海研站菌S52 菌株Cr(Ⅵ)還原酶活性和穩(wěn)定性及其還原Cr(Ⅵ)的條件優(yōu)化

李佳瑤, 李曉夏, 安秋穎, 范 春, 郭東北, 唐 晨, 張 敏, 桑都哈西·歇里亞孜旦, 趙 苒

（1. 廈門大學(xué)分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，福建廈門 361102；2. 四川省成都市邛崍市衛(wèi)生健康局辦公室，四川 成都 611530）

鉻（Chromium，Cr） 是導(dǎo)致環(huán)境污染的主要重金屬元素之一，金屬電鍍、紡織染色和木材處理等工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中排放出來(lái)的污水中均含有Cr［1］。自然界中以三價(jià)鉻［trivalent chromium，Cr（Ⅲ）］和六價(jià)鉻［hexavalent chromium，Cr （Ⅵ）］最為穩(wěn)定，但二者的性質(zhì)大不相同。Cr（Ⅲ） 毒性較小，微量的Cr（Ⅲ）是機(jī)體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；Cr（Ⅵ）溶解度更高，具有強(qiáng)烈的致癌、致畸和致突變性，其毒性比Cr （Ⅲ） 高約100 倍，致突變性高1 000 倍［2］，美國(guó)環(huán)境環(huán)保局已經(jīng)把Cr（Ⅵ）確定為對(duì)人體最具威脅的17 種化學(xué)物質(zhì)之一［3］。人群主要通過(guò)食物、飲用水?dāng)z入和空氣等途徑暴露于Cr［4］，皮 膚 及 呼 吸 系 統(tǒng) 易 受 損 害［5］。由 于 食 物 鏈的生物富集和放大作用［6］，因重金屬等化學(xué)污染物排放造成的海洋污染，已致海產(chǎn)品面臨食品安全問(wèn)題［7］。針對(duì)福建省水產(chǎn)品中Cr 蓄積情況的研究［8］顯示：部分水產(chǎn)品樣本存在Cr 超標(biāo)的現(xiàn)象。流行病學(xué)調(diào)查［9］顯示：長(zhǎng)期職業(yè)暴露于Cr 也是肺癌高發(fā)的危險(xiǎn)因素。因Cr（Ⅵ）污染而帶來(lái)的公眾健康問(wèn)題日益突出，如何安全有效地去除或減少Cr（Ⅵ）污染，對(duì)保護(hù)生態(tài)平衡和人類健康具有重大意義。

Cr（Ⅵ）污染水體的主要治理方法有傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法和生物修復(fù)法。物理化學(xué)方法主要包括還原-離子交換法、吸附法和混凝法等，雖然處理效果尚可，但其存在反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜、成本高、副產(chǎn)物較多和易產(chǎn)生二次污染等不足［10］。生物修復(fù)法是一種新興的、環(huán)境友好型的Cr（Ⅵ）污染水體修復(fù)技術(shù)，主要包括動(dòng)物修復(fù)法、植物修復(fù)法和微生物修復(fù)法，具有過(guò)程安全、成本低、修復(fù)效率高和無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的發(fā)展前景［11］。pH 值和溫度一直被認(rèn)為是微生物修復(fù)Cr（Ⅵ）的2 個(gè)重要影響因素，可能影響著菌株內(nèi)或者生物膜上有關(guān)蛋白酶的作用。pH 值和溫度影響菌株還原效率的相關(guān)研究已多見報(bào)道［12-13］，但大多停留在對(duì)還原菌株的篩選及其還原效率層面，鮮見對(duì)菌株胞內(nèi)胞外活性物質(zhì)分析及其最優(yōu)還原條件探索的研究。

本課題組前期從廈門市大嶝島雙滬碼頭附近的海灘沉積物樣品中成功分離篩選獲得一株具有高效Cr（Ⅵ）還原能力的細(xì)菌Mesonia sp.S52，將其命名 為 海 研 站 菌 S52 菌 株 （ 授 權(quán) 專 利 號(hào)：ZL201410819468.3）。在實(shí)驗(yàn)室條件下，該菌株最大 耐Cr （Ⅵ） 濃 度 為500 mg·L－1，48 h 內(nèi) 對(duì)50 mg·L－1Cr（Ⅵ） 的還原率可達(dá)73%以上。本研究通過(guò)對(duì)S52 菌株還原活性物質(zhì)［Cr（Ⅵ）還原酶］ 進(jìn)行提取和定位，同時(shí)探討pH 值和溫度對(duì)Cr （Ⅵ）還原酶穩(wěn)定性和活性的影響，以及不同金屬離子和小分子物質(zhì)對(duì)其還原效率的影響，旨在明確S52 菌株還原Cr（Ⅵ）的途徑及其機(jī)制，為后續(xù)微生物修復(fù)技術(shù)的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑和儀器

