LC-MS/MS法同時測定中藥注射劑中3種成分的含量

孫 衛(wèi)，汪賽賽，賈倩倩，付 佳，李 智，韓省力*(.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 7006；.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津 30040)

中藥注射劑具有生物利用度高及作用迅速等特點(diǎn)，在治療心腦血管疾病、感染性疾病及腫瘤輔助治療等方面效果顯著，臨床應(yīng)用范圍廣泛[1]。但中藥注射劑臨床應(yīng)用不良反應(yīng)較多，以類變態(tài)反應(yīng)為主[2-3]。明確中藥注射劑中引發(fā)類變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)并控制其含量，對保證中藥注射劑的臨床應(yīng)用安全至關(guān)重要。

注射用益氣復(fù)脈與生脈注射液均源于中國著名傳統(tǒng)古方“生脈散”，以紅參為君藥，大補(bǔ)元?dú)?，鼓舞清陽；麥冬為臣藥，養(yǎng)陰生津，清心除煩；五味子為佐使，斂肺寧心，止汗生津[4]。主治冠心病勞累型心絞痛，慢性左心功能不全心力衰竭、心律失常、冠心病及病毒性心肌炎等疾病[5-8]。2種中藥注射劑均由3味中藥提取制成，成分復(fù)雜，含糖量高，不良反應(yīng)發(fā)生率高[9]。國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心病例報告數(shù)據(jù)庫顯示，在生脈注射液的安全問題中，嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)表現(xiàn)最為突出。5-羥甲基糠醛(5-HMF)廣泛存在于含糖注射液中[10-11]，化學(xué)性質(zhì)活潑，具有廣泛的藥理活性[12-16]，前期研究表明，5-HMF具有較強(qiáng)的致敏作用。因此測定注射用益氣復(fù)脈和生脈注射液中5-HMF的含量對于2種中藥注射劑的質(zhì)量控制及安全性評價具有重要意義。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)法具有靈敏度高、操作簡便和分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于復(fù)雜體系中微痕量成分的準(zhǔn)確定量[17-19]。本研究建立了靈敏、快速的LC-MS/MS法，用于測定多批次注射用益氣復(fù)脈和生脈注射液中5-HMF、人參皂苷Rd與人參皂苷Rg3的含量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-MS/MS 8040型高效液相-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，SHIMADZU VP-ODS色譜柱(150 mm×2.0 mm，5 μm)，AUY120型分析天平(日本島津公司)；0.22 μm微孔濾膜(德國Merck公司)；Milli-Q型純水儀(美國Millipore公司)。

1.2試藥 5-HMF(批號18110903，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.23%)，人參皂苷Rd(批號19061306，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.97%)，人參皂苷Rg3對照品(批號18120607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.17%)，均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純，購自德國默克公司；注射用益氣復(fù)脈(凍干)(批號：20170501，20170505，20170604，20170702，20170812)，購自天津天士力之驕藥業(yè)有限公司；生脈注射液(批號：17090122，14040111，14030211，13120811，13031011)，購自國藥集團(tuán)宜賓制藥有限責(zé)任公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用SHIMADZU VP-ODS色譜柱(150 mm×2.0 mm，5 μm)。流動相：1 mL·L-1甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，梯度程序：0～6 min，5%B；6～20 min，5%B～80%B；20～25 min，80%B。柱溫：35 ℃；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣體積：5 μL；離子源：ESI源；脫溶劑管線溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；霧化氣流速：3 L·min-1；干燥氣流速：15 L·min-1；正離子模式檢測電壓：+4.5 kV；負(fù)離子模式檢測電壓：-3.5 kV。利用對照品溶液建立MRM方法，定量離子對：5-HMF (126.9→109.2)；人參皂苷Rd (945.60→945.50)；人參皂苷Rg3(783.5→113.1)。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 精密稱取3種成分對照品適量，分別置于量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為1.102，1.232，1.021 g·L-1的單一對照品儲備液。精密吸取上述單一對照品儲備液，用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，4 ℃保存，備用。

