電針足三里對(duì)重度失血性休克大鼠肝臟氧自由基的影響△

陸化梅 于國(guó)軍 郭永娟 耿智隆

(1.河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)麻醉科 洛陽(yáng) 471000；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院麻醉科(原蘭州軍區(qū)總醫(yī)院) 蘭州 730000)

肝臟是人體的“生化工廠”，失血性休克及再灌注后肝臟可產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是肝損傷的主要機(jī)制之一，也是SIRS、MODS的病理生理基礎(chǔ)[1]。穴位電針對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)受多種因素的影響，本研究以電針刺激足三里穴為切入點(diǎn)，觀察失血性休克后肝臟氧自由基變化，探討其對(duì)肝臟的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

健康成年雄性SD大鼠60只，體重280g～320g，購(gòu)于蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)5d，環(huán)境溫度控制在22℃～26℃，濕度控制在40%～70%，自由進(jìn)食飲水，每12h晝夜交替一次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1重度失血性休克模型制備

實(shí)驗(yàn)前12h禁食，自由飲水,溫度控制在22℃～26℃，腹腔給予3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，右股動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)和放血，右股靜脈插管用于輸液。采用改良wigger's法[2]復(fù)制重度失血性休克模型，30min內(nèi)使MAP降低至35mmHg，通過(guò)放血或自體血回輸維持MAP(35±5)mmHg水平60min。實(shí)驗(yàn)全程動(dòng)物保持自主呼吸，肛溫控制在(37±0.5)℃。

1.2.2穴位電針處理

穴位定位參照《腧穴名稱與定位》[3]，采用0.3mm×25mm針灸針，刺入雙側(cè)足三里穴，進(jìn)針深度5mm，接電針儀，疏密波2/15Hz，強(qiáng)度0.1mA，30min。非穴位電針組以相同參數(shù)刺激雙側(cè)足三里穴旁開0.5cm非經(jīng)非穴處。

1.2.3實(shí)驗(yàn)方案及分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。對(duì)照組(C組)對(duì)照組動(dòng)物只麻醉，不放血；休克組分為2個(gè)亞組：?jiǎn)渭冃菘私M(S組)和休克復(fù)合穴位電針組(SEN組)，復(fù)制重度失血性休克模型，休克1h時(shí)間點(diǎn)處死大鼠；乳酸林格液復(fù)蘇組分為3個(gè)亞組：乳酸林格液復(fù)蘇組(LR組)、乳酸林格液復(fù)合穴位電針1組(LREN1組)和乳酸林格液復(fù)合穴位電針2組(LREN2組)。LREN1組，液體復(fù)蘇同時(shí)電刺激30min；LREN2組，放血同時(shí)電針刺激30min；各復(fù)蘇組，在休克1h后給予三倍失血量LR液復(fù)蘇，30min內(nèi)恒速輸注，輸注完畢后，給予生理鹽水6ml/kg·h維持輸注4h。

1.2.4指標(biāo)檢測(cè)

(1)動(dòng)態(tài)觀察各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MAP變化、記錄失血量。

(2)肝組織MDA、SOD、NF-κB、ET-1及iNOS測(cè)定：休克組在休克1h即刻，其余各組在復(fù)蘇后4h時(shí)間點(diǎn)，采用穿刺心臟法處死大鼠，取部分肝組織測(cè)定ET-1、NF-κB、iNOS、SOD活性以及MDA蛋白含量。

1.2.5肝組織病理學(xué)觀察

取部分肝組織，經(jīng)甲醛固定、脫水、切片、染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化，透射電鏡下觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠出血量、MAP基礎(chǔ)值比較

與C組比較，各組休克1h時(shí)間點(diǎn)MAP降低，液體復(fù)蘇0.5h時(shí)間點(diǎn)，各復(fù)蘇組MAP上升，復(fù)蘇后2h時(shí)間點(diǎn) MAP降低，各復(fù)蘇組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 肝組織中MDA、SOD、NF-κB、ET-1及iNOS的變化

