光動(dòng)力治療中提高光敏劑靶向性的研究進(jìn)展

楊宇鑫，趙學(xué)澤，樊江莉，2，彭孝軍

（1 大連理工大學(xué)精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116024； 2 大連理工大學(xué)寧波研究院，浙江寧波315016）

引 言

光動(dòng)力治療是一種基于光子誘發(fā)光敏劑產(chǎn)生活性氧的新型癌癥治療方法[1]。治療過(guò)程如下：首先給患者局部或靜脈注射光敏劑，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后光敏劑在腫瘤組織中富集。然后使用特定波長(zhǎng)的光照射腫瘤部位，光敏劑能夠吸收光子產(chǎn)生大量的活性氧物種。活性氧物種攻擊細(xì)胞，使生物分子和細(xì)胞發(fā)生形態(tài)或功能上的異變，造成直接的細(xì)胞損傷來(lái)致死細(xì)胞，從而殺死癌細(xì)胞并抑制其生長(zhǎng)[2-4]。

傳統(tǒng)的光敏劑對(duì)正常組織和腫瘤組織的區(qū)分能力有限，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)對(duì)正常組織造成毒副作用[5]。當(dāng)前光動(dòng)力治療研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一是如何進(jìn)一步提高光敏劑的腫瘤靶向性[6-7]。構(gòu)建靶標(biāo)型光敏劑和可激活光敏劑是提高光敏劑腫瘤靶向性的有效策略。靶標(biāo)型光敏劑是將光敏劑分子共價(jià)連接靶標(biāo)基團(tuán)，通過(guò)靶標(biāo)基團(tuán)特異性識(shí)別癌細(xì)胞，提高光敏劑的靶向能力。而可激活光敏劑能夠被腫瘤微環(huán)境內(nèi)特定的靶向因子激活，特異性識(shí)別并殺傷腫瘤組織。本文分別介紹了靶標(biāo)型光敏劑和可激活光敏劑的研究進(jìn)展，并對(duì)未來(lái)光動(dòng)力治療面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了展望。

1 光動(dòng)力治療的原理

光動(dòng)力治療(photodynamic therapy, PDT)是一種使用光敏劑(photosensitizer,PS)進(jìn)行預(yù)處理，并在腫瘤區(qū)域使用激發(fā)光源照射，產(chǎn)生活性氧物種(reactive oxygen species, ROS)以破壞癌細(xì)胞的腫瘤治療方法[8]。在特定波長(zhǎng)的光源照射下，光敏劑會(huì)吸收光子，從基態(tài)(S0)躍遷到單重激發(fā)態(tài)(S1)[9]。激發(fā)態(tài)的分子極其不穩(wěn)定，它可通過(guò)非輻射躍遷回到基態(tài)，放出熱量；或通過(guò)輻射躍遷回到基態(tài)，發(fā)出熒光；也可以通過(guò)系間竄越(intersystem crossing,ISC)到達(dá)壽命相對(duì)較長(zhǎng)的三重激發(fā)態(tài)(T1)。T1態(tài)光敏劑的兩種失活途徑對(duì)應(yīng)了光動(dòng)力治療的兩種機(jī)理（圖1）。

一種是Ⅰ型反應(yīng)機(jī)理：光敏劑在細(xì)胞微環(huán)境中和生物分子發(fā)生電子或質(zhì)子轉(zhuǎn)移，形成自由基。自由基與氧氣發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，生成超氧陰離子自由基(O2-?)，最終通過(guò)歧化作用或者單電子還原過(guò)程生成具有生物毒性的羥基自由基(OH?)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化性損傷[11-12]。另一種是Ⅱ型反應(yīng)機(jī)理：三重激發(fā)態(tài)的光敏劑與基態(tài)氧(3O2)發(fā)生直接能量轉(zhuǎn)移，生成毒性極強(qiáng)的單線(xiàn)態(tài)氧(1O2)，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡或壞死[13]。Ⅱ型機(jī)理的光敏劑在治療過(guò)程中高度依賴(lài)氧氣濃度，并且會(huì)消耗大量的氧氣，加劇腫瘤乏氧程度。而研究表明，一些Ⅰ型PDT 即使在乏氧環(huán)境下也能表現(xiàn)出有效的治療效果[14]。對(duì)于兩種機(jī)理的光敏劑來(lái)說(shuō)，活性氧量子產(chǎn)率都是決定光動(dòng)力治療效果的重要因素之一。

