青錢柳藥用優(yōu)良單株評價與選擇

田 力，徐騁煒，尚旭嵐，洑香香

(南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)又名青錢李、搖錢樹等，系胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya)植物，是中國特有的單種屬植物。青錢柳是傳統(tǒng)的清熱解毒中藥材，在《中藥辭海》《中藥大辭典》中都有記載?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)青錢柳葉片內(nèi)含有獨特的生物活性物質(zhì)，具有重要的醫(yī)藥和保健價值。青錢柳葉片中總黃酮、總?cè)坪退苄远嗵堑壬锘钚晕镔|(zhì)，能明顯降低血糖、尿糖，還具有防癌、抗腫瘤的功效[1-3]。民間常在春季(3—5月)采摘嫩葉制茶[4]，茶味口感清新甜爽；秋季(9—10月)則是葉片主要生物活性物質(zhì)積累和葉生物量最高的季節(jié)[5-7]，常用作制藥提取原料。

藥用植物主要生物活性物質(zhì)的含量和活性在種源間、家系間和個體間均存在顯著差異。如厚樸(Magnoliaofficinaalis)的酚含量在種源間的差異高達8倍[8]；黃芩(Scutellariabaicalensis)的黃芩苷含量種源間具有顯著差異，黃芩素含量的變異達到極顯著水平[9]。銀杏(Gingkobiloba)不同種源葉片的內(nèi)酯含量也存顯著差異[10]。在家系水平上，鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)的多糖和總黃酮含量均差異顯著[11]。東北紅豆杉(Taxuscuspidata)不同單株間的紫杉醇含量差異高達4.3倍[12]。對青錢柳的研究也表明，葉片總黃酮在種源、家系和個體間均存在顯著差異，家系間的含量均值相差1.81倍，且家系水平上的差異大于種源間的差異[13-14]。青錢柳葉片黃酮類物質(zhì)也存在明顯的地理變異，緯度變異大于經(jīng)度變異[15]。另外，青錢柳葉中的酚類物質(zhì)在種源間也存在顯著差異，酚類物質(zhì)在體外的抗氧化活性屬湖北五峰種源最高[16]。

植物體內(nèi)的生物活性物質(zhì)常與表型密切相關(guān)。如葉色與類黃酮的組成和積累量顯著相關(guān)[17-18]；有些表型則影響了葉生物量(葉產(chǎn)量)，如葉面積大小、葉形等[19]；而有的表型間接地改變了栽培植株的微環(huán)境，從而引起生物活性物質(zhì)的含量變化，如分枝角和冠型[20]。所以可利用植物的葉片、枝條和根系等表型性狀來進行優(yōu)株的初步選擇[21-22]。

筆者通過多年對青錢柳種質(zhì)資源庫的觀測發(fā)現(xiàn)，植株表型存在豐富的變異：如嫩葉葉色有紅色、淡粉紅色和黃綠色等變異；葉面積的大小變異達2倍以上；葉形有卷曲和平展之分；Ⅰ級側(cè)枝的分枝角變異從30°到60°，從而形成不同的冠型(緊湊型、開張型和扁平型)。

本研究在第1輪表型性狀選擇的基礎(chǔ)上，測定了葉片中主要生物活性物質(zhì)的含量，通過第2輪單指標和多指標選擇和對優(yōu)選單株生物活性物質(zhì)含量年度間穩(wěn)定性的觀察，為選育生物活性物質(zhì)含量高、年度間穩(wěn)定性好的青錢柳藥用新品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 候選林分概況

候選林分為6年生，已進入大規(guī)模采葉期的人工林，2015年種植于安徽池州市石臺縣青錢柳試驗基地(117°17′E,30°14′N)，面積約40 hm2。試驗材料收集了張家界、井岡山、五峰、沐川、浙江千島湖等地青錢柳自然分布區(qū)的不同種源，栽植密度為2.0 m×2.0 m。

