一測多評法測定補(bǔ)心氣口服液中7種成分的含量

張伯鋒，王 杰，陳海燕(.濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南 500；.濟(jì)南市第五人民醫(yī)院，濟(jì)南 50000；3.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 53003)

補(bǔ)心氣口服液由人參、黃芪、石菖蒲和薤白4味中藥制成，主治氣短、心悸、乏力和頭暈等心氣虛損型胸痹心痛病癥[1]。現(xiàn)代研究表明，補(bǔ)心氣口服液對慢性穩(wěn)定型心絞痛[2]、慢性心力衰竭心氣虛損證[3]、心血管神經(jīng)癥[4]、慢性肺心病急性發(fā)作[5]和冠心病心絞痛[6]等疾病的臨床治療效果顯著，能有效改善心肌缺血和臨床癥狀，減少心肌損傷，改善心肌供血，降低心肌耗氧和機(jī)體炎癥反應(yīng)，可提高患者的生活質(zhì)量等。補(bǔ)心氣口服液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]和文獻(xiàn)報道[7]僅對黃芪甲苷進(jìn)行了定量檢測，未對方中其他成分進(jìn)行定量研究，中藥及其制劑具有成分繁多復(fù)雜、協(xié)同作用的特點(diǎn)，單一成分控制模式難以確保中成藥復(fù)方制劑臨床療效的一致性，多指標(biāo)成分控制模式已廣泛應(yīng)用于其質(zhì)量控制中。一測多評(QAMS)法利用中藥成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，通過測定其中一種對照品穩(wěn)定易得的成分，實現(xiàn)多指標(biāo)成分含量的同時測定，降低檢驗成本，有助于多指標(biāo)成分控制模式的普及應(yīng)用。本研究參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚為研究對象，選取毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為內(nèi)參物，建立QAMS法同時測定補(bǔ)心氣口服液中7種成分的含量，為全面評價補(bǔ)心氣口服液的整體質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Agilent 1100型高效液相色譜儀，Agilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Zorbax Eclipse C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國Agilent公司；Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，北京迪科馬科技有限公司；XS105DU型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2試藥β-細(xì)辛醚(批號112018-201802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%)、α-細(xì)辛醚(批號100298-201203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%)、人參皂苷Rg1(批號110703-201933，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.4%)、人參皂苷Re(批號110754-202028，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.9%)和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號111920-201606，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.6%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；毛蕊異黃酮(批號PRF8062601，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%)和芒柄花素對照品(批號PRF8091225，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%)，均購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；乙腈和甲醇為色譜純，均購于天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司；其余試劑均為分析純；補(bǔ)心氣口服液(規(guī)格：10 mL·支-1；批號：190108，190509，190604)，購于湖北福人金身藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取7種成分對照品各適量，分別用甲醇制成7種成分質(zhì)量濃度分別為0.162，0.318，0.746，0.372，1.294，2.956,0.978 mg·mL-1的單一對照品溶液；精密吸取上述7種單一對照品溶液各2.5 mL，用甲醇定容至50 mL量瓶中，制成各成分質(zhì)量濃度分別為8.1，15.9，37.3，18.6，64.7，147.8，48.9 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備 精密吸取補(bǔ)心氣口服液2.0 mL，用甲醇定容至25 mL，過濾，即得。

2.3陰性樣品溶液的制備 按照《中國藥典》2015年版一部項下補(bǔ)心氣口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的工藝處方，分別制備缺人參、黃芪和石菖蒲的陰性樣品，再按照2.2項下方法制成陰性樣品溶液。