選用的實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室從廈門市大嶝島雙滬碼頭附近的海灘沉積物樣品中分離篩選并進(jìn)行鑒定得到的海研站菌（Mesonia sp.） S52 菌株。LB 肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司），重鉻酸鉀、Triton X-100、 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、丙酮、 吐溫80 和十二烷基硫酸鈉（SDS） 等化學(xué)試劑均為分析純。U410-86 型超低溫冰箱（美國(guó)NBS 公司），Epoch2 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek 儀器有限公司），KQ3200B 型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司），THZ-C 型恒溫振蕩器（江蘇太倉(cāng)強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），EL204 型電子天平和FE20 型pH 計(jì)（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），DNP-9052 型恒溫培養(yǎng)箱（廈門精藝興業(yè)科技有限公司），VCX130PB 型超聲波破碎儀（美國(guó)Sonics 公司），SW-CJ-2F 型超凈工作臺(tái)（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司），MSH-S 型磁力攪拌器［大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司］，GI54TW 型全自動(dòng)滅菌鍋［致微（廈門）儀器有限公司］，湘儀GL-21M 離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 種子液的制備

取保存于－80 ℃超低溫冰箱中的S52 菌液，平板劃線法接種于LB 固體培養(yǎng)基中，挑取分離純化得到的S52 單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r·min－1恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h 即得S52 種子液。

1.3 Cr（Ⅵ）還原酶的提取和定位

按4%接種量將S52 種子液接種于LB 液體培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)（12 h）后，4 ℃、12 000 r·min－1離心5min，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后，收集上清液即為胞外活性物質(zhì)（胞外酶）；用Tris-HCl 緩沖液（pH 值為8.0）洗滌菌體，再次離心去上清，重復(fù)3 次，加入原培養(yǎng)基的1/20 體積的Tris-HCl，漩渦振蕩，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌玻璃容器中，用超聲波破碎儀冰浴 破 菌，將 破 碎 液4 ℃、12 000 r·min－1離 心20 min，取上清液到新的離心管中，即為胞內(nèi)活性物質(zhì)（胞內(nèi)酶）［13-14］。將上述獲得的胞內(nèi)活性物質(zhì)用Tris-HCl 定容至與胞外活性物質(zhì)的體積相同，與用作對(duì)照組的S52 全菌體分別加入到含50 mg·L－1Cr（Ⅵ）的培養(yǎng)體系中，37 ℃、pH 值為8.0、160 r·min－1搖 床 培 養(yǎng)，于0、3、6、12、24 和48 h 分別采用二苯碳酰二肼分光光度法分別測(cè)定溶液中Cr（Ⅵ）濃度，計(jì)算不同時(shí)刻Cr（Ⅵ）還原率。Cr （Ⅵ） 還原率計(jì)算方法：實(shí)驗(yàn)初始Cr （Ⅵ）濃度記為ρ0，待測(cè)時(shí)點(diǎn)測(cè)得Cr（Ⅵ）濃度 記 為ρ1，待 測(cè) 時(shí) 刻 還 原 率X= （ρ0-ρ1）/ρ0×100%，根據(jù)計(jì)算所得的Cr （Ⅵ） 還原率判斷Cr （Ⅵ）的還原情況。

