基于轉(zhuǎn)錄組測序初步揭示天麻生長代謝的分子機(jī)制

劉云霞，狄永國，仇全雷，肖舒卉，譚彧文，陳麗梅，徐慧妮，李昆志*

1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500

2.昭通市昭陽區(qū)農(nóng)業(yè)局 種植業(yè)科，云南 昭通 657000

3.西藏波密高原藏天麻產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，西藏 林芝 860300

天麻是名貴傳統(tǒng)中藥材，具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)之功效，主治小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、破傷風(fēng)、頭痛眩暈、風(fēng)濕痹痛等癥[1-3]。天麻為藥食兩用的蘭科植物，具有極高的藥用和食用價(jià)值，擁有巨大的潛在市場，天麻需求量大。野生天麻活性成分含量高、藥效好，但產(chǎn)量低，不能滿足實(shí)際需求，且由于人工過度采集瀕臨滅絕，天麻供給主要靠人工種植。因此，天麻栽培成為天麻領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

天麻生長經(jīng)歷種子、原球莖、米麻、白麻和箭麻5個生長發(fā)育階段[4]。Kusano[5]首次報(bào)道了天麻與木材腐爛病原菌蜜環(huán)菌存在真菌菌根關(guān)系。隨后的研究表明，天麻種子萌發(fā)需要萌發(fā)菌如小菇屬M(fèi)ycena dendrobiiL.FanetS.X.Guo 侵入種胚細(xì)胞，為天麻種子萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)天麻種子萌發(fā)長出幼小的原球莖[6]。隨著原球莖進(jìn)一步生長，其前端分生組織處可直接分化出營養(yǎng)繁殖莖米麻。天麻可消化萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌入侵的菌絲作為其營養(yǎng)來源[7-9]，米麻從侵入的萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌獲得營養(yǎng)發(fā)育成營養(yǎng)繁殖莖白麻[10]。在接下來的生長中白麻的直接營養(yǎng)物質(zhì)是蜜環(huán)菌，蜜環(huán)菌侵入白麻后，白麻消化侵入的蜜環(huán)菌菌絲獲得營養(yǎng)后進(jìn)一步長出商品麻箭麻[11]。最近，研究者通過天麻轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，闡明了天麻種子萌發(fā)的機(jī)制[12-14]。譚彧文等[15]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)侵入到天麻體內(nèi)的蜜環(huán)菌其胞外酶和抗氧化酶的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）98.31%表達(dá)下調(diào)，說明侵入天麻體內(nèi)的蜜環(huán)菌活性減弱，不能進(jìn)一步入侵天麻，且不受到天麻脅迫作用，使蜜環(huán)菌和天麻處于共生狀態(tài)，初步揭示了天麻與蜜環(huán)菌的共生機(jī)制。袁媛等[16]測出天麻的全基因組序列發(fā)現(xiàn)，大部分與光合作用和抗病菌相關(guān)的基因如核酸結(jié)合部位（nucleotide-binding site，NBS）類基因發(fā)生了大量丟失，同時(shí)發(fā)現(xiàn)天麻的線粒體基因組擴(kuò)大且單子葉甘露糖結(jié)合凝集素抗真菌蛋白（gastrodia antifungal protein，GAFP）基因的數(shù)量增加，且發(fā)現(xiàn)天麻與蜜環(huán)菌共生關(guān)系建立的重要信號是獨(dú)角金內(nèi)酯，這些結(jié)果展現(xiàn)了完全異養(yǎng)植物天麻是如何通過實(shí)現(xiàn)廣泛的基因收縮甚至丟失、擴(kuò)張以及基因的新功能化來完成其獨(dú)特的生長特征，更深一步地闡述了天麻與蜜環(huán)菌的共生關(guān)系。文歡等[17]也通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)了天麻內(nèi)存在較完整的天麻苯丙烷類產(chǎn)物合成代謝通路。到目前為此，天麻各生長發(fā)育階段的生理形態(tài)特征比較清楚，蜜環(huán)菌能入侵營養(yǎng)繁殖莖白麻與其共生，但共生后進(jìn)一步生長為箭麻的生長代謝特征仍不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)錄組分析，在轉(zhuǎn)錄組水平的基礎(chǔ)上研究箭麻和共生天麻生長代謝過程中相關(guān)差異基因表達(dá)水平變化，揭示兩者間的基因表達(dá)水平的差異，以期闡釋箭麻和共生天麻間的生長代謝特征，為進(jìn)一步研究天麻不同生長發(fā)育階段的生理生化代謝特征奠定基礎(chǔ),同時(shí)為天麻栽培提供理論指導(dǎo)。

