尿激酶原對(duì)冠脈結(jié)扎大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

劉江波，張金盈，劉志遠(yuǎn)，仇瑞莉，張松雨，梅艷陽(yáng)，趙曉寧，李 綱(.南陽(yáng)市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，南陽(yáng) 473009；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，鄭州 450052)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指中斷的心肌組織血流恢復(fù)正常灌注后，心肌損傷進(jìn)行性加重的病理過(guò)程[1-2]。缺血期可引起心肌超微結(jié)構(gòu)、能量代謝、氧化應(yīng)激、心肌損傷及線粒體凋亡等一系列損傷性變化，嚴(yán)重者會(huì)因心律失常而導(dǎo)致猝死[3]。治療MIRI的藥物較多，其中尿激酶原(PRO)屬于第二代溶栓藥，是尿激酶的前體物質(zhì)，具有纖維蛋白特異性[4]。高海英等[5]研究表明，PRO可明顯改善急性心肌梗死患者的心肌功能，但目前關(guān)于其治療MIRI的作用機(jī)制尚不完全統(tǒng)一。本文旨在探究PRO對(duì)冠脈結(jié)扎大鼠心肌缺血血流動(dòng)力學(xué)和MIRI的影響，以期了解PRO對(duì)MIRI患者的治療作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；低溫離心機(jī)，湖南恒諾離心機(jī)有限公司；DW-T6型彩色多普勒超聲儀，江蘇大為醫(yī)療有限公司；小動(dòng)物Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)，南京美易公司；UV-240型紫外分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司；Bx50F4型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；全自動(dòng)生化分析儀，日本 Furuno Electric公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，以色列DNR公司；流式細(xì)胞儀，賽默飛世爾科技有限公司；LD-66型實(shí)驗(yàn)室切片機(jī)，長(zhǎng)沙益廣制藥機(jī)械公司。

1.2試藥 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)試劑盒以及蘇木素、伊紅，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒,均購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；戊巴比妥鈉，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；FITC標(biāo)記Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自四季青生物工程材料有限公司；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)單克隆抗體,購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；HRP羊抗兔IgG等二抗，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3動(dòng)物 SPF級(jí)3周齡SD大鼠60只，購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，粵監(jiān)證字 2015A029。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1分組及建立模型 將60只大鼠適用性喂養(yǎng) 1 周，隨機(jī)選15只作為對(duì)照組，其余45只大鼠采用冠脈結(jié)扎手術(shù)制備MIRI模型[6]。給造模大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液50 mg·kg-1麻醉，切開(kāi)左胸第 2～5肋之間的皮膚，分離皮下組織及前鋸肌和胸大肌后切開(kāi)第 2～3 肋間肌暴露心臟，結(jié)扎，使得心肌細(xì)胞缺血，缺血時(shí)間為15 min，后灌注10 min，1 h后再次缺血15 min，后灌注10 min，消毒，縫合。動(dòng)脈結(jié)扎后使用心電圖檢測(cè)，結(jié)果顯示，ST段明顯抬高、T波高聳，持續(xù)30 min后打開(kāi)結(jié)扎線，恢復(fù)血流灌注，心電圖顯示結(jié)扎后ST段逐漸下降、T波逐步恢復(fù)視為造模成功。將造模成功的45只大鼠均分為模型組和PRO高、低劑量組(分別靜脈注射2，1 mg·kg-1PRO)，對(duì)照組和模型組分別注射等量生理鹽水，每日1次，持續(xù)7 d。

2.2檢測(cè)項(xiàng)目

2.2.1大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 完成藥物干預(yù)后24 h，采用DW-T6型彩色多普勒超聲儀檢測(cè)各組大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)、左室收縮壓(LVSP)和左心室舒張末壓(LVEDP)水平。

2.2.2大鼠血清炎性因子及氧化應(yīng)激物質(zhì)檢測(cè) 完成大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后從頸總動(dòng)脈插管接取0.5 mL大鼠血液，嚴(yán)格按照MDA、SOD、ROS、IL-6、IL-1β和TNF-α試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)各成分水平。

2.2.3HE染色觀察大鼠心肌損傷 處死大鼠后，取大鼠心肌組織，用二甲苯浸泡后再用酒精梯度脫水，蘇木精浸泡后用鹽酸酒精分化、氨水沖洗，用伊紅染色，酒精浸泡脫水，中性樹(shù)膠封片，在400倍鏡下觀察大鼠的心肌細(xì)胞狀態(tài)。

2.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡 將各組大鼠心肌組織剪碎后用胰酶消化制成細(xì)胞懸液，離心機(jī)在4 ℃恒溫下以3 000 r·min-1離心 5 min，加入Binding Buffer和Annexin V-FITC混勻,室溫避光孵育并加入Binding Buffer后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.2.5Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取大鼠心肌組織，用胰蛋白酶消化，提取總蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜，室溫封閉2 h后加入對(duì)應(yīng)抗體，孵育2 h，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，對(duì)比條帶顏色，計(jì)算各蛋白的表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。由表1可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠MAP和LVSP水平顯著降低，LVEDP顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠MAP和LVSP水平顯著升高，LVEDP水平顯著降低(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠MAP和LVSP水平顯著升高，LVEDP水平顯著降低(P<0.01)。

3.2大鼠血清炎性因子檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。由表2可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低(P<0.01)。

表1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果

表2 大鼠血清炎性因子檢測(cè)結(jié)果

3.3大鼠氧化應(yīng)激水平檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表3。由表3可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清MDA和ROS水平顯著升高，SOD水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠血清MDA和ROS水平顯著降低，SOD水平顯著升高(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠血清MDA和ROS水平顯著降低，SOD水平顯著升高(P<0.01)。

