一測多評法同時(shí)測定痔舒適洗液中7種成分的含量

趙志國，姚建華，王婧寧，翟瑩瑩(.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑管理部，沈陽 0032；2.沈陽飛龍藥業(yè)有限公司，本溪 7004)

痔舒適洗液由苦參、白及、三七、艾葉、蛇床子和敗醬草等14味中藥配伍加工而成，臨床主治痔瘡急性發(fā)作[1]。現(xiàn)代研究表明，痔舒適洗液能有效促進(jìn)混合痔術(shù)后患者創(chuàng)面愈合，緩解患者術(shù)后疼痛，縮短創(chuàng)面愈合所需時(shí)間[2-3]，可明顯改善肛門病術(shù)后的疼痛、出血和水腫諸癥[4]；其聯(lián)合光子治療儀、鹵米松乳膏治療肛周濕疹療效好、顯效快、復(fù)發(fā)率低[5-6]；采用一次性根治術(shù)聯(lián)合痔舒適洗液可明顯提高肛周膿腫患者的整體治療有效率和患者治療滿意度[7]。方中苦參[8]清熱燥濕，槐角清熱瀉火、涼血止血，三七散瘀止血、消腫定痛，共為君藥；白及收斂止血、消腫生肌，蛇床子祛風(fēng)燥濕、殺蟲止癢，敗醬草、金銀花和馬齒莧清熱解毒、涼血止血，合為臣藥；艾葉祛濕止癢，防風(fēng)勝濕止痛，硼砂清熱解毒，白礬解毒止癢，冰片清熱止痛，共為佐藥；甘草緩急止痛、調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏清熱燥濕、化瘀解毒、止血消腫、止痛止癢之功?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]和文獻(xiàn)報(bào)道中均未對痔舒適洗液所含成分進(jìn)行定量研究，中藥及其制劑具有多成分、整體協(xié)同作用的特點(diǎn)，本文采用一測多評(QAMS)法對痔舒適洗液中君藥苦參所含主要成分三葉豆紫檀苷、苦參醇Ⅰ和苦參酮，臣藥白及所含特征成分貝母蘭寧和山藥素Ⅲ，佐藥艾葉所含有效成分棕矢車菊素和異澤蘭黃素含量進(jìn)行同時(shí)測定，建立痔舒適洗液多指標(biāo)成分的質(zhì)量評價(jià)模式，為全面、科學(xué)地評價(jià)痔舒適洗液的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型HPLC色譜儀(美國Waters公司)；UltiMate 3000型HPLC色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BT-125D型電子天平(德國Sartorius公司)；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm,美國Agilent公司)；Phenomenex C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm),美國Phenomenex公司；Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm),瑞典Akzo Nobel公司。

1.2試藥 三葉豆紫檀苷(批號18061121，CAS號：6807-83-6，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.2%)，苦參酮(批號18060822，CAS號：34981-26-5，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.7%)，異澤蘭黃素對照品(批號18041621，CAS號：22368-21-4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.2%)，均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；苦參醇Ⅰ(批號PRFM90307-43，CAS號：99119-69-4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%)和棕矢車菊素對照品(批號PRF8060702，CAS號：18085-97-7，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%)，均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；貝母蘭寧(批號CFS201801，CAS號：82344-82-9，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)和山藥素Ⅲ對照品(批號CFS202001，CAS號：56684-87-8，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)，均購自武漢天植生物技術(shù)有限公司；乙腈(色譜純)，德國Merck公司；其他試劑為分析純；痔舒適洗液(規(guī)格：220 mL·瓶-1，批號：20190501，20190703，20190801)，均購自云南名揚(yáng)藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液 精密稱取7種成分對照品各適量，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.204，0.396，1.532，0.318，0.876，0.124，0.258 mg·mL-1的混合對照品儲備液；精密吸取上述混合對照品儲備液2.5 mL，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋至50 mL，制成7種成分質(zhì)量濃度分別為10.2，19.8，76.6，15.9，43.8，6.2，12.9 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液 精密量取痔舒適洗液3.0 mL，置于25 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.1.3陰性樣品溶液 按照痔舒適洗液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的工藝處方分別制備不含苦參、白及、艾葉和14味中藥材的陰性樣品，再按照2.1.2項(xiàng)下方法分別制成陰性樣品溶液。