相比于手術(shù)切除、放療、化療等傳統(tǒng)的癌癥治療方法，光動(dòng)力治療具有微創(chuàng)、極低的耐藥性、低副作用和時(shí)空選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。

2 光敏劑

光動(dòng)力治療的三大要素是激發(fā)光、氧氣和光敏劑。其中，光敏劑是光動(dòng)力治療中最為關(guān)鍵的因素。

卟啉類(lèi)光敏劑是光動(dòng)力治療中的第一代光敏劑。早在1975 年，血卟啉衍生物（HpD）就已成功用于光動(dòng)力治療。Photofrin[15]——從HpD 分離的卟啉二聚體和低聚物的混合物，已被批準(zhǔn)用于淺層腫瘤的治療。但是，該類(lèi)光敏劑存在化學(xué)純度低、組織穿透深度低、毒副作用大等缺點(diǎn)[16]。第二代光敏劑以酞菁類(lèi)化合物、卟吩及其衍生物、竹紅菌素等為代表[17-19]。第二代光敏劑具有更高的化學(xué)純度，最大吸收波長(zhǎng)紅移至600～800 nm 范圍內(nèi)，可用于相對(duì)深層腫瘤的治療[10]。

圖1 光動(dòng)力治療的機(jī)理示意圖[10]Fig.1 Schematic illustration of the mechanism of photodynamic therapy[10]

但是，傳統(tǒng)的光敏劑對(duì)腫瘤的選擇性有限，在光輻射條件下發(fā)揮光療作用的同時(shí)，也會(huì)對(duì)周?chē)恼＝M織產(chǎn)生光毒性，嚴(yán)重限制了光動(dòng)力治療的臨床應(yīng)用。提高光敏劑的腫瘤靶向性以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的特異性診斷與治療，具有重要的意義。因此，目前正在發(fā)展的第三代光敏劑是在第二代光敏劑的基礎(chǔ)上，將光敏劑與靶標(biāo)基團(tuán)共價(jià)連接，或者將光敏劑包載在納米載體中，以提高光敏劑的腫瘤組織靶向性[20]。

理想的光敏劑應(yīng)具有以下特征：（1）極低的暗毒性和高的光毒性；（2）在長(zhǎng)波長(zhǎng)處具有大摩爾消光系數(shù)；（3）對(duì)腫瘤組織具有高選擇性；（4）優(yōu)良的兩親性。表1介紹了目前常用的幾種光敏劑母體。

表1 常用光敏劑母體簡(jiǎn)介T(mén)able 1 Introduction of commonly used fluorophores as photosensitizers

3 靶標(biāo)型光敏劑

靶標(biāo)型光敏劑是將光敏劑分子共價(jià)連接腫瘤靶標(biāo)基團(tuán)（如單克隆抗體[12]、多肽[21]、糖類(lèi)等），利用靶標(biāo)基團(tuán)與癌細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合靶向遞送光敏劑，實(shí)現(xiàn)光敏劑對(duì)癌細(xì)胞的殺傷高于對(duì)正常細(xì)胞的損害[22]。當(dāng)前研究常用的腫瘤靶標(biāo)基團(tuán)有抗癌藥物、葉酸、生物素、核黃素等。下文從常用靶標(biāo)基團(tuán)進(jìn)行分類(lèi)，介紹了目前靶標(biāo)型光敏劑的研究進(jìn)展。