與C組比較，其余各組MDA、NF-κB、ET-1及iNOS升高，SOD降低(P<0.05)；與休克各組比較，各復(fù)蘇組以上指標(biāo)升高，SOD降低(P<0.05)；與LR組比較，LREN1組及LREN2組以上指標(biāo)降低，SOD升高(P<0.05)，LREN2組降低更明顯，SOD升高更明顯(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠肝組織SOD、MDA、NF-κB、ET-1及iNOS變化

2.3 肝組織病理學(xué)改變

光鏡下觀察(圖1)可見：C組，竇內(nèi)皮細(xì)胞正常；S組，匯管區(qū)水腫，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，枯否細(xì)胞增多;SEN組，肝細(xì)胞輕度腫脹，少許中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；LR組，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，中央靜脈和血竇淤血，大量中性粒細(xì)胞聚集，肝細(xì)胞可見大量空泡狀變性及點(diǎn)狀壞死；LREN1組，肝血竇淤血、肝細(xì)胞少量空泡變性及中央靜脈及匯管區(qū)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；LREN2組，肝細(xì)胞輕度腫脹，少量散在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

C組

2.4 各組大鼠電鏡下肝組織變化

電鏡下(圖2)可見：C組，肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，線粒體及嵴完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整，排列整齊；S組，細(xì)胞膜和核膜變形，線粒體透亮化，嵴疏松，毛細(xì)膽管膽汁淤積；SEN組，肝細(xì)胞線粒體輕度腫脹，毛細(xì)膽管正常；LR組，局灶性肝細(xì)胞溶解壞死，細(xì)胞染色質(zhì)邊集，核膜溶解，嵴消失，大量空泡形成； LREN1組，細(xì)胞核輕度變異，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；LRNEN2組，肝血竇腔輕度增大，枯否細(xì)胞線粒體損傷較輕。

C組

3 討論

NO與ET-1在缺血再灌注中扮演雙重角色[4]。而休克后NO的過(guò)量生成，主要由于iNOS的表達(dá)和活性增高導(dǎo)致。過(guò)量的NO與超氧陰離子(·O2-)生成過(guò)氧亞硝酸陰離子，進(jìn)而生成過(guò)量氧自由基促進(jìn)失血性休克再灌注后血管低反應(yīng)的發(fā)生，加重器官損傷。ET是調(diào)節(jié)血管基礎(chǔ)緊張性的中心遞質(zhì)，以ET-1的作用最強(qiáng)[5]。在休克早期，組織缺血缺氧促進(jìn)ET-1的合成和釋放，ET-1選擇性收縮外周和內(nèi)臟血管參與血壓的維持，保證心腦等重要器官的血供；而在再灌注期，ET-1的升高導(dǎo)致組織灌注不良以及促進(jìn)大量的NO生成造成組織損傷。因此，ET-1與NO升高程度及失衡，是微循環(huán)灌注難以改善、器官進(jìn)一步損傷進(jìn)而促進(jìn)休克向不可逆發(fā)展的重要原因之一[1]。本研究結(jié)果顯示，失血性休克后，肝臟中ET-1與iNOS均升高，休克期ET-1的升高顯著(P<0.05)，而液體再灌注后iNOS升高顯著(P<0.05)。與LREN1組比較，LREN2組ET-1及iNOS均降低(P<0.05)，肝功能及肝損傷減輕。

MDA是氧自由基代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，氧自由基產(chǎn)生的可能機(jī)制包括黃嘌呤氧化酶形成增多、補(bǔ)體活化、NF-κB激活及兒茶酚胺的自動(dòng)氧化等。本研究結(jié)果顯示，失血性休克及液體復(fù)蘇后，NF-κB活化，ET-1及iNOS的生成增多，氧自由基生成增多，肝功能及肝組織損傷明顯，但休克期電針刺激雙側(cè)足三里穴能抑制液體復(fù)蘇后ET-1及iNOS的合成，減少NF-κB活化及氧自由基的產(chǎn)生，減輕肝臟再灌注損傷。