2.4色譜條件及專屬性實驗 色譜柱：Agilent Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脫(0～9.0 min，16.0%A；9.0～15.0 min，16.0%A～24.0%A；15.0～28.0 min，24.0%A～52.0%A；28.0～42.0 min，52.0%A～74.0%A；42.0～50.0 min，74.0%A～16.0%A)。流速:1.0 mL·min-1；檢測波長分別為203 nm(0～15.0 min檢測人參皂苷Rg1和人參皂苷Re)[8-12]，257 nm(15.0～50.0 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚)[13-18]；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃。精密吸取2.1項下制備的混合對照品溶液、2.2項下制備的供試品溶液和2.3項下制備的陰性樣品溶液各適量，按照上述色譜條件進(jìn)樣檢測，色譜圖見圖1。由圖1可知，供試品色譜圖中7種成分色譜峰峰形對稱，理論塔板數(shù)按照各成分色譜峰計算均不低于3 000，主成分峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，陰性樣品對補(bǔ)心氣口服液中7種成分的同時測定無干擾。

圖1 HPLC圖

2.5線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.1項下制備的7種單一對照品溶液各0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，用甲醇制成6個系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按照2.4項下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系

2.6精密度實驗 取2.1項下制備的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得7種成分峰面積的RSD值分別為1.29%，1.09%，0.96%，1.11%，0.62%，0.57%，0.79%，表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性實驗 取同一批補(bǔ)心氣口服液，按照2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.4項下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，外標(biāo)法(ESM)計算得7種成分含量的RSD值分別為1.78%，0.63%，1.39%，1.55%，1.02%，0.87%,1.14%，表明實驗重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性實驗 取2.2項下制備的同一份供試品溶液，于制備后0，2，4，6，12，18 h進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，結(jié)果7種成分峰面積的RSD值分別為1.04%，1.12%，0.93%，1.09%，0.66%，0.59%，0.82%，表明供試品溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9回收率實驗 取含量已知的補(bǔ)心氣口服液9份，每份精密吸取1.0 mL，置于25 mL量瓶中，按照《中國藥典》2015年版四部要求，分別按已知含有量的50%，100%，150% 3個水平精密加入混合對照品溶液(7種成分質(zhì)量濃度分別為0.057，0.119，0.272，0.138，0.487，1.061，0.364 mg·mL-1)1.0，2.0，3.0 mL，各3份，再按照2.2項下方法制成加樣供試品溶液，按照2.4項下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，計算得7種成分的平均回收率(RSD)分別為97.44%(1.14%)，99.80%(0.75%)，100.05%(0.68%)，96.98%(0.90%)，98.87%(1.35%)，99.88%(0.73%)，97.91%(1.49%)。

2.10相對校正因子(RCFs)的計算及耐用性考察

2.10.1RCFs的計算 RCFs的計算公式：

fs/i=fs÷fi=(Xs×Yi)÷(Xi×Ys)

(1)

待測成分i質(zhì)量濃度計算公式：

Xi=(Xs×Yi)÷(fs/i×Ys)

(2)

式中fs/i表示待測成分i的RCFs，X表示質(zhì)量濃度，Y表示峰面積，s表示內(nèi)參物，i表示其他待測成分。

精密吸取2.5項下制備的6個系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為內(nèi)參物，按照公式(1)計算其他6種成分的RCFs，結(jié)果見表2。

表2 各成分的RCFs

2.10.2不同儀器、色譜柱對RCFs的影響 精密吸取2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.4項下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，考察Agilent 1100型、Waters 2695型高效液相色譜儀和Agilent Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Zorbax Eclipse C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱對RCFs的影響，見表3。

表3 不同儀器、色譜柱對RCFs的影響

2.10.3不同柱溫對RCFs的影響 精密吸取2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.4項下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，考察不同柱溫對RCFs的影響，見表4。

表4 不同柱溫對RCFs的影響

2.10.4不同流速對RCFs的影響 精密吸取2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.4項下色譜條件進(jìn)樣檢測7種成分的峰面積，考察不同流速(0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL·min-1)對RCFs的影響，見表5。

表5 不同流速對RCFs的影響

2.11待測組分色譜峰的定位 相對保留時間值法是QAMS法中待測成分色譜峰定位的常用方法。本實驗采用相對保留時間值法對待測成分色譜峰進(jìn)行定位，分別記錄不同儀器和色譜柱條件下7種成分的保留時間，結(jié)果見表6。