1.4 Cr（Ⅵ）還原酶的性質(zhì)

1.4.1 不同溫度和不同pH 值時(shí)Cr（Ⅵ）還原酶活性 37 ℃、pH 值為7.0 條件下，將一定量的Cr （Ⅵ）還原酶（即胞外、胞內(nèi)活性物質(zhì)） 與50 mg·L－1Cr（Ⅵ）反應(yīng)，3 h 后測(cè)定Cr（Ⅵ）濃度，將Cr（Ⅵ）濃度的減少量作為活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)［15］，以相對(duì)活性指標(biāo)來(lái)表示Cr（Ⅵ）還原酶活性，相對(duì)活性=不同條件下Cr（Ⅵ）濃度減少量/前述相對(duì)活性的標(biāo)準(zhǔn)×100%。保持pH 值7.0 不變，改變溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃；在酶 活 性 最 高 的37 ℃下，改 變pH 值 為5.0、6.0、8.0、9.0 和10.0，分 別 與50 mg·L－1Cr（Ⅵ）反應(yīng)，同樣計(jì)算得出Cr（Ⅵ）還原酶相對(duì)活性。

1.4.2 不同溫度和不同pH 值時(shí)Cr（Ⅵ）還原酶穩(wěn)定性 將一定量Cr（Ⅵ）還原酶置于4 ℃、pH 值為7.0 的LB 培養(yǎng)基中24 h 后取出，在pH 值7.0、37 ℃條件下與50 mg·L－1Cr（Ⅵ）反應(yīng)，3 h 后測(cè)定Cr（Ⅵ）濃度，將Cr（Ⅵ）濃度的減少量作為相對(duì)穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)［15］，以相對(duì)穩(wěn)定性指標(biāo)來(lái)表示Cr（Ⅵ）還原酶穩(wěn)定性，相對(duì)穩(wěn)定性=不同條件下Cr（Ⅵ） 濃度減少量/前述相對(duì)穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)×100%。保持pH 值7.0 不變，改變溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃；4 ℃條件下將pH 值分別改為5.0、 6.0、 8.0、 9.0 和10.0，24 h 后 分 別 與50 mg·L－1Cr （Ⅵ） 在37 ℃條件下反應(yīng)，同樣計(jì)算得出Cr（Ⅵ）還原酶相對(duì)穩(wěn)定性。

1.5 二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定Cr（Ⅵ）濃度

參照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法金屬指標(biāo)》（GBT 5750.6-2006），測(cè)定Cr（Ⅵ）濃度。

1.6 二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定不同溫度和不同pH 值組Cr（Ⅵ）還原酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率

將溫度設(shè)為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃，pH 值設(shè)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0。采用混合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將各個(gè)溫度水平與pH 值水平完全隨機(jī)組合（6×6），實(shí)驗(yàn)組總共設(shè)為36 組，同時(shí)各設(shè)3 組平行對(duì)照。分別以4%接種量接種S52 種子液于含50 mg·L－1Cr（Ⅵ）的培養(yǎng)基中，不同溫度和不同pH 值條件下，同時(shí)置于160 r·min－1恒 溫 搖 床 中 震 蕩 培 養(yǎng)，在0、3、6 和12 h 分別采用二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定Cr （Ⅵ）濃度并計(jì)算各個(gè)時(shí)刻的Cr（Ⅵ）還原率。采用方差分析和多重比較等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析S52 菌株的Cr（Ⅵ）還原酶還原Cr（Ⅵ）的最適宜溫度和pH 值，擬合出最優(yōu)還原條件。

1.7 二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定不同金屬離子處理組Cr（Ⅵ）還原酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率

分別將濃度為0.2 mmol·L－1的Cu2+、Mn2+和Cd2+溶液加入到LB 液體培養(yǎng)基中作為處理組，以未作處理的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，在“1.6”中得到的最優(yōu)還原條件下與50 mg·L－1的Cr （Ⅵ） 反應(yīng)3 h，采用二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定Cr（Ⅵ）濃度，比較不同金屬離子處理組Cr（Ⅵ）還原酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率。

1.8 二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定不同小分子物質(zhì)處理組Cr（Ⅵ）還原酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率

分別將濃度為1 mmol·L－1的SDS、EDTA 和1%的Triton100、吐溫80 加入到LB 液體培養(yǎng)基中作為處理組，以未做處理的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，在“1.6”中得到的最優(yōu)還原條件下與50 mg·L－1的Cr （Ⅵ）反應(yīng)3 h，用二苯碳酰二肼分光光度法測(cè)定Cr（Ⅵ）濃度，比較不同小分子物質(zhì)處理組Cr （Ⅵ）還原酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用Excel 2018 軟件繪制圖表。Cr （Ⅵ） 還原酶對(duì)Cr （Ⅵ）的還原率、Cr（Ⅵ）還原酶相對(duì)活性和相對(duì)穩(wěn)定性均符合正態(tài)分布并且方差齊，以表示，不同溫度和不同pH 值處理組間比較采用析因方差分析和多重比較，不同金屬離子和小分子物質(zhì)處理組多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Cr（Ⅵ）還原酶的提取和定位

