莪術(shù)醇的分離鑒定及體外抗腫瘤作用機(jī)制研究

羅球珠，李穗暉，黃楚燕

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510407）

目前對(duì)腫瘤特別是惡性腫瘤的治療，常采用手術(shù)治療和化學(xué)治療（簡(jiǎn)稱化療）［1-2］。腫瘤化療藥物的選擇是目前重要的研究方向之一［3］。莪術(shù)醇又名姜黃醇，為白色針狀晶體，主要是從莪術(shù)油中提取而來(lái)，具有抗腫瘤作用，臨床用于治療宮頸癌效果較好［4］。但莪術(shù)油中含β-欖香烯等成分，不良反應(yīng)較多，需提純后使用［5］。本研究中對(duì)莪術(shù)醇進(jìn)行了分離鑒定，并探討其體外抗腫瘤效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：970CRT/XP型熒光分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；TGL-16M型離心機(jī)（濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司）；CytoFLE型流式細(xì)胞儀（貝克曼有限公司）；WMS-1037型細(xì)顯微鏡（上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司）；ZSP-350S型細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海左樂(lè)儀器有限公司）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀及相關(guān)系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）。

試藥：復(fù)方莪術(shù)油栓（湖北四環(huán)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20054798，規(guī)格為每枚50 mg）；B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體（批號(hào)為20190603）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗 體（批 號(hào) 為20190606），半 胱 氨 酸 蛋 白 酶3（Caspase-3）抗體（批 號(hào)為20190601），均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（廣州威佳科技有限公司）；Ki67抗體、PCNA抗體均購(gòu)自艾博抗中國(guó)公司；青霉素鈉、磷酸緩沖液（天津科密歐有限公司）；AAnnexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物科技公司，批號(hào)為BB-4101）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

細(xì)胞：宮頸癌細(xì)胞及肺癌細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。

1.2 方法

莪術(shù)醇的分離與鑒定［6-7］：取莪術(shù)油樣品50 mL，置圓底燒瓶中減壓蒸餾（208～216℃），收集餾分，用石油醚洗滌，用無(wú)水乙醇將餾分重結(jié)晶為白色晶，重復(fù)操作3次，得莪術(shù)醇供試品。莪術(shù)醇對(duì)照品和提取的莪術(shù)醇以石油醚溶解，采用油醚-乙酸乙酯顯色，以紫外-可見(jiàn)分光光度法，于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定并比較對(duì)照品和供試品的吸光度（OD）。

腫瘤細(xì)胞增殖的檢測(cè)：在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞，在RPMI 1640培養(yǎng)基中加入青霉素和鏈霉素各100 U/mL。取上述培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至96孔板中，接種密度為5 000個(gè)/孔，分別加入1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/mL的莪術(shù)醇供試品和對(duì)照品繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入20μL MTT溶液，靜置4 h，去上清液后使用二甲基亞砜（DMSO）振蕩溶解，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD。抑制率（%）＝（1-OD）/OD×100%。

宮頸癌細(xì)胞蛋白表達(dá)的檢測(cè)：試驗(yàn)分為模型組、莪術(shù)醇組、莪術(shù)油組，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞。4℃下離心10 min，裂解后取上清。用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法后半干法電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，37℃下封閉2 h，TBST清洗3次，加入相應(yīng)抗體，常規(guī)孵育。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，將PVDF膜放入暗盒，壓上X膠片，然后取出膠片顯影、定影、清洗。將目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

宮頸癌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：分組與培養(yǎng)同上，將上述宮頸癌細(xì)胞離心5 min（4℃，5 g）；收集細(xì)胞，分別加入100μL的Binding Buffer及5μL的PI和Annexin VFITC，在室溫條件下避光孵育，加入400μL的Binding Buffer后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism5軟件繪圖及統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇的鑒定

莪術(shù)醇供試品與對(duì)照品在同一位置顯色（見(jiàn)圖1），OD值及純度見(jiàn)表1。

圖1 對(duì)照品與供試品油醚-乙酸乙酯顯色比較A.Reference substance B.Test substanceFig.1 Comparison of the oleyl ether-ethyl acetate strip of reference and test substance

