沙潁河下游城市黑臭內(nèi)河沉積物微生物群落季節(jié)變化特征

陳倩茹 夏 雪 王 川 李前正 張洪培 陳迪松 吳振斌 周巧紅

(1.武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,武漢 430070;2.中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072;3.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

近年來城市化進(jìn)程加速了河流污染并致使河流黑臭現(xiàn)象頻發(fā)[1,2]。黑臭河流威脅水生生態(tài)環(huán)境,嚴(yán)重影響居民的身心健康[3]。導(dǎo)致河流黑臭現(xiàn)象發(fā)生的外源性因素包括排放到河流中過量的有機(jī)物質(zhì)、重金屬及營養(yǎng)元素等[4]。內(nèi)源因素包括河流中生物地球化學(xué)循環(huán)的破壞,如碳、氮、磷和硫循環(huán),其中硫循環(huán)的影響甚大[5]。微生物在河流生態(tài)系統(tǒng)的生物地球化學(xué)循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用[6,7]。在環(huán)境脅迫下微生物通常形成一些特定的群落結(jié)構(gòu)[8,9],優(yōu)勢微生物群落的變化及其與其他微生物群落的相互作用通常會(huì)影響微生物生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性[10]。對(duì)污染沉積物中微生物群落的表征可以提供識(shí)別潛在生物指示物種和響應(yīng)特定污染物的生物標(biāo)志物群落的機(jī)會(huì)[11]。因此,研究沉積環(huán)境中微生物群落的組成和優(yōu)勢群及監(jiān)測它們的變化至關(guān)重要。沉積物質(zhì)量監(jiān)測和評(píng)價(jià)體系中往往忽略具有重要生態(tài)功能的微生物群落,缺乏生態(tài)系統(tǒng)多群落水平的調(diào)查研究。目前黑臭沉積物的微生物群落研究主要致力于垂直分布[11]、水體修復(fù)演化等[13],特別缺乏季節(jié)變化特征分析。就黑臭河流而言,它是硫化合物的儲(chǔ)存庫。典型的黑臭河含有38.8—222.6 mg/L的[14],在這樣的環(huán)境中,微生物還原硫酸鹽產(chǎn)生有異味的揮發(fā)性硫化合物,包括無機(jī)H2S和有機(jī)硫化物[15],導(dǎo)致河流發(fā)臭[3]。而Fe2+和Mn2+與硫離子結(jié)合產(chǎn)生的金屬硫化物被吸附在懸浮顆粒上,導(dǎo)致河流呈現(xiàn)黑色[3]。因此,亟需揭示與硫酸鹽還原相關(guān)的生物特征。

本文選取沙潁河流域下游城市黑臭內(nèi)河為研究對(duì)象,采用高通量測序技術(shù)對(duì)沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,并結(jié)合沉積物的理化性質(zhì),分析微生物群落群落結(jié)構(gòu)特別是硫酸鹽還原菌與環(huán)境因子的關(guān)系,以期為黑臭成因和治理提供一定的支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況及采樣點(diǎn)設(shè)置

本研究的采樣點(diǎn)位于沙潁河下游安徽阜陽段城區(qū),選取在《阜陽市人民政府辦公室關(guān)于印發(fā)阜陽城區(qū)黑臭水體五年整治計(jì)劃的通知》中列出的22條黑臭河流中的兩條黑臭河道,七漁河和中清河。于2018年1月、4月、7月和11月在兩條黑臭河道中清河、七漁河的5個(gè)樣點(diǎn)分別采集沉積物樣品,其中中清河設(shè)置3個(gè)樣點(diǎn),七漁河設(shè)置2個(gè)樣點(diǎn),樣點(diǎn)分布見圖1和表1。使用彼得森采泥器采集樣點(diǎn)的表層沉積物樣品(0—5 cm深),每個(gè)樣點(diǎn)共取樣3次,混合均勻后立即將樣品放置到無菌塑料袋中,隨后儲(chǔ)存到便攜冰箱中運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。在樣品均質(zhì)化后,將一部分沉淀物樣品儲(chǔ)存在-80℃的無菌管中用于DNA提取,并將剩余的沉淀物樣品儲(chǔ)存在4℃下用于理化性質(zhì)分析。