1 材料與儀器

1.1 材料

選取昭通產(chǎn)烏天麻作為研究材料，經(jīng)筆者鑒定為烏天麻Gastrodia.e lataBl.(F.gl auca) S.Chow。將蜜環(huán)菌Armillaria.mellea(Vahl) P.Kumm.接種于蘋果樹枝一段時(shí)間待長出蜜環(huán)菌菌絲后接種于營養(yǎng)繁殖莖白麻，成為共生天麻，接種3 個月長出箭麻后分別取2 種樣品，立即放入液氮中冷凍后儲存入-80 ℃冰箱中用于總RNA 提取。

1.2 儀器

Bio-rad CFX96 型熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）；DHP-9502 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；heraeus mutifuge X1R 型實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）。

2 方法

2.1 RNA 提取及質(zhì)量檢測

采用Trizol Reagent（Invitrogen）提取箭麻和共生天麻的RNA。將約0.1 g 樣品放入用液氮預(yù)冷的研缽中，磨碎后加入1 mL 的Trizol 提取液于研缽中繼續(xù)研磨至研磨液呈紅色透明狀，于室溫靜置5 min 后移入1.5 mL 離心管并加入0.2 mL 氯仿振蕩混勻；隨后在12 000 r/min、4 ℃離心15 min 后吸取上清液至新的離心管中；在加入0.25 mL 異丙醇和0.25 mL 氯化鈉與檸檬酸鈉混合高鹽液，混勻-20 ℃放置30 min后在12 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min，棄上清，沉淀用1 mL（-20 ℃ 預(yù)冷）的75%乙醇清洗，隨后在7500 r/min、4 ℃條件下離心5 min，棄乙醇，重復(fù)清洗2 次；然后將沉淀在室溫條件下自然晾干，最后用20 μL 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水溶解RNA。用分光光度計(jì)測量樣品RNA 的純度和濃度，檢測RNA 樣品的完整性。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序樣品制備及文庫建立

提取樣品總RNA 后，將破碎緩沖液加入到帶有Oligo（dT）磁珠富集的真核生物mRNA 中將其打斷成短片段。以mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第1 條cDNA 鏈，隨后加入緩沖液、RNase H、DNA 聚合酶I 和dNTPs 以合成第2 條cDNA 鏈。在經(jīng)過QiaQuick PCR 試劑盒純化并加EB 緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加poly（A）并連接測序接頭。最后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000 進(jìn)行高通量測序分析。

2.3 測序數(shù)據(jù)處理及分析

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)箭麻和共生天麻分別獲得平均28.97 Mb 和67.73 Mb 條原始測序序列（raw reads）。對raw reads過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)和測序引物、接頭等人工序列，得到clean reads。對過濾處理得到的clean reads 進(jìn)行Trinity 組裝生成轉(zhuǎn)錄本（transcript）和單基因簇（unigene）。再將Unigene 與Swiss-Prot（瑞士-波特蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫）、非冗余蛋白庫（non-redundant protein sequence database，NR）、京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和蛋白相鄰類的聚簇（cluster of orthologous groups of proteins，KOG）數(shù)據(jù)庫比對，獲得Unigene 功能注釋信息。