3.1 抗癌藥物靶向

近年來(lái)，研究者們開(kāi)發(fā)了許多將臨床批準(zhǔn)的化療藥物引入分子結(jié)構(gòu)的光敏劑。將抗癌藥物作為靶標(biāo)基團(tuán)與光敏劑共價(jià)連接，能夠在提高光敏劑腫瘤靶向能力的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)一定的協(xié)同化療作用。

Xue 等[23]首次將鋅酞菁與化療藥埃羅替尼共價(jià)連接合成了光敏劑3a、3b[圖2(a)]。該類(lèi)光敏劑以埃羅替尼作為靶向基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體過(guò)表達(dá)癌細(xì)胞的選擇性光動(dòng)力治療。其中，光敏劑3a 對(duì)HepG2（人源肝癌細(xì)胞）細(xì)胞的IC50（半抑制濃度）值為0.01 μmol/L。同時(shí)，埃羅替尼能夠改善光敏劑的兩親性和生物相容性。隨后，基于此思想，研究者們對(duì)抗癌藥物修飾的靶標(biāo)型光敏劑進(jìn)行了廣泛的研究。

Jung 等[24]將抗血管生成抑制劑乙酰唑胺（AZ）作為靶標(biāo)基團(tuán)，與傳統(tǒng)的BODIPY 類(lèi)光敏劑BPS 共價(jià)連接，合成了光敏劑AZ-BPS[圖2(b)]。AZ-BPS的乙酰唑胺部分能夠靶向癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的碳酸酐酶IX（CAIX），并對(duì)CAIX 產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而抑制腫瘤血管的生成[25-26]，提高PDT 對(duì)乏氧腫瘤的治療效率；而B(niǎo)PS 部分在660 nm 波長(zhǎng)的光激發(fā)下，能夠發(fā)出熒光并產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧，殺傷癌細(xì)胞?；铙w實(shí)驗(yàn)表明，與單純的BPS 相比，AZ-BPS 對(duì)碳酸酐酶陽(yáng)性腫瘤的選擇性得到了大幅提高，與各種血管生成因子相關(guān)的基因表達(dá)得以下調(diào)。但是，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用的光劑量（3600 J/cm2）遠(yuǎn)高于臨床使用標(biāo)準(zhǔn)。

在腫瘤細(xì)胞中，熱休克蛋白90（Hsp90）過(guò)量表達(dá)。藥物Ganetespib 能夠靶向Hsp90 并抑制其表達(dá)，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27-29]，具 有 優(yōu) 秀 的 腫 瘤 選 擇 性。Huang 等[30]將Ganetespib 與鋅酞菁光敏劑ZnPc 共價(jià)連接，制備了光敏劑Gan-ZnPc[圖2(c)]。光敏劑Gan-ZnPc 能夠選擇性識(shí)別并結(jié)合癌細(xì)胞表面的Hsp90，從而在癌細(xì)胞中富集，并通過(guò)Hsp90 介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)化作用進(jìn)入癌細(xì)胞，產(chǎn)生大量的活性氧殺傷腫瘤組織。在MCF-7（人源乳腺癌細(xì)胞）細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)和帶有4T1（鼠源乳腺癌細(xì)胞）細(xì)胞異種移植物的小鼠活體實(shí)驗(yàn)中，Gan-ZnPc均顯示出強(qiáng)大的腫瘤選擇性和抗腫瘤作用。

圖2 3a、3b、AZ-BPS、Gan-ZnPc和SORgenTAM的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic illustration of the chemical structure of 3a,3b,AZ-BPS,Gan-ZnPc and SORgenTAM

目前報(bào)道的光動(dòng)力治療系統(tǒng)大多數(shù)是通過(guò)高度依賴(lài)氧氣的Ⅱ型機(jī)理進(jìn)行的[31]。但是，由于癌細(xì)胞的過(guò)度增殖和腫瘤中血液供應(yīng)不足，氧氣濃度隨實(shí)體瘤中的位置不同而變化，某些區(qū)域氧含量非常低[32]。此外，Ⅱ型光動(dòng)力治療過(guò)程中會(huì)消耗氧氣，同時(shí)阻塞腫瘤血管，造成更嚴(yán)重的乏氧，不利于腫瘤的治療[33]。