隨著時(shí)間延長(zhǎng)，S52 原菌體對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率不斷升高，48 h 時(shí)對(duì)50 mg·L－1Cr（Ⅵ）的還原率可達(dá)73.1%； 3 h 時(shí)，胞 內(nèi) 酶 和 胞 外 酶 對(duì)Cr （Ⅵ）的還原率達(dá)到最高，且胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率高于胞外酶（P＜0.05）；隨后Cr（Ⅵ）還原率不斷降低，相同時(shí)間點(diǎn)胞內(nèi)酶和胞外酶的對(duì)Cr（Ⅵ） 的還原率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），12 h 后Cr（Ⅵ）還原率幾乎為0，且12、24 和48 h 間Cr（Ⅵ）還原率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 Cr（Ⅵ）還原酶的性質(zhì)

2.2.1 不同溫度時(shí)胞內(nèi)酶和胞外酶的相對(duì)活性和穩(wěn)定性 對(duì)于胞內(nèi)酶，保持良好活性的溫度范圍為35 ℃～45 ℃，若將其預(yù)先置于45 ℃～50 ℃條件下24 h 可能會(huì)引起酶的不穩(wěn)定，同時(shí)影響酶活性（圖1 A）；對(duì)于胞外酶，在25 ℃～30 ℃時(shí)較適合其酶活性發(fā)揮，4 ℃～30 ℃穩(wěn)定性較好，且不同溫度間差別不明顯（圖1 B）。因此胞內(nèi)酶最適溫度為35 ℃～45 ℃，胞外酶最適溫度為25 ℃～30 ℃。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)S52 菌株胞內(nèi)酶和胞外酶對(duì)Cr(Ⅵ)的還原率Tab.1 Reduction rates of Cr(Ⅵ)by intracellular and extracellular enzymes in S52 strain at differenttime points

表1 不同時(shí)間點(diǎn)S52 菌株胞內(nèi)酶和胞外酶對(duì)Cr(Ⅵ)的還原率Tab.1 Reduction rates of Cr(Ⅵ)by intracellular and extracellular enzymes in S52 strain at differenttime points

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with extracellular enzyme.

Group Reduction rate of Cr(Ⅵ)48 73.1±4.3 0.6±0.1*0.0±0.0*(t/h) 3 1.8±0.5 18.1±1.3*△10.8±1.5*6 12 11.8±1.9 0.2±0.1*0.1±0.2*24 26.9±3.1 0.0±0.0*0.8±0.1*Control Intracellular enzyme Extracellular enzyme 6.1±1.2 3.2±0.9*2.7±0.5*

2.2.2 不同pH 值時(shí)胞內(nèi)酶和胞外酶的相對(duì)活性和穩(wěn)定性 當(dāng)pH 值＜7.0 或pH 值＞7.0 時(shí)，胞內(nèi)酶的酶活性或穩(wěn)定性會(huì)有較大損失，因此胞內(nèi)酶的最適pH 值為7.0；當(dāng)pH 值在7.0～8.0 時(shí)，胞外酶的穩(wěn)定性較好，但當(dāng)pH 值＞7.0 時(shí)，酶活性有一定損失，因此胞外酶的最適pH 值也為7.0。見圖2。

2.3 不同溫度和不同pH 值條件下胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率

隨著時(shí)間延長(zhǎng)，不同溫度和不同pH 值條件下胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率均逐漸降低，12 h 時(shí)所有組未見明顯還原效果。作用3 h 時(shí)，相同溫度下，pH 值從5.0 到6.0，胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率明顯升高；隨著pH 值升高，其還原率大幅降低。在一定pH 值條件下，溫度從25 ℃～45 ℃，胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率逐漸升高。在45 ℃、pH 值6.0條件下，胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率最高，達(dá)到39.7%。采用析因設(shè)計(jì)資料方差分析，不同pH 值組間胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=201.748 ，P＜0.05）；結(jié)合多重比較，當(dāng)pH 值為6 時(shí)，胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率高于其他pH 值組（P＜0.05）；不同溫度組間胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ） 的還原率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.671，P＜0.05），溫度為40℃和45℃組胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ） 的還原率均高于其他組（P＜0.05），但其2 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。溫度和pH 值具有明顯的交互效應(yīng)（P＜0.05）。見表2。