2.4 表達(dá)差異分析

使用RPKM 值表示Unigene 的表達(dá)豐度。滿足false discovery rate（FDR）＜0.05 且log2|FC|≥2 條件的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）。隨后對差異表達(dá)基因做基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析、KOG 注釋和KEGG 注釋與分類。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR) 分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中基因差異表達(dá)的正確性，選取轉(zhuǎn)錄組基因文庫內(nèi)與生長代謝過程中氮代謝相關(guān)的谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）、谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）、精氨酸酶（arginase，Argase）；碳代謝相關(guān)的蔗糖合成酶（sucrose synthase，SuSy）、可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SSS）、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）、淀粉酶（amylase，AMS）和與能量代謝相關(guān)的丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、己糖激酶（hexokinase，HK）、丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）、蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）、ATP 酶（adenosine triphosphatase，ATPase）14個具有代表性的基因，用Primer 6 設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR 相對表達(dá)分析[16]，根據(jù)其cDNA 片段設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。提取RNA后，用HiScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10 倍，用ChamQTM Universal SYBR ? qPCR Master Mix 做熒光定量。熒光定量在20 μL 體系含有10 μL 2×ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix，2 μL cDNA 模板和0.4 μL 每種基因特異性引物的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。最后使用CFX96TMReal-Time System 及其相對定量軟件進(jìn)行2次生物重復(fù)3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)參數(shù)為95 ℃、30 s，并以95 ℃、10 s，58 ℃、30 s 循環(huán)40 次。將cDNA 文庫分別標(biāo)準(zhǔn)化為參考基因β-actin。通過2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 測序數(shù)據(jù)組裝結(jié)果

3.1.1 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)表 測序后在G 樣本中平均獲得28.36 Mb 的高質(zhì)量clean reads，占raw reads 的97.92%，在GA-G 樣本平均獲得66.27 Mb 的高質(zhì)量的clean reads，占raw reads的97.84%。4個樣本clean reads Q30均大于92%，平均GC 含量為47.28%（表2）。對片段進(jìn)行拼接得72 244 個Unigene 轉(zhuǎn)錄物。

3.1.2 組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì) 對片段進(jìn)行拼接得到72 244個Unigene 轉(zhuǎn)錄物。組裝結(jié)果質(zhì)量評估可從N50數(shù)值來評估。將所有Unigene 從長到短排序，并依次累加長度。當(dāng)累加片段長度達(dá)到總片段長度（所有Unigene 的長度）的50%時(shí)，對應(yīng)那個片段的長度和數(shù)量，即為Unigene N50長度和數(shù)量。Unigene N50越長，數(shù)量越少，說明組裝質(zhì)量越好。在本實(shí)驗(yàn)中，由組裝結(jié)果得N50 長度為1733 bp，其中Unigene 序列最長為15 844 bp，最短為201 bp，平均長度為916 bp，長度在1000 bp 以上的Unigene有18 698 個，占總數(shù)的25.88%（表3）。

表1 qRT-PCR 擴(kuò)增特異引物Table 1 Specific primers of qRT-PCR amplification

表2 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)表Table 2 Data filter statistics table

表3 Unigene 長度分布統(tǒng)計(jì)Table 3 Length statistics of Unigene distribution

3.1.3 轉(zhuǎn)錄物功能注釋及分類 為了解轉(zhuǎn)錄物Unigene 序列信息，將組裝好的72 244 個Unigene序列比對到Swissprot、Nr、KEGG 和KOG 4 個數(shù)據(jù)庫中，有26 312 個Unigenes 獲得注釋信息，所占比例為36.42%。其中Unigenes 注釋成功最多的為Nr 和Swissprot 數(shù)據(jù)庫，分別為26 217 和17 886個。注釋在KOG 和KEGG 數(shù)據(jù)庫中的Unigenes 個數(shù)分別為16 625 和9 712（表4）。

表4 Unigene 功能注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Unigene functional annotation statistical results

3.2 基因差異表達(dá)分析

3.2.1 主成分分析（ principal component analysis，PCA） 在RNA 組學(xué)研究中利用PCA，將樣本所包含的上萬個維度的信息（上萬個基因的表達(dá)量），降維為數(shù)個維度的綜合指標(biāo)（主成分），以便于進(jìn)行樣本間的比較，同時(shí)保證原始數(shù)據(jù)中包含信息盡可能多地被保留[18]。使用R 語言包（http://www.r-project.org/）對共生天麻和箭麻所有樣品進(jìn)行PCA，如圖1 所示。根據(jù)共生天麻和箭麻在第1 主成分（PC1）和第2 主成分（PC2）2 個綜合指標(biāo)中的數(shù)值大小，做二維坐標(biāo)圖。從圖1 可以看出共生天麻-1 和共生天麻-2 分布在右側(cè)，箭麻-1 和箭麻-2 分布在左側(cè)，說明2 種樣品具有一定的差異性。PCA 分析中PC1（95.1%）和PC2（4.2%）對樣品中所有基因表達(dá)量總體方差貢獻(xiàn)率為99.3%，表明通過PCA 分析可以很好地區(qū)分箭麻和共生天麻。