抗雌激素藥物他莫昔芬（TAM）能夠通過(guò)影響線(xiàn)粒體電子傳輸來(lái)干擾細(xì)胞能量代謝過(guò)程，降低細(xì)胞內(nèi)源性O(shè)2消耗速率并下調(diào)HIF-1α 蛋白的表達(dá)，從而減輕腫瘤的固有低氧環(huán)境[34]。本課題組[35]將TAM 引入光敏劑分子結(jié)構(gòu)中，合成了一例基于Ⅰ型反應(yīng)機(jī)理的光敏劑SORgenTAM[圖2(d)]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，即使在嚴(yán)重的乏氧環(huán)境下，SORgenTAM 也能降低內(nèi)源性O(shè)2消耗，并且利用節(jié)約的內(nèi)源性O(shè)2生成O2-?，啟動(dòng)低氧氣依賴(lài)性的Ⅰ型PDT。在低氧環(huán)境下（2% O2），較低濃度的SORgenTAM（0.63 μmol/L）在低劑量光照下（660 nm，20 mW/cm2, 10 min）就能夠殺死約83%的癌細(xì)胞。

3.2 靶向癌細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)物

目前,利用癌癥表面特異性受體與化合物分子給體之間的特異性結(jié)合是實(shí)現(xiàn)光敏劑靶向遞送的主要方式[22]。

生物素受體在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面是過(guò)表達(dá)的[36]。本課題組[37]將生物素作為靶標(biāo)基團(tuán)引入光敏劑分子中，合成了能夠靶向生物素受體陽(yáng)性腫瘤的光敏劑ENBS-B[圖3(a)]。實(shí)驗(yàn)表明，即使在乏氧環(huán)境下（2%O2），ENBS-B 也能通過(guò)Ⅰ型反應(yīng)機(jī)理產(chǎn)生大量的O2-?，并通過(guò)超氧化物歧化酶（SOD）介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)將部分O2-?轉(zhuǎn)化為高生物毒性的OH?。這些自由基能夠協(xié)同破壞細(xì)胞內(nèi)溶酶體，從而觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出強(qiáng)大的低氧PDT 效果。受益于生物素配體的靶向能力，ENBS-B 在癌細(xì)胞中的細(xì)胞攝取率比在正常細(xì)胞中高87倍。

隨后，本課題組[38]開(kāi)發(fā)了另一例將生物素作為靶向配體的近紅外光敏劑Se-Biotin[圖3(b)]。Se-Biotin 能夠有效區(qū)分腫瘤細(xì)胞（MCF-7 細(xì)胞）和正常細(xì)胞，從而顯著降低對(duì)正常細(xì)胞的副作用。在660 nm波長(zhǎng)的光源照射下，Se-Biotin在生物素受體陽(yáng)性腫瘤中的IC50值低至85 nmol/L，表現(xiàn)出有效的抗癌效果。

圖3 ENBS-B、Se-Biotin、BTM和FL-RGD的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Schematic illustration of the chemical structure of ENBS-B,Se-Biotin,BTM and FL-RGD