該地屬中亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，處于黃山、九華山余脈與長江交匯帶，土壤呈微堿性；歷年平均氣溫16 ℃、最高氣溫40.8 ℃、最低氣溫-8.5 ℃，全年無霜期233 d，年均日照時間為1 702 h，年均降雨量1 350～1 800 mm，是青錢柳的自然分布區(qū)之一。

1.2 優(yōu)良單株的選擇

1.2.1 第1輪選擇

在前期優(yōu)良種源性狀的基礎(chǔ)上，2017年3月底幼葉展開后進行優(yōu)良單株的第1輪選擇。選擇標準主要基于植株的葉(葉色、葉形、葉面積大小)和樹型(分枝角和冠型)等性狀，初步入選優(yōu)株逐一編號、標記和登記，具體指標如下。

葉片：嫩葉葉色(LC)以紅色為入選標準，以綠色為對照；葉面積大小(LS)，以葉面積為常規(guī)葉面積的1.5～2.0倍為入選標準；葉片平展程度(LF)，以葉面卷曲為入選標準。

樹型：Ⅰ級側(cè)枝與主干的分枝角(BA)>45°為選擇標準；冠型以樹形飽滿的卵圓形(CR，所有Ⅰ級側(cè)枝均勻分布主干四周)和樹形平展的扁平型(CP，所有Ⅰ級側(cè)枝處于1個平面上)為入選標準。

對照植株表型為青錢柳常見葉和樹形特征：嫩葉黃綠色、常規(guī)葉大小和葉面平展；分枝角30°～45°，冠型卵圓形。

分別測定初選優(yōu)株的葉片總黃酮、總?cè)坪退苄远嗵堑壬锘钚晕镔|(zhì)的含量，預(yù)測改良潛力。改良潛力代表在育種過程中可以把相應(yīng)指標含量提高的潛力[23]，計算公式為：

1.2.2 第2輪選擇

于2017年9月底采收初選優(yōu)株葉片，選取向陽面中上部完全展開的功能葉(一般位于枝條頂芽下部第4～6個復(fù)葉中部的小葉)，在不同枝條上采收5～8片復(fù)葉。將采集的葉片置于60 ℃的烘箱中干燥48 h，烘至質(zhì)量恒定后粉碎，過200目(44 μm孔徑)篩，將粉末干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

葉片主要生物活性物質(zhì)(包括總黃酮、總?cè)坪退苄远嗵?含量的測定方法參考Wen等[24]、Fu等[25]和Fan等[26]的方法。

第2輪單指標選擇標準：某種活性物質(zhì)含量高于平均值為Ⅱ級優(yōu)樹，高于平均值一個標準差的為Ⅰ級優(yōu)樹。

第2輪多指標選擇采用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)的方法，綜合比較葉片的生物活性物質(zhì)，即對3種生物活性物質(zhì)分別求隸屬值，平均后得其綜合隸屬值。以綜合隸屬值高于平均綜合隸屬值50%為選擇標準。

隸屬值計算公式為：

隸屬值=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)×100%;

綜合隸屬值=(X1+X2+X3)/3。

式中：X為某一指標測定值，Xmax為該指標所有測定值的最大值，Xmin為該指標所有測定值的最小值；

X1為總黃酮隸屬值，X2為總?cè)齐`屬值，X3為水溶性多糖隸屬值。

1.3 穩(wěn)定性評價和決選

翌年(2018年9月)采收按第2輪單指標和多項指標選擇入選優(yōu)樹葉片，測定其主要生物活性物質(zhì)含量。通過年度間比較評價葉片生物活性物質(zhì)含量的穩(wěn)定性，終選出性狀穩(wěn)定的優(yōu)樹。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010和SPSS 19.0進行統(tǒng)計再綜合分析。對各指標進行單因素方差分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良單株的第1輪選擇