圖1 共生天麻和箭麻樣品的PCAFig.1 Principal component analysis of symbiotic G.elata and mature tuber

3.2.2 分組間差異基因火山圖 比較箭麻與共生天麻的測序結(jié)果，以FDR＜0.05 且|log2FC|>1 為判斷標(biāo)準(zhǔn)，檢測到共有12 498 條基因發(fā)生顯著差異表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)基因數(shù)為9 000，占差異表達(dá)基因個數(shù)的72.01%；下調(diào)表達(dá)基因數(shù)為3 498占差異表達(dá)基因數(shù)的27.99%。差異表達(dá)直觀展示火山圖見圖2。

圖2 差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Differential expressed gene volcanic map

3.2.3 差異表達(dá)基因的GO 分類 如表5 所示，有10 473 條差異表達(dá)基因成功進(jìn)行了GO 分類。在GO 分類的3 個大類中有4723 條差異表達(dá)基因與生物學(xué)過程有關(guān)，占比為45.10%，其中富集最多的是代謝過程亞類，占比對到該功能類別總數(shù)的23.65%；有2508 條差異表達(dá)基因與分子功能相關(guān)，占比23.95%，其中富集最多的是催化活性亞類，共比對到該功能類別總數(shù)46.93%；與細(xì)胞成分有關(guān)的差異表達(dá)基因有3242 條，占比30.96%，富集最多的是細(xì)胞和細(xì)胞成分亞類，共比對到該功能類別總數(shù)的46.33%。

3.2.4 差異表達(dá)基因的KEGG 功能分析 箭麻與共生天麻樣本間的差異基因進(jìn)行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，有803 個差異基因比對到20 個KEGG 通路中。有較多基因歸類為苯丙素生物合成（phenylpropanroid biosynthesis）、淀粉與蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、植物激素信號傳導(dǎo)（plant hormone signal transduction）、碳代謝（carbon metabolism）、糖酵解/葡萄糖酵素（glycolysis/gluconeogenesis）和氮代謝（nitrogen metabolism）這幾類相關(guān)的通路之中，包含了生長過程中氮代謝、碳代謝和能量代謝（如糖酵解）等途徑，說明蜜環(huán)菌侵入天麻與天麻共生長出箭麻過程中，箭麻與共生天麻生長代謝過程中相關(guān)酶基因差異表達(dá)，兩者的代謝強(qiáng)弱有很大差別（表6）。

表5 箭麻和共生天麻差異表達(dá)基因GO 注釋Table 5 GO annotation of differentially expressed genes in mature tuber and symbiotic G.elata.

表6 箭麻和共生天麻差異基因的顯著富集的代謝途徑Table 6 Significant enrichment pathway of differentially expressed genes in mature tuber and symbiotic G.elata.

3.2.5 差異表達(dá)基因的KOG 功能注釋 在實(shí)驗(yàn)中共有26 980 個DEGs 注釋到KOG 的25 個分類中，其中7796 個Unigenes 注釋為一般功能預(yù)測（general functional predictio only，R），占比28.90%；2782個Unigenes 注釋為翻譯后修飾、蛋白質(zhì)分解及伴侶分子（ posttranslational modification,protein turnover，chaperenes，O），占比10.31%；2295 個Unigenes 注釋為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction mechanism，T），占比8.51%；1519 個Unigenes注釋為RNA 的加工和修飾（RNA processing and modification，A），占比5.63%；774 個Unigenes注釋為能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化（energy production and conversion，C），占比2.87%；816 個Unigenes 注釋為碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝（carbohydrate transport and metabolism，G），占比3.02%，628 個Unigenes注釋為次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（secondary metabolites biosynthesis，transport and catabolism，Q），占比2.32%（表7）。