甘露糖受體在多種癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)。甘露糖修飾的光敏劑可通過(guò)甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化到癌細(xì)胞中?；诖怂枷耄琙hang等[39]合成了與甘露糖共價(jià)連接的BODIPY 類(lèi)光敏劑BTM，然后將BTM 與Tween 80 共組裝為納米膠束B(niǎo)TM-NMs[圖3(c)]。BTM-NMs 能夠通過(guò)高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeablity and retention effect，EPR）促進(jìn)其在腫瘤部位的積累[40]。此外，將甘露糖連接在納米載體表面能夠增強(qiáng)BTM-NMs 的腫瘤靶向能力，減少其對(duì)正常細(xì)胞的副作用。BTM-NMs 通過(guò)甘露糖受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用選擇性?xún)?nèi)化到MDA-MB-231（人源乳腺癌細(xì)胞）細(xì)胞后，在細(xì)胞溶酶體中分解為光敏劑BTM。使用12 μg/ml 的BTM-NMs 和光源（665 nm，20 mW/cm2，30 min）照射進(jìn)行光動(dòng)力治療后，癌細(xì)胞死亡率達(dá)到90%。

整聯(lián)蛋白αvβ3是一種異質(zhì)二聚體細(xì)胞表面受體，在多種癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，但在大多數(shù)正常組織和血管中很少表達(dá)，它對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成起重要作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽（RGD）是整聯(lián)蛋白的識(shí)別序列，對(duì)整聯(lián)蛋白具有選擇性。Ranyuk 等[41]將鋅酞菁與RGD 偶聯(lián)，制備了ZnPc-RGD 偶聯(lián)物。該光敏劑表現(xiàn)出與整聯(lián)蛋白結(jié)合的特性，但光動(dòng)力治療效果較差。

研究表明，多聚的RGD 更有利于其與整聯(lián)蛋白結(jié)合。因此，Liu 等[42]使用cycloRGD 修飾熒光素衍生物，制備了光敏劑FL-RGD[圖3(d)]。FL-RGD 可以靶向腫瘤組織并進(jìn)一步定位腫瘤細(xì)胞的溶酶體。在光源（630 nm，40 mW/cm2，20 min）照射下，F(xiàn)LRGD 處理的整聯(lián)蛋白αvβ3陽(yáng)性腫瘤的細(xì)胞凋亡率為46.6%。

3.3 結(jié)構(gòu)固有靶向

癌細(xì)胞膜表面通常呈較高負(fù)電性。當(dāng)光敏劑分子結(jié)構(gòu)中帶有正電荷時(shí)，光敏劑能夠通過(guò)靜電吸引作用靶向并進(jìn)入癌細(xì)胞，增強(qiáng)光敏劑的腫瘤靶向能力[43-44]。

本課題組[45]報(bào)道了一種將羅丹明染料（RDM，λabs,max= 550 nm）作為能量供體，BODIPY 光敏劑（BDP，λabs,max=660 nm）作為能量受體的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）的光敏劑RDM-BDP[圖4(a)]。由于分子結(jié)構(gòu)中帶有正電荷，RDM-BDP 結(jié)構(gòu)固有靶向呈較高負(fù)電性的癌細(xì)胞膜，并且定位于線(xiàn)粒體。因此，RDMBDP 的腫瘤細(xì)胞攝取率比單純的BDP 高了13 倍。并且，RDM 的發(fā)射波長(zhǎng)與BDP的吸收波長(zhǎng)具有很大的重疊。因此，當(dāng)RDM 受到光激發(fā)后，其激發(fā)態(tài)能量能夠有效傳遞給BDP。相對(duì)于BDP 的窄光譜范圍而言，RDM-BDP 的吸收光譜得到明顯拓寬（500～700 nm），從而提高了RDM-BDP 的1O2產(chǎn)生效率。在660 nm 激發(fā)光照射下，RDM-BDP 的1O2產(chǎn)生效率與BDP 相當(dāng)。但是，在550 nm 激發(fā)光照射下，RDM-BDP 的IC50值僅為BDP 的1/81。經(jīng)400～700 nm 寬譜光源照射后，0.16 μmol/L 的RDM-BDP 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率大于90%，而B(niǎo)DP 僅為20%，RDMBDP的光動(dòng)力效果與BDP相比得到明顯提升。