2.4 不同溫度和不同pH 值條件下胞外酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率

隨著時(shí)間延長(zhǎng)，不同溫度和不同pH 值條件下胞外酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率均逐漸降低，12 h 時(shí)所有組均未見明顯還原效果。作用3 h 時(shí)，溫度一定時(shí)，pH 值從5.0 到6.0，胞外酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率明顯升高；隨著pH 值從7.0 增加到10.0，其還原率呈降低趨勢(shì)。隨著溫度從30 ℃逐漸上升至50 ℃，胞外酶對(duì)Cr（Ⅵ） 還原率逐漸降低。在30 ℃、pH 值6.0 條件下，胞外酶還原率最高（19.8%）。采用析因設(shè)計(jì)資料方差分析，不同pH值組間胞外酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=580，P＜0.05）；結(jié)合多重比較，pH 值6.0 和7.0 組胞外酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率均高于其他pH 值組（P＜0.05），但其2 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同溫度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=355.064，P＜0.05），當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)胞外酶時(shí)Cr（Ⅵ）的還原率高于其他溫度組（P＜0.05）。溫度和pH 值具有明顯的交互效應(yīng)（P＜0.05）。見表3。

圖1 不同溫度時(shí)胞內(nèi)酶（A）和胞外酶（B）的相對(duì)活性和穩(wěn)定性Fig. 1 Relative activities and stabilities of intracellular and extracellular enzymes at different temperatures

圖2 不同pH 值時(shí)胞內(nèi)酶（A）和胞外酶（B）的相對(duì)活性和穩(wěn)定性Fig. 2 Relative activities and stabilities of intracellular and extracellular enzymes at different pH values

表2 不同溫度和不同pH 值條件下作用3 h 胞內(nèi)酶對(duì)Cr(Ⅵ)的還原率Tab.2 Reduction rates of Cr(Ⅵ)by intracellular enzymes under conditions of different temperatures and pH values at 3 h after treatment

表2 不同溫度和不同pH 值條件下作用3 h 胞內(nèi)酶對(duì)Cr(Ⅵ)的還原率Tab.2 Reduction rates of Cr(Ⅵ)by intracellular enzymes under conditions of different temperatures and pH values at 3 h after treatment

*P＜0.05 compared with pH 6.0 group at the same temperature；ΔP＜0.05 compared with 40 ℃at the same pH value；#P＜0.05 compared with 45 ℃at the same pH value.

pH Reduction rate of Cr(Ⅵ)50 10.0±1.1*Δ#33.4±3.3Δ#28.6±4.3*Δ#16.1±5.5*Δ#6.1±1.2*Δ#5.2±0.9*Δ#5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0(θ/℃)25 6.2±0.9*Δ#12.3±1.4Δ#12.3±1.9*Δ#7.4±0.4*Δ#5.8±1.1*Δ#3.4±0.1*Δ#30 7.9±1.1*Δ#24.5±2.1Δ#23.0±3.0*Δ#11.6±2.4*Δ#6.0±1.3*Δ#4.3±0.2*Δ#35 8.3±1.0*Δ#30.6±3.2Δ#29.2±2.3*Δ#17.4±3.6*Δ#8.0±1.5*Δ#5.8±0.8*Δ#40 12.9±1.8*38.2±3.3 33.6±4.1*19.2±3.5*9.1±3.0*6.8±0.9*45 14.4±4.0*39.7±4.2 36.0±5.1*19.9±1.9*9.3±1.1*7.1±0.8*

表3 不同溫度和不同pH 值條件下作用3 h 胞外酶對(duì)Cr(Ⅵ)的還原率Tab.3 Reduction rates of Cr (Ⅵ)by extracellular enzymes at different temperatures and pH values at 3 h after treatment

2.5 不同金屬離子作用3 h 后各組Cr（Ⅵ）還原酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率