3.2.6 箭麻和共生天麻中生長代謝關(guān)鍵差異基因表達(dá)分析 根據(jù)差異基因GO 分類、KEGG 功能分析和KOG 功能注釋，對箭麻和共生天麻生長代謝過程的相關(guān)基因進(jìn)行篩選。在箭麻和共生天麻轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)注釋的結(jié)果中篩選到與氮代謝、碳代謝和能量代謝相關(guān)酶的基因序列。在氮代謝途徑中，選取了差異表達(dá)的基因GS、ASNS、GDH、Argase；在碳代謝中選取了差異表達(dá)的基因SuSy、SSS、AGPase、AMS；在能量代謝中選取了差異表達(dá)的基因PK、HK、PDH、MDH、IDH、ATPase（表8）。從這些基因的表達(dá)趨勢來看，與合成氮，碳和能量的酶基因大部分呈上調(diào)，除分解能量的酶基因上調(diào)外，分解氮，碳的酶基因呈下調(diào)。說明蜜環(huán)菌侵染天麻與天麻共生時(shí)共生天麻各種代謝旺盛，合成各種有機(jī)物和能量物質(zhì)。

表7 差異表達(dá)基因的KOG 功能注釋Table 7 DEGs KOG annotation

3.2.7 箭麻和共生天麻中與各種代謝相關(guān)基因相對表達(dá)水平qRT-PCR 分析 選取的14 個與生長代謝過程相關(guān)關(guān)鍵差異酶基因的相對定量qRT-PCR分析結(jié)果見圖3。由2-ΔΔCt值計(jì)算箭麻和共生天麻中的相對表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示箭麻和共生天麻的這些基因表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。即與箭麻相比，共生天麻中合生碳、氮，能量物質(zhì)的顯著差異酶基因呈上調(diào)表達(dá)，除分解ATP的ATPase基因呈上調(diào)表達(dá)外，分解氮、碳的GDH、Argase和AMS基因呈下調(diào)表達(dá)。因此，本課題組認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄組分析中用RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads，每百萬reads 中來自于某基因每千堿基長度的reads 數(shù)）法推斷的基因表達(dá)水平是可靠的。

表8 箭麻和共生天麻中與生長代謝相關(guān)關(guān)鍵差異基因的表達(dá)情況Table 8 Expression of key differentially expressed genes in growth and metabolism of mature tuber and symbiotic G.elata.

圖3 箭麻和共生天麻中生長代謝相關(guān)基因相對表達(dá)水平分析Fig.3 Analysis of relative expression level of related genes in growth and metabolism in symbiotic G.elata and mature tuber

4 討論

4.1 共生天麻和箭麻的轉(zhuǎn)錄組測序分析

本研究利用Illumina HiseqTM2000 測序技術(shù)箭麻和共生天麻進(jìn)行測序，箭麻和共生天麻分別獲得4.23 Gb 和9.90 Gb 有效數(shù)。通過數(shù)據(jù)組裝獲得72 244 條Unigenes，N50長度為1773 bp，平均長度為916 bp 的非冗余Unigene，且Q30值均大于92%，說明組裝數(shù)據(jù)良好可信。同時(shí)將組裝好的72 244 個Unigene 序列比對到Swissprot、Nr、KEGG和KOG 4 個數(shù)據(jù)庫中有26 312 個Unigene 獲得注釋信息，所占比例為36.42%。將箭麻和共生天麻進(jìn)行PCA，發(fā)現(xiàn)箭麻和共生天麻在一定程度上有所差異，通過PCA 可以很好地區(qū)分箭麻和共生天麻。在FDR＜0.05 和|log2FC|>1 的條件下，比較兩組測序數(shù)據(jù)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)12 498 條DEGs，上調(diào)表達(dá)9000條，下調(diào)表達(dá)3498條。GO數(shù)據(jù)庫將10 473條差異表達(dá)基因分為生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成3 大類，其中代謝過程、細(xì)胞過程催化活性等功能小類富集較多。箭麻與共生天麻樣本中有803 個DEGs 比對到20 個KEGG 通路中，與箭麻和共生天麻的生長代謝過程相關(guān)的淀粉與蔗糖代謝、碳代謝、糖酵解/葡萄糖酵素等表現(xiàn)出顯著差異。將DEGs 注釋到KOG 的25 個分類中，含有能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化，碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝和次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能分類。根據(jù)DEGs 的GO 分類，KEGG 功能分析和KOG 功能注釋篩選出箭麻和共生天麻生長代謝（氮代謝、碳代謝和能量代謝）過程中的關(guān)鍵差異酶基因。qRT-PCR分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果基本一致。在差異表達(dá)的基因中，篩選到與天麻氮、碳和能量代謝相關(guān)基因，合成氮和碳營養(yǎng)物質(zhì)的差異基因表達(dá)上調(diào)，分解氮碳營養(yǎng)物質(zhì)的差異基因表達(dá)下調(diào)，能量相關(guān)的差異基因大多數(shù)表達(dá)上調(diào)。與箭麻相比較，共生天麻有利于氮、碳營養(yǎng)物質(zhì)和能量物質(zhì)合成。

