HPLC法同時(shí)測(cè)定春血安膠囊中8種成分的含量

翟英英，位恒超(.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450008；.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450000)

中藥及其制劑是經(jīng)數(shù)千年傳承與發(fā)展的產(chǎn)物，其臨床療效已得到了廣大醫(yī)患的認(rèn)可。春血安膠囊是由熟地黃、鹽車(chē)前子、肉桂、澤瀉和柴胡等13味中藥制成的中成藥復(fù)方制劑，主治肝腎不足、沖任失調(diào)所致的月經(jīng)失調(diào)、崩漏和痛經(jīng)，癥見(jiàn)經(jīng)行錯(cuò)后、經(jīng)量多或淋漓不凈、經(jīng)行小腹冷痛、腰部疼痛，青春期功能失調(diào)性子宮出血、上節(jié)育環(huán)后出血見(jiàn)上述證候患者[1]。中成藥復(fù)方制劑具有多組分、多靶點(diǎn)和整體作用的特點(diǎn)，通過(guò)各成分相互作用，達(dá)到臨床治療的效果，降低不良反應(yīng)，多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式近年來(lái)已逐步應(yīng)用于中藥及其制劑中。春血安膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]和文獻(xiàn)報(bào)道[2]中僅對(duì)佐藥黃連所含的鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀進(jìn)行了定量控制，未對(duì)處方中君藥和其他藥材所含成分進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)選取方中熟地黃和鹽車(chē)前子[3]所含活性成分毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1，肉桂所含特征成分肉桂酸和桂皮醛，澤瀉[4]所含代表性成分澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B為檢測(cè)指標(biāo)，建立能同時(shí)測(cè)定春血安膠囊中8種成分含量的HPLC法，為更加全面地評(píng)價(jià)春血安膠囊的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Ulti Mate3000型高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；CPA225D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500E型臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 毛蕊花糖苷(批號(hào)111530-201914，CAS號(hào)：61276-17-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.2%)、肉桂酸(批號(hào)110786-201604，CAS號(hào)：140-10-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.8%)、桂皮醛(批號(hào)110710-201821，CAS號(hào)：14371-10-9，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%)和23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品(批號(hào)111846-201705，CAS號(hào)：26575-95-1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；焦地黃苯乙醇苷B1對(duì)照品(批號(hào)CFS201802，CAS號(hào)：120406-37-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)，購(gòu)于武漢天植生物技術(shù)有限公司；澤瀉醇F(批號(hào)PRF9041322，CAS號(hào)：155521-45-2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%)和24-乙酰澤瀉醇A對(duì)照品(批號(hào)PRF8050342，CAS號(hào)：18674-16-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%)，均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；澤瀉醇A對(duì)照品(批號(hào)15071422，CAS號(hào)：19885-10-0，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.9%)，購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。乙腈為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。春血安膠囊(規(guī)格：每粒0.5 g，批號(hào)：A08004，A08007，A08012)，均購(gòu)于天津宏仁堂藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃。乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脫(0～8.0 min，15.0%A；8.0～14.0 min，15.0%A～22.0%A；14.0～25.0 min，22.0%A～52.0%A；25.0～43.0 min，52.0%A～78.0%A；43.0～50.0 min，78.0%A～15.0%A)。流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為330(0～14.0 min檢測(cè)毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1)[5-15],280(14.0～25.0 min檢測(cè)肉桂酸和桂皮醛)[16-18]和208 nm(25.0～50.0 min檢測(cè)澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B)[19-21]。

2.2溶液的配制

2.2.1混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取8種成分對(duì)照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2.536，0.992，0.178，2.814，0.132，0.276，0.228，0.892 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL，用甲醇定容至50 mL，制成8種成分質(zhì)量濃度分別為126.8，49.6，8.9，140.7，6.6，13.8，11.4，44.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取春血安膠囊20粒，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱(chēng)取4.0 g，加入甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷后用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3陰性樣品溶液 按照《中國(guó)藥典》2015年版一部春血安膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下的處方工藝，分別制備缺肉桂、澤瀉、熟地黃和鹽車(chē)前子的陰性樣品，再按照2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液及空白溶劑(甲醇)各適量，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，在與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品色譜圖中8種成分色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)，與相鄰雜質(zhì)峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按照各成分色譜峰計(jì)算均≥4 500；圖1C中未見(jiàn)毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1色譜峰，圖1D中未見(jiàn)肉桂酸和桂皮醛色譜峰，圖1E中未見(jiàn)澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B色譜峰，表明陰性樣品對(duì)春血安膠囊中8種成分的同時(shí)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4線(xiàn)性關(guān)系 精密吸取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分別用甲醇定容至20 mL，制成系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，檢測(cè)8種成分的峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，見(jiàn)表1。

表1 春血安膠囊中8種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得8種成分峰面積的RSD值分別為0.66%，0.71%，1.09%，0.57%，1.15%，0.98%，1.03%，0.84%，表明實(shí)驗(yàn)精密度良好。