根據(jù)第1輪選擇標準，選出36株優(yōu)良單株。其中基于優(yōu)良種源的分析[5]，選出生物活性物質(zhì)含量高的優(yōu)株3株，根據(jù)表型性狀選出優(yōu)株30株，及3株對照植株。優(yōu)良單株編號、來源及具體的形態(tài)特征見表1。

表1 青錢柳第1輪選擇優(yōu)株的基本信息

表1(續(xù))

2.2 優(yōu)良單株的第2輪選擇

2.2.1 初選優(yōu)株葉片主要生物活性物質(zhì)的比較

方差分析表明，第1輪選擇出的36個優(yōu)株葉片3種生物活性物質(zhì)含量存在極顯著差異(P<0.01，表2)。總黃酮含量變幅為16.91～34.62 mg/g，均值為25.78 mg/g；其中LC1含量最高，是最小含量LS3的2.05倍，比均值高出34.3%?？?cè)坪康淖兎鶠?4.97～30.12 mg/g，均值為21.00 mg/g；其中CR6含量最高，是最小含量CP7的2倍，而比均值高出43.4%。水溶性多糖含量為17.21～29.26 mg/g，其中CR3最高，是最小值CK中含量的1.7倍，比均值高出36.41%。

表2 青錢柳藥用優(yōu)株葉片主要生物活性物質(zhì)的含量比較

由表2可知，33個優(yōu)株的總黃酮、總?cè)坪退苄远嗵堑钠骄糠謩e為25.90、21.24和21.52 mg/g，分別比CK均值高5.9%、15.6%和3.8%?？傸S酮、總?cè)坪退苄远嗵歉牧紳摿Ψ謩e為34.30%、43.43%和36.41%。由此可見，以表型性狀為選擇依據(jù)可選擇到總?cè)坪扛叩膬?yōu)株，總黃酮和水溶性多糖提高的幅度較小。

2.2.2 單指標選擇

根據(jù)當年9月總黃酮、總?cè)坪退苄远嗵堑暮?，?3個優(yōu)株進行單指標選擇，含量高于平均值為Ⅱ級優(yōu)樹標準，含量高于平均值加一個標準差為Ⅰ級優(yōu)樹標準。

從單指標選擇結(jié)果(表3)可知，以總黃酮含量為選優(yōu)目標，選出Ⅱ級優(yōu)樹14株(入選率42.4%)，均值為27.67 mg/g，比未入選單株均值高出24.1%；選出5株Ⅰ級優(yōu)樹，分別是LC1、LC4、LC5、LF2和CP3(入選率15.2%)，均值為32.40 mg/g，比未入選單株均值高出45.4%。以總?cè)茷檫x優(yōu)目標，選出Ⅱ級優(yōu)樹12株(入選率36.4%)，均值為22.72 mg/g，比未入選單株均值高出26.0%；選出5株Ⅰ級優(yōu)樹，分別是CR6、CP3、LC2、LC4和CP1(入選率15.2%)，均值為25.34 mg/g，比未入選單株均值高出56.2%。以水溶性多糖為選優(yōu)目標，選出Ⅱ級優(yōu)樹12株(入選率36.4%)，均值為22.52 mg/g，比未入選單株均值高出17.4%；選出7株Ⅰ級優(yōu)樹，分別是CR3、LF3、CR2、CR6、LC4、LF4和LS2(入選率21.2%)，均值為25.13 mg/g，比未入選單株均值高出31.0%。

表3 基于葉主要生物活性物質(zhì)進行單指標選擇的青錢柳藥用優(yōu)株

2.2.3 多指標選擇

通過對葉總黃酮、總?cè)坪退苄远嗵请`屬函數(shù)分析，獲得了排名前10的綜合隸屬函數(shù)值(表4)。由表4可知，入選單株LC4的綜合隸屬函數(shù)值最高、LC2最低，分別為76.84%、49.37%。

表4 基于多指標選擇的青錢柳高含量生物活性物質(zhì)優(yōu)株的綜合隸屬函數(shù)