表6 不同儀器、色譜柱對相對保留時間值的影響

2.12樣品含量測定 取3批補(bǔ)心氣口服液，各批次按照2.2項下方法平行制備3份供試品溶液，按照2.4項下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，首先采用ESM法計算7種成分的含量，再以毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為內(nèi)參物，按照2.10.1項下RCFs和公式(2)計算其他6種成分的含量，結(jié)果見表7。由表7可知，QAMS法計算值與ESM法實測值無明顯差異，相對平均偏差(RAD)均<2.00%，表明RCFs可信度較高，建立的QAMS法可同時測定補(bǔ)心氣口服液中7種成分的含量。

表7 7種成分的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1目標(biāo)成分的選擇 補(bǔ)心氣口服液由黃芪、人參、石菖蒲和薤白4味中藥材按照中醫(yī)理論配伍制成，黃芪補(bǔ)氣升陽、生津養(yǎng)血、行滯通痹，為方中君藥；人參大補(bǔ)元?dú)?、生津安神，為臣藥；石菖蒲化濕開胃、開竅豁痰、醒神益智，為佐藥；薤白行氣通陽，引藥入心經(jīng)，為使藥。諸藥共奏，以達(dá)補(bǔ)益心氣、理氣止痛的臨床功效。現(xiàn)代研究表明，黃芪主要含有黃酮類、皂苷類、多糖類及微量元素等活性成分，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素和芒柄花苷等為其黃酮類代表性成分[19]；人參的主要藥效成分是人參皂苷，其中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1等為其代表性成分；石菖蒲主要含有β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚等揮發(fā)油類成分[20]。本文參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物優(yōu)選原則，選取補(bǔ)心氣口服液方中藥物所含毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚為定量測定目標(biāo)成分。

3.2檢測波長的確定 取2.1項下制備的7種成分的單一對照品溶液，分別在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素在260 nm波長附近有較大吸收，且雜質(zhì)干擾較少，靈敏度較高；人參皂苷Rg1和人參皂苷Re在203 nm波長處有最大吸收；β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚在257 nm波長處有最大吸收。綜合考慮7種待測成分的檢測響應(yīng)值和雜質(zhì)干擾程度，最終確定在203 nm波長處檢測人參皂苷Rg1和人參皂苷Re，在257 nm波長處檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚。

3.3流動相的選擇 本實驗參考相關(guān)文獻(xiàn)，在選擇流動相時，依次對甲醇-水[14，21]、乙腈-水[8-9]、乙腈-甲醇(9∶1)[13]3個流動相系統(tǒng)進(jìn)行考察對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-水和乙腈-甲醇(9∶1)為流動相體系檢測時，基線漂移嚴(yán)重，部分待測成分色譜峰分離不完全，可能與甲醇在低波長處有紫外吸收有關(guān)；乙腈-水流動相體系檢測色譜圖基線平穩(wěn)，但β-細(xì)辛醚色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，考慮加入酸類改善，待測成分人參皂苷Rg1和人參皂苷Re為紫外末端吸收，甲酸[14，21-22]和冰醋酸為有機(jī)酸，存在紫外末端吸收，影響色譜圖基線和檢測結(jié)果，而磷酸為無機(jī)酸，無紫外末端吸收，遂采用乙腈-1 mL·L-1磷酸[9]為流動相進(jìn)行實驗，結(jié)果7種成分色譜峰峰形對稱，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，色譜圖基線較為平穩(wěn)。同時對流動相比例不斷優(yōu)化，最終按照2.4項下的流動相洗脫程序?qū)ρa(bǔ)心氣口服液中7種成分的含量進(jìn)行同時測定。

4 結(jié)論

本實驗首次采用QAMS法對補(bǔ)心氣口服液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚的含量進(jìn)行同時測定，所建立的方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確，對補(bǔ)心氣口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和全面評價提供了參考。