個體性腺發(fā)育進程加快,一部分個體原始生殖細胞受到抑制甚至凋亡繼而發(fā)育成生理型雄魚,它們之間的遺傳差異值得我們進一步研究。環(huán)境友好型應激條件(如高溫、高密度等)誘導魚類雄性化的研究,將為建立魚類環(huán)境友好型單性種群生產(chǎn)提供重要的理論與生產(chǎn)實踐意義。