表1 莪術(shù)醇吸光度比較Tab.1 Absorbance comparison of curcumol

2.2 腫瘤細(xì)胞增殖結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖2。莪術(shù)醇對(duì)宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞的抑制率均高于莪術(shù)油，莪術(shù)油對(duì)宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞的半數(shù)致死濃度（LD50）分別為9.01 mg/mL，9.91 mg/mL；莪術(shù)醇分別為8.21 mg/mL，10.01 mg/mL。

圖2 腫瘤細(xì)胞增殖結(jié)果A.Zedoary turmeric oil B.CurcumolFig.2 The proliferation of tumor cells

2.3 蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡結(jié)果

各組細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖3，細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖4，細(xì)胞凋亡情況見(jiàn)圖5。

3 討論

圖3 腫瘤細(xì)胞Ki67和PCNA蛋白表達(dá)A.Model group B.Curcumol group C.Zedoary turmeric oil groupNote：Compared with those in model group，*P＜0.05；compared with those in curcumol group，＃P＜0.05；as well as the following tables.Fig.3 The expression of Ki67 and PCNA protein in tumor cells

圖4 Caspase-3、Bax和Bcl-2表達(dá)情況A.Model group B.Curcumol group C.Zedoary turmeric oil groupFig.4 The expression of Caspase-3，Bax and Bcl-2

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況A.Model group B.Curcumol group C.Zedoary turmeric oil group D.Data statistics histogramFig.5 The apoptosis of each group detected by flow cytometry

莪術(shù)醇具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等作用，同時(shí)可加快腫瘤細(xì)胞凋亡［9］。本研究中MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，莪術(shù)醇對(duì)宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞均有較高的抑制率，且均高于莪術(shù)油對(duì)宮頸癌細(xì)胞抑制率。莪術(shù)醇對(duì)腫瘤細(xì)胞也有一定抑制作用，可能是因?yàn)檩g(shù)醇作用了腫瘤細(xì)胞的線粒體，使其受到抑制，影響其增殖能量代謝，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，增殖細(xì)胞周期相關(guān)核抗原Ki67和PCNA表達(dá)水平均降低，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞分裂減慢?？赡芤?yàn)檩g(shù)醇中含有抑制增殖蛋白的氫化類化合物，減弱了其增殖能力。馬希中［10］研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇抑制癌細(xì)胞增殖，作用機(jī)制與下調(diào)PCNA基因的表達(dá)相關(guān)，與本研究結(jié)論一致。

調(diào)控細(xì)胞凋亡可有效阻滯腫瘤進(jìn)展［11］。Caspase家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因之一，主要包括Caspase-3及Caspase-9等促凋亡基因，其水平升高說(shuō)明細(xì)胞趨向凋亡。Bcl-2和Bax也是較常見(jiàn)調(diào)控凋亡的基因，其中Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bax為促凋亡蛋白［12］。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)油組和莪術(shù)醇組促凋亡蛋白表達(dá)水平均顯著升高，抗凋亡蛋白表達(dá)水平顯著降低；相比莪術(shù)油組，莪術(shù)醇組Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高。同時(shí)，使用莪術(shù)醇的效果優(yōu)于莪術(shù)油。莪術(shù)油中除了莪術(shù)醇可有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡外，還存在其他成分，使用同等濃度的兩種物質(zhì)，莪術(shù)醇的相對(duì)濃度較高，使得莪術(shù)醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡促進(jìn)效果優(yōu)于莪術(shù)油。廖彬汛等［13］研究表明，莪術(shù)油具有促進(jìn)直腸癌細(xì)胞凋亡的作用，與本研究得出的結(jié)論類似。

綜上所述，莪術(shù)油可通過(guò)減壓蒸餾的方式分離出莪術(shù)醇，兩者均可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，且莪術(shù)醇效果顯著優(yōu)于莪術(shù)油。