圖1 阜陽城市黑臭內(nèi)河采樣點(diǎn)分布Fig.1 Distribution of the sampling sites in urban black-odorous river,Fuyang

1.2 沉積物理化指標(biāo)分析方法

測量的沉積物理化指標(biāo)包括T(Temperature,溫度)、pH、SOM(Soil organic matter,有機(jī)質(zhì))、TP(Total phosphate,總磷)、TN(Total nitrogen,總氮)、Cl-、F-及。TN測定用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法,TP測定用抗壞血酸還原磷鉬藍(lán)法,SOM測定用灼燒減重法。Cl-、F-及測定用離子色譜法(離子色譜儀ICS-1100)。

1.3 微生物群落的Ilumina MiSeq測序分析

沉積物微生物DNA提取,選用16S rDNA V3—V4區(qū)的通用引物341F(5′-CCTACGGGNGG CWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTAT CTAATCC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16]。第一輪PCR擴(kuò)增體系為30 μL:2×Taqmaster Mix(15 μL),Bar-PCR primer F(10 μmol/L)1 μL,Primer R(10 μmol/L)1 μL,Genomic DNA 10—20 ng,其余為H2O。PCR反應(yīng)程序如下:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,45℃退火20s,65℃延伸20s,循環(huán)5次。94℃變性20s:55℃退火20s;72℃延伸30s;循環(huán)5次,72℃延伸5min。第一輪擴(kuò)增結(jié)束后,引入Illμmina橋式PCR兼容引物,進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。PCR第二輪擴(kuò)增體系與第一輪相同,反應(yīng)程序如下:95℃預(yù)變性30s;95℃變性15s;55℃退火15s;72℃延伸30s;循環(huán)5次,最后72℃延伸5min。利用NEB kit試劑盒回收DNA。然后將擴(kuò)增好的產(chǎn)物的兩個(gè)末端加上接頭,采用Illumina Hiseq 2500/4000 with PE150測序平臺(tái)進(jìn)行測序分析(上海生工生物工程股份有限公司)。

表1 沙潁河流域各采樣位點(diǎn)詳細(xì)情況Tab.1 The introduction of sampling sites in the Shaying River Basin

1.4 生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列[17],根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系將成對(duì)的reads拼接成一條序列。通過barcode序列區(qū)分測序得到的原始測序序列,同時(shí)去除序列中的嵌合體及非特異性擴(kuò)增序列。使用兩步Uclust法將97%相似水平的序列分類為運(yùn)營分類單位[18](Operational Taxonomic Units,OTU),并對(duì)樣本的Chao豐度指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。整合Silva[19]和NCBI 16S二個(gè)數(shù)據(jù)庫與細(xì)菌OTU代表性序列進(jìn)行同源性比對(duì)。采用RDP classifier對(duì)OTU進(jìn)行物種分類,利用R對(duì)物種分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖。

使用Origin(8.5版本)繪制門水平優(yōu)勢物種豐度柱狀圖;利用SPSS(17.0版本)軟件分析沉積物理化因子及門水平優(yōu)勢物種在季節(jié)間的差異,在P＜0.05時(shí),差異被認(rèn)為是顯著的;結(jié)合Pearson相關(guān)性分析和CANOCO軟件(5.0版本)來進(jìn)行評(píng)估環(huán)境因素與微生物群落之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 沉積物理化性質(zhì)

沉積物四季的理化指標(biāo)測定結(jié)果如表2所示,TN含量為1160—14340 mg/kg,TP含量為1110—4120 mg/kg。將其與沉積物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Sediment Quality Guidelines,SQG)[20]比較,發(fā)現(xiàn)沉積物4個(gè)季節(jié)樣品均處于污染狀態(tài),就TN含量而言:約有68.4%的沉積物樣品處于中度污染,31.6%的沉積物樣品處于重度污染;就TP含量而言:約有26.3%的沉積物樣品處于中度污染,73.7%的沉積物樣品的處于重度污染。

表2 黑臭內(nèi)河沉積物理化因子測定結(jié)果Tab.2 The physico-chemical factors of sediments collected from urban black-odrous rivers