在胞內(nèi)酶和胞外酶最適條件下，與對(duì)照組比較，Cu2+處理組胞內(nèi)酶和胞外酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率明顯升高（P＜0.05），而Cd2+和Mn2+處理組胞內(nèi)酶和胞外酶對(duì)Cr （Ⅵ） 的還原率明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 不同金屬離子作用3 h 后各組Cr(Ⅵ) 還原酶對(duì)Cr(Ⅵ)的還原率Tab. 4 Reduction rates of Cr(Ⅵ) by Cr(Ⅵ) reductases after treated with different metal ions for 3 h in various groups

2.6 不同小分子物質(zhì)作用3 h 后各組Cr（Ⅵ）還原酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率

在胞內(nèi)酶和胞外酶最適條件下，與對(duì)照組比較，Triton X-100 處理組胞內(nèi)酶和胞外酶對(duì)Cr （Ⅵ）的還原率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），吐溫80、EDTA 和SDS 處理組胞內(nèi)酶和胞外酶對(duì)Cr （Ⅵ）的還原率均不同程度降低（P＜0.05）。見表5。

表5 不同小分子物質(zhì)作用3 h 后各組Cr(Ⅵ)還原酶對(duì)Cr(Ⅵ)的還原率Tab. 5 Reduction rates of Cr(Ⅵ) by Cr(Ⅵ) redutases after treated with different small molecules for 3 h in various groups

3 討 論

微生物對(duì)Cr（Ⅵ） 的還原通常包含胞內(nèi)還原和胞外還原［16］，催化該過(guò)程的還原酶可能位于胞內(nèi)、胞外和胞膜上［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：S52 菌株的細(xì)胞內(nèi)、外均有可能是還原酶還原Cr（Ⅵ）的場(chǎng)所。在pH 值為6.0、溫度45 ℃的條件下反應(yīng)3 h，胞內(nèi)酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率最高（39.7%），在pH 6.0、溫度30 ℃的條件下反應(yīng)3 h，胞外酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原率最高（19.8%），之后逐漸降低，均明顯低于S52 全菌的最高還原率（73.1%），故推測(cè)除還原酶外，菌株S52 可能還存在使Cr（Ⅵ）還原的其他途徑。酶作為菌株實(shí)現(xiàn)其還原功能的最主要單元，理論上其還原效率應(yīng)近似于全菌，本課題組前期研究的Sporosarcina saromensisM52 菌株［14］，雖然其胞外活性物質(zhì)的還原率遠(yuǎn)低于全菌，但其胞內(nèi)活性物質(zhì)的還原率約為全菌的1.3 倍。推測(cè)本研究中，在反應(yīng)初期，大量的Cr（Ⅵ）進(jìn)入菌體內(nèi)，受相關(guān)活性物質(zhì)催化，在未被還原為Cr（Ⅲ）之前，經(jīng)電子傳遞系統(tǒng)形成了不穩(wěn)定的中間體Cr（Ⅴ）［18］；隨著還原反應(yīng)繼續(xù)，一部分Cr（Ⅴ）氧化為Cr（Ⅵ），形成大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使得胞內(nèi)氧化壓力增加，破壞細(xì)胞成分，影響核酸和氨基酸等的合成［19］，并導(dǎo)致遺傳物質(zhì)及蛋白質(zhì)出現(xiàn)氧化損傷［20］。多數(shù)微生物在進(jìn)化過(guò)程中形成了應(yīng)對(duì)氧化壓力的保護(hù)機(jī)制，產(chǎn)生能夠與Cr（Ⅴ）鰲合形成相對(duì) 穩(wěn) 定 的 去 鐵 胺（deferoxamine，DFX） 類 物質(zhì)［21］，但DFX-Cr（Ⅴ）螯合物只能暫時(shí)穩(wěn)定存在，逐漸解離后，Cr（Ⅴ）會(huì)被快速氧化為Cr（Ⅵ），DFX 則被排出胞外。該機(jī)制可能是S52 菌株胞內(nèi)和胞外還原率先升高后降低的原因。此外，本實(shí)驗(yàn)所提取的活性物質(zhì)以離體形式存在，其還原體系中的電子供體總量有限，缺乏持續(xù)供能的活性物質(zhì)及ATP 等，可能也是導(dǎo)致反應(yīng)無(wú)法持續(xù)進(jìn)行及后續(xù)還原率降低的原因之一。