2.2色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃。流動相：乙腈(A)-2 mL·L-1甲酸(B)，梯度洗脫(0～8.0 min，35.0%A；8.0～19.0 min，35.0%A～43.0%A；19.0～31.0 min，43.0%A～49.0%A；31.0～44.0 min，49.0%A～65.0%A；44.0～50.0 min，65.0%A～35.0%A)。流速：0.9 mL·min-1；檢測波長：295 nm(0～19.0 min檢測三葉豆紫檀苷、苦參醇Ⅰ和苦參酮)[9-10]，270 nm(19.0～31.0 min檢測貝母蘭寧和山藥素Ⅲ)[11-12]，330 nm(31.0～50.0 min檢測棕矢車菊素和異澤蘭黃素)[13-14]；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn) 取2.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液、供試品溶液及4種陰性樣品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，色譜圖基線平穩(wěn)，圖1B中7種成分色譜峰峰形對稱，與相鄰色譜峰分離度均>1.5，理論板數(shù)按照各成分色譜峰計(jì)算均≥4 500，陰性樣品對痔舒適洗液中7種成分的測定無干擾。

2.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對照品儲備液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋至20 mL，制成系列混合對照品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件檢測7種成分色譜峰的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 7種成分的線性關(guān)系考察

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得7種成分色譜峰峰面積的RSD值分別為1.29%，1.05%，0.57%，1.11%，0.72%，1.33%，0.96%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得7種成分色譜峰峰面積的RSD值分別為1.29%，1.05%，0.57%，1.11%，0.72%，1.33%，0.96%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.1.2項(xiàng)下制備的同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，12，18 h檢測7種成分的峰面積，計(jì)算得峰面積的RSD值分別為1.35%，0.99%，0.60%，1.08%，0.74%，1.27%，1.01%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8回收率實(shí)驗(yàn) 取7種成分含量已知的痔舒適洗液樣品9份，每份1.5 mL，根據(jù)《中國藥典》2015年版四部要求，分別按已知含有量的50%，100%，150% 3個(gè)水平精密加入加標(biāo)對照品溶液(7種成分質(zhì)量濃度分別為0.073，0.149，0.541，0.106，0.293，0.047，0.089 mg·mL-1)1.0，2.0，3.0 mL，各3份，再按照2.1.2項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果測得7種成分的平均回收率(RSD值)分別為96.94%(1.30%)，99.59%(0.74%)，100.13%(0.65%)，98.42%(1.43%)，99.37%(1.26%)，97.52%(1.11%)，98.50%(0.98%)。

2.9相對校正因子(RCFs)的測定及耐用性考察

2.9.1RCFs測定 精密吸取2.4項(xiàng)下制備的6個(gè)系列混合對照品溶液適量，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，以苦參酮為內(nèi)參物，按照公式RCFs/k=fs÷fk=(Cs×Ak)÷(Ck×As)(式中C代表質(zhì)量濃度，A代表峰面積，s代表內(nèi)參物，k代表其他成分)分別計(jì)算三葉豆紫檀苷、苦參醇Ⅰ、貝母蘭寧、山藥素Ⅲ、棕矢車菊素和異澤蘭黃素6種成分的RCFs，結(jié)果見表2。

表2 6種成分的RCFs

2.9.2不同儀器、色譜柱對RCFs的影響 精密吸取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，以苦參酮為內(nèi)參物，對比考察UltiMate 3000型、Waters 2695型高效液相色譜儀及Agilent Eclipse XDB-C18、Phenomenex C18和Kromasil C18色譜柱對6種成分RCFs的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同儀器、色譜柱對RCFs的影響

2.9.3不同柱溫對RCFs的影響 精密吸取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，以苦參酮為內(nèi)參物，對比考察不同柱溫(20，22，25，28，30 ℃)對6種成分RCFs的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同柱溫對RCFs的影響