4.2 共生天麻和箭麻中生長代謝過程相關(guān)關(guān)鍵差異基因分析

氮、碳和能量的積累在植物生長過程中至關(guān)重要，因此選取了氮代謝，碳代謝和能量代謝過程中的關(guān)鍵酶基因。氮素同化在植物生長和發(fā)育過程中是一個十分重要的生理過程。植物從外界吸收的無機(jī)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮必須先同化為谷氨酰胺和谷氨酸等有機(jī)物才能被植物利用。氨同化過程中谷氨酰胺合成酶是一個關(guān)鍵酶，它在ATP 供能條件下催化NH4＋同化為谷氨酰胺，然后在谷氨酸合酶作用下將其轉(zhuǎn)化生成谷氨酸。許多研究表明正常條件下高等植物氨同化的主要途徑是谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶構(gòu)成的循環(huán)反應(yīng)途徑[19]。谷氨酸脫氫酶參與催化谷氨酸分解為α-酮戊二酸和銨離子及其逆反應(yīng)合成谷氨酸的可逆反應(yīng)。天冬酰胺和精氨酸是植物體內(nèi)N/C 比值較高的氨基酸，是植物氮代謝過程中有機(jī)氮運(yùn)輸和儲存的主要形式。近年來進(jìn)一步研究表明，蘋果樹在越冬期間其體內(nèi)可溶性和蛋白態(tài)氨基酸中，精氨酸含量均很高，這說明蘋果樹中的氮素在越冬期間主要以精氨酸形式貯藏[20-22]。qRT-PCR 分析表明共生天麻GDH和ASNS基因都明顯上調(diào)，分解谷氨酸的GDH基因和分解精氨酸的Argase基因都呈下調(diào)，這些基因不同表達(dá)水平有利于共生天麻積累便于在植物體內(nèi)儲存運(yùn)輸?shù)墓劝滨０?，谷氨酸、天冬酰胺和精氨酸，為共生天麻和箭麻的基礎(chǔ)代謝和生長代謝提供氮素營養(yǎng)。

淀粉是高等植物在生長、發(fā)育和繁殖過程中重要碳水化合物營養(yǎng)物質(zhì)的貯藏形式，并且以往研究表明蔗糖主要參與淀粉等的合成。植物蔗糖代謝過程的關(guān)鍵酶是蔗糖合酶，它催化蔗糖的合成和分解，但研究表明它主要催化蔗糖分解為淀粉合成所需的葡萄糖和果糖[23]。并有研究表明蔗糖合酶作為關(guān)鍵代謝酶在馬鈴薯塊莖淀粉合成中為其提供前體物質(zhì)二磷酸尿核苷葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG）[24]，馬鈴薯中過量表達(dá)該酶可引起二磷酸腺苷葡萄糖（adenosine diphosphate glucose，ADPG）和UDPG 的含量增加，淀粉產(chǎn)量增加了近1 倍，同時(shí)馬鈴薯干質(zhì)量較野生型也有所增加[25]。植物合成淀粉的另一個限速酶是AGPase，研究表明AGPase 是淀粉生物合成過程中的關(guān)鍵酶，也是淀粉合成的限速酶，抑制ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性將會部分或全部終止淀粉的合成[26-27]。可溶性淀粉合成酶也是淀粉合成過程中的關(guān)鍵酶。它以腺苷二磷酸葡萄糖為葡萄糖的供體，催化形成淀粉顆粒。淀粉酶是能將淀粉分子中的糖苷鍵水解獲得葡萄糖和寡糖等產(chǎn)物的一類酶。轉(zhuǎn)錄組分析和qRT-PCR 結(jié)果都顯示相較于箭麻，共生天麻中SuSy、AGPase和SSS基因均上調(diào)，AMS基因下調(diào)，這些基因的差異表達(dá)有利于共生天麻淀粉的合成和累積，供共生天麻和箭麻的生長發(fā)育需要。