對照表3，多指標選擇排名前10的植株均在單指標選擇Ⅰ級入選范圍內(nèi)。其中，4株(LC1、LC4、LC5和CP3)為高黃酮含量、4株(LC4、CP3、LC2和CR6)為高三萜含量和6株(CR3、LF3、CR2、CR6、LC4和LS2)為高多糖含量。

2.3 優(yōu)株年度含量穩(wěn)定性評價及決選

為了選出表達穩(wěn)定的優(yōu)株，在2018年9月對多指標優(yōu)選排名前10的前4位和后3位(共7株)、單指標Ⅱ級的部分優(yōu)株(4株)及未入選部分植株(3株)，進行主要活性物質(zhì)的測定，并將測定結(jié)果與2017年含量進行比較后確定決選植株(表5)。

由表5可知，兩個年度間除水溶性多糖外，總黃酮和總?cè)凭祻拇蟮叫【来螢槎嘀笜诉x擇優(yōu)株、單指標Ⅱ級優(yōu)株、未入選植株，說明多指標優(yōu)選方法是可行的。比較年度間各成分含量的穩(wěn)定性，大部分入選單株年度間不同組分的含量波動較大，最高可達50%，如CP3和CR6中的總?cè)坪?；同時，2018年大部分生物活性物質(zhì)的含量低于2017年的測定值。由此可見，青錢柳葉片主要生物活性物質(zhì)的含量除了受個體基因型的控制以外，環(huán)境因素的影響也較大。

表5 青錢柳葉主要生物活性物質(zhì)含量的年度穩(wěn)定性評價

因此，藥用青錢柳的選優(yōu)，需要盡量排除環(huán)境干擾的影響，選出生物活性物質(zhì)含量穩(wěn)定的基因型。穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，青錢柳優(yōu)樹的決選，除了生物活性物質(zhì)多指標綜合考慮，中選單株活性組分的年度相對穩(wěn)定性也是必須考慮的。通過綜合評價，從第2輪選擇出的優(yōu)樹中決選出編號為LC1、LC4和CP3的3單株。

2.4 植株表型變異與生物活性物質(zhì)含量相關(guān)性檢驗

為了評價青錢柳表型選擇的效果，分析了基于不同表型性狀的葉主要活性物質(zhì)含量并進行相關(guān)顯著性檢驗，結(jié)果見表6。

由表6可知，嫩葉紅色性狀與總黃酮和總?cè)坪砍蕵O顯著相關(guān)，其均值分別比CK高出23.42%和32.77%。其次，冠形飽滿、分枝角大的植株與總?cè)坪恳卜謩e呈顯著和極顯著的正相關(guān)，均值分別比CK提高15.24%和24.33%?；诒硇托誀钊脒x的其他單株的葉片活性物質(zhì)含量平均值，都未達到統(tǒng)計顯著水平。由此可見，嫩葉紅色、分枝角大和冠型飽滿可作為青錢柳藥用優(yōu)株的第1輪選擇標準。