對(duì)沉積物理化指標(biāo)測定結(jié)果進(jìn)行差異性檢驗(yàn),TN含量在不同季節(jié)間差異明顯(P＜0.01),冬季的TP含量與夏秋兩季差異明顯(P＜0.05),其余指標(biāo)在不同季節(jié)間差異不明顯(P＞0.05)。春季TN、TP、SOM等含量較高,總體來說,阜陽黑臭內(nèi)河的沉積物在春季污染更為嚴(yán)重。

2.2 微生物群落的多樣性和豐富度季節(jié)特征

所有沉積物樣品高通量測序檢測得到的Coverage指數(shù)≥0.97,說明每個(gè)微生物樣品的OTUs都具有代表性,可以很好地反映微生物樣品信息。種群多樣性代表著一個(gè)群落中種的數(shù)量和各種的個(gè)體數(shù)量關(guān)系,同時(shí)還能反映群落的穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)。通常Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)被用來評(píng)價(jià)物種的多樣性情況,Shannon指數(shù)越高說明多樣性越高,本研究中春季(5.44)＞冬季(4.92)＞夏季(4.61)＞秋季(3.82),而Simpson指數(shù)越低說明物種的多樣性越高,春季(0.03)＜夏季=冬季(0.07)＜秋季(0.17)?？偟膩砜?在黑臭河流中沉積物的微生物多樣性指數(shù)均不高,但是表現(xiàn)出一定的變化規(guī)律,即春季＞冬季≥夏季＞秋季。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)通常被用來評(píng)價(jià)種群的豐富度,指數(shù)越高說明物種數(shù)越多,物種數(shù)由大到小依次為春季、冬季、秋季和夏季。春季微生物的多樣性和豐富度最高,這可能與春季沉積物高污染負(fù)荷有關(guān)。

根據(jù)微生物多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的皮爾遜相關(guān)分析系數(shù)(表3),可以看出四季中沉積物微生物多樣性受季節(jié)與pH影響較顯著。溫度是決定微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子,溫度升高微生物群落多樣性增加[21—24],溫度可用來預(yù)測微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化,然而,在本研究中,阜陽黑臭沉積物的微生物多樣性(Shannon_index)與季節(jié)表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)(P=0.003),微生物豐富性(Chao1_index)與季節(jié)成顯著負(fù)相關(guān)(P=0.021),與溫度的關(guān)系不顯著,可能是由于沙潁河流域春秋季干旱頻發(fā),水位較低[25],從而影響了沉積物中的微生物的豐富度和多樣性。pH是決定微生物群落結(jié)構(gòu)的另一關(guān)鍵因子,pH可以通過影響不同種類微生物的生長狀況和生態(tài)系統(tǒng)中的其他環(huán)境因子來直接或間接影響微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性[26,27]。

表3 微生物群落多樣性與沉積物之間的皮爾遜相關(guān)分析系數(shù)Tab.3 Pearson correlation analysis coefficient between microbial community diversity and physico-chemical factors of sediments

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)季節(jié)特征

所有沉積物樣品共測定到42個(gè)門,4個(gè)季節(jié)中變形桿菌都是第一優(yōu)勢門,占比為40.3%—70.5%,這與之前學(xué)者對(duì)長江口沉積物的微生物組成研究一致[28,29]。除變形桿菌門外,優(yōu)勢菌門分別為厚壁菌門、綠彎菌門、疣微菌門、浮霉菌門、擬桿菌門和放線菌門。多項(xiàng)研究表明,變形桿菌、擬桿菌門和酸桿菌是沉積物環(huán)境中的優(yōu)勢微生物,它們始終是厭氧氨氧化、硫酸鹽還原等生物地球化學(xué)過程的重要貢獻(xiàn)者[28—30]。

比較沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(如圖2所示),變形桿菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、疣微菌門、擬桿菌門和放線菌門等優(yōu)勢菌門的相對(duì)豐度均在季節(jié)水平上存在差異。與其他季節(jié)相比較,春季厚壁菌門、綠彎菌門、放線菌門及酸桿菌門相對(duì)豐度較大,春季變形桿菌門相對(duì)豐度小于其他三季。由于綠彎菌門和酸桿菌門是已知指示污染的微生物[31],這在一定程度上說明春季沉積物污染更嚴(yán)重。秋季疣微菌門與擬桿菌門富集程度顯著減小,變形桿菌門相對(duì)其他季節(jié)顯著增加。而有研究表明變形菌門在微生物脫氮、氧化硫化物及降解有機(jī)物等具有主要作用,且大部分變形菌門的微生物在厭氧條件下仍可進(jìn)行反硝化過程[32—34],因此推斷秋季微生物降解污染物的能力更強(qiáng)。這與2.1中得出的阜陽沉積物在春季污染更為嚴(yán)重的結(jié)論一致。