糖酵解和檸檬酸循環(huán)是產(chǎn)生能量的主要途徑。丙酮酸激酶和己糖激酶是糖酵解途徑的限速酶[28]。一分子葡萄糖通過糖酵解途徑分解為2 分子丙酮酸可以產(chǎn)生2 分子ATP。蘋果酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶是檸檬酸循環(huán)中主要限速酶[28]。一分子丙酮酸通過檸檬酸循環(huán)可以產(chǎn)生12.5 分子ATP。通過糖酵解和檸檬酸循環(huán)分解一分子葡萄糖可產(chǎn)生32 分子ATP。ATP 酶能催化ATP 水解為ADP 和磷酸根離子，并釋放能量的反應(yīng)。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和 qRT-PCR 分析，共生區(qū)天麻HK、PDH、IDH、MDH基因都表達(dá)上調(diào)，說明共生區(qū)天麻糖酵解和檸檬酸循環(huán)都處于快速代謝產(chǎn)生較多的ATP 儲存能量。同時(shí)ATP基因也呈上調(diào)表達(dá)，它催化ATP基因分解釋放較多的能量以滿足共生天麻與蜜環(huán)菌共生所需要的能量和箭麻生長代謝所需要的能量。

5 結(jié)論

近年來從分子水平上對天麻及天麻與蜜環(huán)菌共生的研究頗多，最新研究已從生物學(xué)角度揭示天麻與蜜環(huán)菌共生關(guān)系及其形成機(jī)制[16]。但是天麻（白麻）與蜜環(huán)菌共生后進(jìn)一步生長出新天麻（箭麻）的生長代謝特征還不清楚。本研究通過轉(zhuǎn)錄組比較分析初步闡述共生天麻和箭麻生長代謝特征。轉(zhuǎn)錄組分析表明，共生天麻中與氮、碳和能量代謝相關(guān)差異基因與箭麻相比較大多數(shù)合成氮、碳和能量物質(zhì)表達(dá)上調(diào)，分解谷氨酸和精氨酸的谷氨酸脫氫酶和精氨酸酶以及分解淀粉的淀粉酶表達(dá)下調(diào)，有利于共生區(qū)天麻產(chǎn)生較多的氮和碳營養(yǎng)儲存物質(zhì)和較多的能量物質(zhì)供其進(jìn)一步生長為箭麻?？梢钥闯霭茁榕c蜜環(huán)菌共生狀況是否良好對白麻能否進(jìn)一步生長出箭麻有很大影響。在生產(chǎn)中科學(xué)地掌握白麻與蜜環(huán)菌共生時(shí)適宜的生長環(huán)境是白麻可以進(jìn)一步生長為箭麻的關(guān)鍵，這是天麻栽培過程中需要注意的事項(xiàng)。然而，天麻蜜環(huán)菌共生時(shí)的最適宜環(huán)境仍需要進(jìn)行下一步的探究。與此同時(shí)，箭麻和共生天麻與碳代謝、氮代謝及能量代謝相關(guān)的基因中，同一基因家族成員基因時(shí)空表達(dá)不一致，今后應(yīng)研究清楚基因家族成員在箭麻和共生天麻中的亞細(xì)胞定位和時(shí)空表達(dá)特性，闡明其功能與作用，為人工栽培天麻提供進(jìn)一步理論指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突