表3 大鼠氧化應(yīng)激水平檢測(cè)結(jié)果

3.4大鼠心肌損傷HE染色觀察結(jié)果 見(jiàn)圖1。由圖1可知，對(duì)照組大鼠心肌組織、肌外膜、心肌纖維均正常且完整；模型組大鼠心肌纖維彎曲，肌紅蛋白溶解，同時(shí)心肌細(xì)胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；PRO高、低劑量組心肌組織少量肌纖維斷裂溶解彎曲。

3.5大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表4和圖2。由表4和圖2可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

圖1 大鼠心肌損傷HE染色觀察結(jié)果(×400)

圖2 大鼠心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

3.6大鼠凋亡蛋白及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路蛋白檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖3和表5。由圖3和表5可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織Bax和磷酸化c-Jun氨基末端激酶 (P-JNK) 蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠心肌組織Bax和P-JNK蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠心肌組織Bax和P-JNK蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。

圖3 大鼠凋亡蛋白及JNK信號(hào)通路蛋白檢測(cè)結(jié)果

表5 大鼠凋亡蛋白及JNK信號(hào)通路蛋白檢測(cè)結(jié)果

4 討論

MIRI會(huì)導(dǎo)致心律失常，影響血流動(dòng)力學(xué)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，PRO低劑量組大鼠MAP和LVSP水平顯著升高，LVEDP顯著降低，說(shuō)明PRO可有效改善大鼠MIRI后的血流動(dòng)力學(xué)。這可能是因?yàn)镻RO含有纖溶酶原激活劑抑制劑的作用位點(diǎn)，可有效抑制缺血后的心臟出現(xiàn)血栓，同時(shí)可較好地溶解血凝塊從而改善血流動(dòng)力學(xué)。同時(shí)PRO可以通過(guò)緩解心臟的損傷，改善心肌的供血能力，從而改善血流動(dòng)力學(xué)。溫且木·阿布都拉等[8]研究表明，PRO可有效緩解大鼠MIRI，改善血流動(dòng)力學(xué)，與本研究結(jié)論一致。

MIRI后會(huì)發(fā)生一系列免疫反應(yīng)[9]，促炎性細(xì)胞因子主要包括TNF-α、IL-1β、IL-6 和白細(xì)胞介素-8(IL-8)。其中IL-6和TNF-α由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和非免疫細(xì)胞等分泌，是主要的促炎癥因子[10-11]。由本研究結(jié)果可知，與模型組比較，使用PRO處理后大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低，說(shuō)明PRO可有效抑制大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。這可能是因?yàn)镻RO可以作用JAK2/STAT3信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)該信號(hào)通路調(diào)節(jié)其下游炎癥因子的分泌，有效緩解大鼠心肌細(xì)胞缺血后的炎癥反應(yīng)。王曉亞[12]研究表明，PRO可有效緩解心肌梗死患者炎癥反應(yīng)，與本研究結(jié)論類(lèi)似。

心肌細(xì)胞缺血后會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，使得機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激[13]。發(fā)生氧化應(yīng)激后，細(xì)胞膜的通透性會(huì)改變并使得細(xì)胞內(nèi)酶MDA和ROS大量釋放到血液中[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，使用PRO處理后MDA和ROS水平顯著降低。這可能是由于PRO具有抗氧化性，可有效抑制ROS對(duì)細(xì)胞膜的損傷，防止細(xì)胞內(nèi)酶MDA和ROS大量釋放到血液中。劉志遠(yuǎn)等[15]研究表明，PRO可有效緩解大鼠MIRI和氧化應(yīng)激反應(yīng)，與本研究結(jié)論相一致。

細(xì)胞凋亡是MIRI中常見(jiàn)的現(xiàn)象之一，Bcl-2家族是常見(jiàn)的凋亡控制基因[16]。該家族主要包括Bcl-2基因和Bax基因，Bcl-2為抑凋亡基因，Bax為促凋亡基因[17]。研究發(fā)現(xiàn)，使用PRO處理后Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明使用PRO處理后大鼠缺血后心肌細(xì)胞的凋亡得到緩解。這可能是因?yàn)镻RO能有效抑制凋亡基因的表達(dá)，并促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)，防止MIRI后的心肌細(xì)胞凋亡。羅敏等[18]研究表明，降低MIRI后細(xì)胞的凋亡可有效緩解MIRI，與本研究結(jié)論類(lèi)似。

JNK 信號(hào)通路調(diào)控炎癥反應(yīng)在MIRI病理過(guò)程中起重要的作用[19-20]。研究表明，激活JNK信號(hào)通路后會(huì)促進(jìn)白細(xì)胞介素-1 (IL-1)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的表達(dá)，激活 TGF-β激酶 1和 Toll 樣受體，使得轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶(TAK1)被激活，最終反作用于JNK 通路，使之激活。本研究發(fā)現(xiàn)，使用PRO處理后，大鼠心肌組織P-JNK蛋白表達(dá)水平顯著降低。說(shuō)明PRO可有效抑制JNK信號(hào)通路，并通過(guò)JNK信號(hào)通路抑制下游的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)。張國(guó)明[21]研究表明，緩解MIRI可通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路的活化、降低炎癥反應(yīng)得以實(shí)現(xiàn)，與本研究結(jié)論一致。

綜上所述，PRO可抑制JNK信號(hào)通路的活化，從而緩解大鼠MIRI。但本實(shí)驗(yàn)涉及到的樣本量較少，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。