2.4 沉積物微生物群落與環(huán)境因子相關(guān)性

沉積物微生物群落受到各種環(huán)境因素的影響[35,36]。為了探討環(huán)境因素對(duì)微生物豐度和群落組成的影響,本研究利用冗余性分析(Redundancy analysis,RDA)探討微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性。如圖3所示,在由主軸1和主軸2構(gòu)成的排序圖中,環(huán)境因子用帶有箭頭的紅色線段表示,向量長短代表了其在主軸中的作用,箭頭所處象限表示環(huán)境因子與排序軸之間相關(guān)性的正負(fù)。圖3反映了4個(gè)季度沙潁河沉積物微生物群落組成、結(jié)構(gòu)沿環(huán)境梯度變化的趨勢。在RDA排序圖中,與第一排序軸(水平)關(guān)系最大的是Cl-和F-,呈正相關(guān)。與第二排序軸(垂直)關(guān)系最大的是溫度及pH,呈正相關(guān),SOM、TN、TP及呈負(fù)相關(guān)。4個(gè)季度的微生物在生態(tài)適應(yīng)上既有重疊現(xiàn)象,又表現(xiàn)出對(duì)各自棲息生境的特殊適應(yīng)特點(diǎn),SOM、溫度及pH等相關(guān)環(huán)境因子可能是影響其分布的重要因素。

圖2 四季門水平優(yōu)勢沉積物微生物群落差異Fig.2 Seasonal difference of dominant microbial communities in sediments at the phylum level

圖3 門水平上的微生物群落與環(huán)境因子的RDA分析Fig.3 Redundancy analysis of microbial community and environmental factors based on phylum level

對(duì)各門水平上的微生物與環(huán)境因子進(jìn)行Pearson分析,發(fā)現(xiàn)在門水平上受季節(jié)和溫度影響的微生物較多。在沉積物理化指標(biāo)中,TN及SOM的含量對(duì)門水平上的環(huán)境微生物影響較大,這是因?yàn)闋I養(yǎng)元素可以用作碳或能量的來源,從而影響微生物群落的結(jié)構(gòu)[37]。

環(huán)境因素對(duì)微生物群落和功能具有抑制或促進(jìn)作用[38]。變形菌門與SOM(r= -0.489,P=0.034)和TN(r= -0.540,P=0.017)顯著負(fù)相關(guān),厚壁菌門與總氮顯著正相關(guān)(r=0.503, P=0.028),綠彎菌門則與硫酸鹽顯著正相關(guān)(r=0.514,P=0.020),與SOM(r=0.603,P=0.006)及總氮(r=0.625,P=0.004)含量呈極強(qiáng)正相關(guān),與pH顯著負(fù)相關(guān)(r= -0.570,P=0.011)。但本研究中仍有部分微生物如Chlamydiae、Aminicenantes等未表現(xiàn)出與環(huán)境因子相關(guān),這可能是因?yàn)樵撗芯恐形⑸镩T類與環(huán)境因子之間的關(guān)系可能受到混雜因素的影響,但其作用可能難以區(qū)分[37]。

2.5 硫酸鹽還原菌的季節(jié)特征

硫化氫與其他還原硫(S)化合物是黑臭水體中惡臭的主要來源[39—41]。在污染嚴(yán)重的石井河中檢測出4種惡臭揮發(fā)性有機(jī)硫化物[42]。硫酸鹽還原菌(Sulfate-reducing bacteria,SRB)可以利用含硫化合物作為能量代謝過程的主要成分進(jìn)行異化性硫酸鹽還原,從而產(chǎn)生H2S。部分SRB還能將Fe3+還原為Fe2+,Fe2+與硫化氫反應(yīng)形成硫化亞鐵(FeS)黑色懸浮物質(zhì),導(dǎo)致水體發(fā)黑[43]。因此,SRB是導(dǎo)致水體發(fā)黑發(fā)臭的主要微生物。然而,很少有研究者研究黑臭沉積物中SRB的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化。