2.9.4不同流速對RCFs的影響 精密吸取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，以苦參酮為內(nèi)參物，對比考察不同流速(0.7，0.8，0.9，1.0，1.1 mL·min-1)對6種成分RCFs的影響，結(jié)果見表5。

表5 不同流速對RCFs的影響

由表3至表5可知，不同儀器、色譜柱、柱溫和流速對所建立的RCFs無顯著影響，RSDs值均<5.00%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的RCFs耐用性良好，在2.2項(xiàng)色譜條件(Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，柱溫：25 ℃，流速：0.9 mL·min-1)下能夠確保所測結(jié)果的可靠性。

2.10色譜峰的定位 精密吸取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄7種成分色譜峰的保留時(shí)間，以內(nèi)參物苦參酮的色譜峰為基準(zhǔn)峰，在UltiMate 3000型、Waters 2695型高效液相色譜儀及Agilent Eclipse XDB-C18、Phenomenex C18和Kromasil C18色譜柱條件下采用相對保留時(shí)間值法(RRT)對待測成分色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見表6。

表6 不同儀器、色譜柱對RRT的影響

2.11QAMS法與外標(biāo)法(ESM)測定結(jié)果比較 取3批痔舒適洗液，按照2.1.2項(xiàng)下方法每批平行制備供試品溶液3份，按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定7種成分的峰面積，分別采用ESM和QAMS法計(jì)算7種成分的含量，結(jié)果見表7。

表7 各成分含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1檢測波長的選擇 取2.1.1項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，采用DAD檢測器在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示，三葉豆紫檀苷、苦參醇Ⅰ和苦參酮在275～298 nm波長范圍內(nèi)有較大吸收，貝母蘭寧在205.0，274.5 nm波長處有較大吸收，山藥素Ⅲ在193.0，270.0 nm波長處有較大吸收，棕矢車菊素和異澤蘭黃素分別在330.0，327.5 nm波長處有較大吸收，為避免紫外末端吸收對檢測結(jié)果的影響，同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-14]選取295 nm作為三葉豆紫檀苷、苦參醇Ⅰ和苦參酮的檢測波長，270 nm作為貝母蘭寧和山藥素Ⅲ的檢測波長，330 nm作為棕矢車菊素和異澤蘭黃素的檢測波長。在此條件下，所記錄的色譜圖基線噪聲較低，7種待測成分色譜峰峰形對稱，均能達(dá)到有效分離，各成分色譜峰響應(yīng)值較大。

3.2流動相的選擇 本實(shí)驗(yàn)在選擇流動相時(shí)，首先對甲醇-水[10，15]和乙腈-水[9，12，16-18]流動相系統(tǒng)進(jìn)行對比考察，以痔舒適洗液中7種成分的色譜峰峰形、雜質(zhì)峰干擾和分離度情況為主要指標(biāo)，同時(shí)兼顧色譜圖基線平穩(wěn)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水系統(tǒng)優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)，但基線不平穩(wěn)，苦參酮和棕矢車菊素色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，干擾檢測結(jié)果。因此，在流動相水相中加入一定比例的磷酸[19-21]和甲酸[11，13-14，22-23]進(jìn)行對比考察，通過摸索優(yōu)化，最終確定采用乙腈-2 mL·L-1甲酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫，對痔舒適洗液中7種活性成分進(jìn)行同時(shí)檢測。

3.3內(nèi)參物的選擇 在痔舒適洗液7種待測成分中，苦參酮在樣品中含量較高，保留時(shí)間相對居中，峰形對稱，對照品易獲得，同時(shí)苦參酮為痔舒適洗液君藥苦參所含主要藥效成分，故選取苦參酮為內(nèi)參物。

本文采用QAMS法對痔舒適洗液中7種成分的含量進(jìn)行同時(shí)測定，建立了痔舒適洗液多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，該方法操作簡便、易行，準(zhǔn)確度高，為全面、科學(xué)地評價(jià)痔舒適洗液的質(zhì)量提供了依據(jù)。