2.2.2供試品溶液 精密稱取注射用益氣復(fù)脈(凍干)0.65 g，加入2 mL超純水，搖勻，溶解，過0.22 μm微孔濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液稀釋100倍作為供試品溶液1；取生脈注射液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，稀釋100倍作為供試品溶液2。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1專屬性實(shí)驗(yàn) 取2.2項下制備的混合對照品溶液和2種供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣，得到總離子流圖(TIC)，見圖1，考察本方法的專屬性。由圖1可知，3種成分色譜峰附近無其他峰干擾，專屬性滿足含量測定要求。

圖1 總離子流圖

2.3.2線性實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積。以混合對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，得3種成分的回歸方程分別為：y1=43.91x1-1 722.4(r1=0.997 2)，y2=255.87x2+44 307(r2=0.998 3)，y3=289.5x3+8 114(r3=0.999 8)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度分別在53.76～2 204.00，61.60～2 464.00，51.05～2 042.00 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3檢測限與定量限 將最低質(zhì)量濃度的混合對照品溶液逐級稀釋，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，目測法計算0～25 min內(nèi)信噪比(S/N)，當(dāng)S/N=3時，3種成分的檢測限分別為2.20，2.05，1.02 ng·mL-1，當(dāng)S/N=10時，3種成分的定量限分別為5.51，10.27，5.11 ng·mL-1。

2.3.4精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項下制備的混合對照品溶液，同日進(jìn)樣3次，得日內(nèi)精密度，計算3種成分峰面積的RSD值分別為0.97%，0.73%，1.20%；每日進(jìn)樣1次，連續(xù)3 d，得日間精密度，計算得3種成分峰面積的RSD值分別為2.53%，4.30%，1.20%，精密度滿足含量測定要求。

2.3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項下制備的2種供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計算得到注射用益氣復(fù)脈中3種成分峰面積的RSD值分別為4.74%，2.01%，4.91%；生脈注射液中3種成分峰面積的RSD值分別為1.13%，1.95%，2.18%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項下制備的2種供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣，記錄注射用益氣復(fù)脈中3種成分的色譜峰峰面積，計算得到RSD值分別為3.01%，2.80%，1.60%；記錄生脈注射液中3種成分的色譜峰峰面積，計算得到RSD值分別為2.78%，1.53%，3.01%。結(jié)果表明，2種供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批注射用益氣復(fù)脈樣品(批號20170501)，按照2.2.2項下方法制備9份供試品溶液，平均分為3組，每組分別加入一定量的對照品，加入量分別為測得量的80%，100%，120%，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算平均回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率結(jié)果 (n=3)

2.4含量的測定 取各批次注射用益氣復(fù)脈(凍干)和生脈注射液，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，各樣品重復(fù)測定3次，記錄色譜峰峰面積。見表2和表3。

表2 注射用益氣復(fù)脈的含量測定結(jié)果

表3 生脈注射液的含量測定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了能同時測定3種成分的LC-MS/MS法，該方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、精密度高、回收率滿足實(shí)驗(yàn)要求，進(jìn)而對注射用益氣復(fù)脈與生脈注射液中3種成分進(jìn)行了含量測定。《中國藥典》2015年版規(guī)定，5-HMF在葡萄糖注射液中限量為11.80 μg·mL-1，結(jié)合其臨床使用方法，本實(shí)驗(yàn)檢測樣品中5-HMF的含量遠(yuǎn)低于《中國藥典》2015年版規(guī)定的限量[20]，且注射用益氣復(fù)脈中5-HMF的含量低于生脈注射液的含量，推測原因可能是注射用益氣復(fù)脈采用了凍干工藝，糖類在該儲存條件下性質(zhì)較穩(wěn)定，不易轉(zhuǎn)化生成5-HMF。

5-HMF作為糖類降解產(chǎn)物，廣泛存在于各種含糖注射劑中。由于5-HMF的不穩(wěn)定性，在中藥注射液的復(fù)雜環(huán)境下，會進(jìn)一步生成聚合物，引發(fā)不良反應(yīng)，因此測定中藥注射劑中5-HMF的含量對于確保中藥注射劑的安全使用、減少不良反應(yīng)具有重要意義。