表6 不同表型性狀青錢柳優(yōu)株葉片生物活性物質(zhì)的含量及其相關(guān)性檢驗

3 討 論

我國對于林源中藥原料植物挖掘和利用具有悠久的歷史。但傳統(tǒng)的中藥采收和制備，更多注重原藥材的“地道性”和“原生性”，即更多注重藥用植物(藥材)的藥效(質(zhì))。但地道性優(yōu)質(zhì)藥材受到產(chǎn)量的局限，遠遠不能滿足中藥市場的需要。優(yōu)質(zhì)地道性中藥材品種選育和定向栽培逐漸成為林源藥材發(fā)展的重要發(fā)展方向，并取得了重要進展。如厚樸樹皮中的厚樸酚高含量的種源和家系選擇[8]、南方紅豆杉(Taxuswallichiana)根和樹皮中的紫杉醇和枝葉中的紫杉醇半合成前體巴卡亭-Ⅲ和10-去乙?；涂ㄍあ蠼M分的資源選擇[27]、及用于農(nóng)藥原料印楝(Azadirachtaindica)種子印楝素A和B含量的種源選擇[28]。藥用植物中的有效成分與表型性狀相關(guān)的間接選擇也受到重視。如發(fā)現(xiàn)了厚樸酚的含量與厚樸葉型的顯著相關(guān)性[8]、三七(Panaxontoginseng)的葉面積對根質(zhì)量的貢獻[29]、葉色與葉片黃酮含量的高低有關(guān)[17-18]。這些表型性狀可作為間接選擇的重要參考。但更多情況下，藥用植物生物活性物質(zhì)與表型的相關(guān)性受到栽培環(huán)境的變化而缺乏規(guī)律，從而給藥用植物的地道性和以生物活性物質(zhì)為目標的品種培育帶來了困難。

但不同藥用植物種以及種內(nèi)不同種源、林分和家系間的生物活性成分高低以及與表型性狀的相關(guān)性，也存在顯著的遺傳變異和受遺傳與環(huán)境的互作影響。方升佐等[30]、林源等[32]發(fā)現(xiàn)，青錢柳葉片中生物活性物質(zhì)的主要成分是三萜、黃酮和水溶性多糖。洑香香等[25]發(fā)現(xiàn)不同葉色的青錢柳基因型黃酮含量的變異，以及側(cè)枝與主干的分枝角影響樹冠形狀與結(jié)構(gòu)，造成了不同位置(植株上、中和下部)葉受光不同，從而影響到生物活性物質(zhì)的積累。其他研究結(jié)果表明，不同樹冠結(jié)構(gòu)的表型影響到單位面積葉片總的生物量[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳新梢嫩葉呈紅色與總黃酮、總?cè)频暮砍蕵O顯著相關(guān)，而分枝角度大小則與總?cè)坪砍蕵O顯著相關(guān)；具有飽滿冠型的植株不僅與葉片總?cè)坪匡@著相關(guān)，還預(yù)示了葉片總生物量的增加。

由于林源藥用植物的有效成分和含量同時受到基因型和環(huán)境的影響，有效生物活性物質(zhì)的有效成分(次生代謝物)和含量的年度穩(wěn)定性下的早期和間接選擇效率顯得尤為重要。因此，藥用青錢柳新品種選育時，將單指標選擇和多指標選擇、年度穩(wěn)定性評價結(jié)合起來，是提高青錢柳藥用或保健用生物活性物質(zhì)育種的有效策略。本研究采用這種策略，從第1輪選擇出的36株材料中經(jīng)過第2輪篩選出10個優(yōu)良單株，并進一步結(jié)合生物活性物質(zhì)含量年度間的穩(wěn)定性，決選出3優(yōu)株，編號分別為LC1、LC4和CP3，入選率為9.0%。初步研究結(jié)果表明，青錢柳藥用優(yōu)株的選擇可以嫩葉紅色、大分枝角為首要選擇指標，輔以飽滿的冠型，可以作為青錢柳以次生代謝物為主的生物活性物質(zhì)育種材料選擇的重要依據(jù)。生物活性物質(zhì)有效成分含量和總生物量增加的選育目標，對于林源中藥或保健產(chǎn)品的現(xiàn)代化加工利用產(chǎn)業(yè)化，具有重要意義。同時，中選材料為下一步的育種和栽培模式研究，提供了重要的材料基礎(chǔ)。

但是，本優(yōu)選的原始材料雖然來自青錢柳的主要栽培區(qū)，但材料表現(xiàn)和穩(wěn)定性測定僅局限于安徽石臺栽培點的兩個年度的初步結(jié)果。選擇材料的無性系化和多點多年度的穩(wěn)定評價等重要科學(xué)問題，有待進一步深入研究。