圖1 HPLC圖

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批春血安膠囊，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定8種成分的峰面積，計(jì)算得峰面積的RSD值分別為1.17%，1.23%，0.76%，1.02%，0.88%，1.55%，1.69%，1.47%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的同一份供試品溶液(臨用新配)，分別于0，2，4，6，12和18 h進(jìn)樣檢測(cè)8種成分的峰面積，結(jié)果峰面積的RSD值分別為0.63%，0.69%，1.05%，0.59%，1.18%，1.27%，1.06，0.89%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8平均回收率 取8種成分含量已知的同一批春血安膠囊，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱(chēng)取2.0 g，共9份，每3份隨機(jī)分為1組，置于25 mL量瓶中，依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部要求，分別加入另行配制的混合對(duì)照品溶液(8種成分質(zhì)量濃度分別為1.718，0.712，0.104，1.848，0.078，0.152，0.128，0.496 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5 mL，使對(duì)照品加入量為樣品含有量的50%，100%，150%，再按照2.2.2項(xiàng)下方法制成加樣供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)8種成分的峰面積，計(jì)算各成分含量，用測(cè)得量與原有量之差除以對(duì)照品加入量計(jì)算8種成分的回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9含量測(cè)定 取3批春血安膠囊，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各批次平行3份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)8種成分的峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8種成分的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1待測(cè)物的選擇 春血安膠囊是由熟地黃、鹽車(chē)前子、肉桂、澤瀉、柴胡、山藥、附片(黑附片)、三七、牡丹皮、茯苓、黃連、五味子(酒蒸)和牛膝13味中藥材配伍制成的，方中熟地黃補(bǔ)血滋陰、益精填髓，山藥生津益肺、補(bǔ)腎澀精，合為君藥；肉桂、附片(黑附片)補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸元、溫經(jīng)止痛，三七、牡丹皮活血祛瘀、止血定痛，合為臣藥；澤瀉利水滲濕、泄熱化濁，鹽車(chē)前子清熱滲濕、利尿通淋，茯苓利水滲濕，柴胡疏肝調(diào)氣，黃連清熱涼血，五味子(酒蒸)滋補(bǔ)肝腎、收斂止血，合為佐藥；牛膝補(bǔ)肝腎、固沖任、強(qiáng)筋骨、壯腰膝，引諸藥直達(dá)腎經(jīng)，為使藥。諸藥配伍，相互協(xié)調(diào)、制約，共達(dá)益腎固沖、調(diào)經(jīng)止血之功。依據(jù)中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，以君藥所含主要成分為首選，同時(shí)兼顧臣、佐、使藥所含成分，選取君藥熟地黃和佐藥鹽車(chē)前子所含活性成分毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1，臣藥肉桂所含特征成分肉桂酸和桂皮醛，佐藥澤瀉所含代表性成分澤瀉醇F、澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A和23-乙酰澤瀉醇B為待測(cè)物，以期全面評(píng)價(jià)春血安膠囊的質(zhì)量。

3.2提取條件的篩選 春血安膠囊方中附片、三七、柴胡和黃連均是細(xì)粉直接入藥，其他成分經(jīng)水提加工后入藥，為確保待測(cè)物提取完全，實(shí)驗(yàn)初期，采用加熱回流提取60 min的同一條件，對(duì)提取溶劑(體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇[5-10，12，22]、甲醇[11-17，23]、體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇)進(jìn)行對(duì)比考察，結(jié)果以甲醇為提取溶劑時(shí)，8種成分綜合提取率最佳，雜質(zhì)干擾較?。凰鞂?duì)不同提取方法(超聲[8-13，15-21]提取和加熱回流[7，14]提取)及不同提取時(shí)間(15，30，60 min)進(jìn)行對(duì)比考察，結(jié)果超聲提取15 min時(shí)待測(cè)物肉桂酸和桂皮醛提取不完全，超聲提取30，60 min時(shí)所得結(jié)果無(wú)明顯差異，考慮到溶液制備的便捷性，最終選取甲醇超聲提取30 min制備供試品溶液。

3.3流動(dòng)相的選擇 考慮到甲醇存在紫外末端吸收，實(shí)驗(yàn)中參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)乙腈-水[18-21]、乙腈-1 mL·L-1甲酸[6，22，24]、乙腈-1 mL·L-1磷酸[5，7，10-12，15-17]和乙腈-1 mL·L-1冰醋酸[8-9，13-14]流動(dòng)相體系進(jìn)行對(duì)比考察，結(jié)果顯示，以乙腈-1 mL·L-1磷酸為流動(dòng)相時(shí)基線(xiàn)平穩(wěn)，8種成分色譜峰峰形較好，與相鄰色譜峰分離效果較好，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相比例的不斷優(yōu)化，最終確定采用乙腈-1 mL·L-1磷酸為流動(dòng)相按照2.1項(xiàng)下流動(dòng)相比例對(duì)春血安膠囊中8種成分的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)首次采用HPLC法對(duì)春血安膠囊中8種成分的含量進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，建立了春血安膠囊多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，該方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為提高春血安膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和綜合評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。