本研究對(duì)S52 菌株胞內(nèi)酶和胞外酶的相對(duì)活性和穩(wěn)定性測(cè)定以及還原條件優(yōu)化，結(jié)果顯示：胞內(nèi)酶還原Cr（Ⅵ）的最適溫度為35 ℃～45 ℃，最適pH 值為7.0，胞外酶還原Cr（Ⅵ）的最適溫度為25 ℃～30 ℃，最適pH 值為 7.0；從 二 者 還 原Cr（Ⅵ） 的最適溫度范圍未出現(xiàn)重合這一點(diǎn)來(lái)推測(cè)，S52 全菌發(fā)揮還原作用的溫度范圍可能較大。研究［22-24］顯示：不同來(lái)源菌株的還原酶其性質(zhì)存在一定的差別，如Bacillus sp．、Escherichia coliATCC 33456 和Bacillus thuringiensisC-2 菌 中 的 還原酶最適pH 值、溫度以及相對(duì)活性、相對(duì)穩(wěn)定性等最優(yōu)還原條件均不完全相同。

魏斐等［24］研究發(fā)現(xiàn)：Cu2+能夠明顯促進(jìn)蘇云金芽孢桿菌對(duì)Cr（Ⅵ）的還原作用；肖偉等［15］和楊勝男等［25］的研究也證實(shí)Cu2+可增強(qiáng)Cr（Ⅵ）還原酶活性。 Cu2+參與構(gòu)成多種抗氧化酶［26］，是很多還原酶的輔基［15］，還是氧化呼吸電子轉(zhuǎn)運(yùn)的重要部分［27］，上述功能有助于通過(guò)提高電子轉(zhuǎn)移效率而提高Cr（Ⅵ）的生物還原［28］；除Cu2+外，其他重金屬離子絕大多數(shù)在不同程度上抑制Cr（Ⅵ）還原酶的活性。本研究結(jié)果顯示：Cd2+和Mn2+可抑制S52 菌株Cr（Ⅵ）還原酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原。本研究結(jié)果同時(shí)顯示：Triton X-100 對(duì)Cr（Ⅵ）還原酶還原Cr（Ⅵ） 無(wú)明顯影響，吐溫80、EDTA和SDS 則不同程度抑制Cr（Ⅵ）還原酶的活性，與魏斐等［24］研究結(jié)果基本一致，與郭東北等［14］研究結(jié)果略有不同，其研究顯示Triton X-100 可以抑制Cr（Ⅵ）還原酶對(duì)Cr（Ⅵ）的還原。

在應(yīng)用微生物修復(fù)水體Cr（Ⅵ）污染的實(shí)踐中，污染水源中其他金屬離子和小分子物質(zhì)的存在可能會(huì)影響Cr（Ⅵ）的預(yù)期還原效果，故可通過(guò)加入經(jīng)濟(jì)、有效的促還原物質(zhì)提升修復(fù)效果。另有研究［25，29-30］將菌藻共生體系用于修復(fù)含Cr（Ⅵ）和苯酚等的廢水，結(jié)果顯示：菌藻體系的還原效果高于單一菌株，提示不同細(xì)菌對(duì)污染物的去除可能存在協(xié)同作用，并因菌類和藻類的混合比例不同而表現(xiàn)出不同的修復(fù)效果，為進(jìn)一步優(yōu)化微生物修復(fù)效果提供了新的研究思路。

綜上所述，微生物之所以能夠在高濃度Cr（Ⅵ）的環(huán)境下生存，可能源于其存在特定的基因（簇），也可能由于不同濃度的Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)微生物的相關(guān)功能基因發(fā)生變化，進(jìn)化出對(duì)Cr（Ⅵ）的抗性和還原機(jī)制［31］。本研究通過(guò)對(duì)S52 菌株的Cr（Ⅵ）還原酶進(jìn)行定位，初步探討影響其還原效率的因素并進(jìn)行優(yōu)化，為闡明S52 菌株Cr（Ⅵ）還原酶還原Cr（Ⅵ）的分子生物學(xué)機(jī)制及其后續(xù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。