本研究根據(jù)高通量測序的結(jié)果篩選出其中的SRB菌屬,在樣品中共發(fā)現(xiàn)16個(gè)SRB菌屬(表4),Desulfoprunum是本實(shí)驗(yàn)沉積物中SRB豐度最高的菌屬。進(jìn)一步分析SRB的季節(jié)特征,春季與秋季SRB菌屬相對(duì)豐度存在顯著差異(P=0.017)。春季沉積物中Desulfoprunum屬相對(duì)豐度最高,而Desulfoprunum屬嚴(yán)格厭氧,說明春季沉積物處于厭氧狀態(tài)。春季沉積物中SRB的類群最多,相對(duì)豐度最大,這些結(jié)果表明在春季該沉積物環(huán)境更適于SRB類群生長繁殖。為避免水體發(fā)黑發(fā)臭,應(yīng)在春季控制SRB的數(shù)量。

表4 硫酸鹽還原菌屬與環(huán)境因子之間的皮爾遜相關(guān)分析系數(shù)Tab.4 Pearson correlation analysis coefficient between sulfatereducing and environmental factors

對(duì)硫酸鹽還原菌與環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析,Desulfovibrio屬與含量呈極強(qiáng)正相關(guān)(r=0.617,P=0.004),Desulfuromonas(r=0.476,P=0.034)、Desulfonema(r=0.462,P=0.040)、Desulfobacula(r=0.462,P=0.040)與TN呈顯著正相關(guān),Desulfosporosinus與TN呈極強(qiáng)正相關(guān)(r=0.660,P=0.002),Desulfosporosinus屬與SOM呈顯著正相關(guān)(r=0.475,P=0.040),Desulfosarcina與Cl-呈顯著正相關(guān)(r=0.448,P=0.048),Desulfomonile屬與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.494,P=0.017)。研究表明,硫酸鹽還原菌屬為厭氧異養(yǎng)微生物,其生長代謝依賴于含量,碳源及溶氧條件等[44,45]。本研究中硫酸鹽還原菌的相對(duì)豐度主要與TN、Cl-、SOM、含量相關(guān)。因此,為控制春季SRB的數(shù)量,應(yīng)控制春季沉積物中的營養(yǎng)物質(zhì)含量。

3 結(jié)論

與其他研究中沉積物微生物群落組成類似,本研究對(duì)黑臭內(nèi)河不同季節(jié)沉積物進(jìn)行測序,結(jié)果表明在門水平上,沉積物中優(yōu)勢菌門始終為變形桿菌、厚壁菌門、綠彎菌門、疣微菌門、浮霉菌門、擬桿菌門和放線菌門等,但這些菌門的相對(duì)豐度隨著季節(jié)變化而改變。春季指示污染的微生物如綠彎菌門和酸桿菌門相對(duì)豐度較高,秋季具有降解污染物能力的變形菌門相對(duì)豐度較高。這與對(duì)阜陽四季沉積物理化指標(biāo)進(jìn)行分析,得出的沉積物污染在春季更嚴(yán)重的結(jié)論一致。隨后對(duì)阜陽沉積物門水平上的微生物群落組成、環(huán)境因子進(jìn)行RDA分析,結(jié)果表明SOM、溫度及pH等相關(guān)環(huán)境因子是影響微生物群落的重要因素。

對(duì)四季沉積物中的SRB菌屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)春季沉積物中SRB的類群最多,相對(duì)豐度最大,而導(dǎo)致水體發(fā)臭的硫化氫氣體主要在SRB還原硫酸鹽的過程中產(chǎn)生,部分SRB還會(huì)還原Fe3+,導(dǎo)致黑色懸浮物質(zhì)FeS產(chǎn)生。因而,在黑臭沉積物的治理過程中,對(duì)SRB數(shù)量的控制尤為重要。對(duì)SRB與環(huán)境因子進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,得到SRB的豐度與、TN、SOM、Cl-等呈顯著正相關(guān)。因此為有效避免河流黑臭物質(zhì)的產(chǎn)生,建議在春季控制沉積物中營養(yǎng)物質(zhì)的含量。