隨后，本課題組[43]報(bào)道了一例用于減輕光動(dòng)力治療氧氣依賴(lài)的I 型光敏劑ENBOS[圖4(b)]。通過(guò)FRET 過(guò)程，無(wú)光敏化性質(zhì)的能量供體（熒光團(tuán)ENBO）將其自身光譜吸收性質(zhì)附加給能量受體（光敏劑ENBS），導(dǎo)致ENBOS在近紅外光區(qū)的吸收強(qiáng)度明顯加強(qiáng)，其O2-?量子產(chǎn)率得到提高。受益于ENBOS 凈帶兩個(gè)正電荷，它具有強(qiáng)大的癌細(xì)胞靶向能力。在靜脈注射48 h 后，ENBOS 的信噪比達(dá)到25.2。由于ENBOS 可通過(guò)Ⅰ型機(jī)理高效產(chǎn)生O2-?，ENBOS 能夠有效殺傷乏氧腫瘤細(xì)胞。在乏氧實(shí)體瘤治療實(shí)驗(yàn)中，ENBOS 的腫瘤生長(zhǎng)抑制（TGI）率高達(dá)84%。

圖4 RDM-BDP、ENBOS、ENBS和ENBO的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 The chemical structure of RDM-BDP,ENBOS,ENBS and ENBO

4 可激活型光敏劑

腫瘤組織具有不同于正常組織的微環(huán)境、酶和核酸等,例如：（1）腫瘤組織的細(xì)胞外pH（在6.0～6.8）通常低于正常組織（pH 為7.4 左右），呈微酸性[46-47]；（2）腫瘤組織中谷胱甘肽（GSH）濃度通常高于正常組織[48]；（3）腫瘤組織中某些酶活性異常，如過(guò)表達(dá)的堿性磷酸酶、硝基還原酶、偶氮還原酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶等[49]。這些特異性是可激活型光敏劑識(shí)別癌細(xì)胞的刺激源。

可激活型光敏劑（activatable photosensitizers，aPSs）具備刺激響應(yīng)性質(zhì)，它能夠被特定的靶向因子激活以調(diào)控單線(xiàn)態(tài)氧的產(chǎn)生，選擇性識(shí)別并殺傷腫瘤組織。在正常組織中，即使在光照射下，可激活光敏劑也保持猝滅的光失活狀態(tài)，不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。但是當(dāng)aPSs 轉(zhuǎn)運(yùn)到靶組織后，靶向因子（如腫瘤微環(huán)境、酶、核酸等）將其選擇性激活，從而選擇性殺死腫瘤細(xì)胞[50]。開(kāi)發(fā)近紅外光激發(fā)的、能夠徹底猝滅其基底活性氧的可激活型光敏劑是目前aPSs 的研發(fā)目標(biāo)。下文從可激活光敏劑的猝滅機(jī)理進(jìn)行分類(lèi)，介紹當(dāng)前的研究進(jìn)展。

4.1 基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移猝滅

光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（photoinduced electron transfer,PET）過(guò)程能夠猝滅aPSs的激發(fā)態(tài)，從而猝滅其基底活性氧[51]。在腫瘤組織中，aPSs 的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（例如與H+結(jié)合發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，靶標(biāo)基團(tuán)被靶標(biāo)分子切斷等），導(dǎo)致PET 過(guò)程被抑制，從而恢復(fù)aPSs的單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生和熒光發(fā)射。

Chen等[52]報(bào)道了一種將鋅酞菁ZnPc與2,4,6-三（N,N-二甲基氨基甲基）苯氧基（TAP）共價(jià)連接的pH 響應(yīng)型可激活光敏劑ZnPc(TAP)4[圖5(a)]。氨基通過(guò)PET 過(guò)程猝滅ZnPc(TAP)4在正常組織中的光活性。在生理pH 下，ZnPc(TAP)4無(wú)明顯的光毒性。當(dāng)緩沖介質(zhì)的pH 從7.4 降低至6.5 時(shí)，氨基發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，PET 過(guò)程被抑制，ZnPc(TAP)4的熒光強(qiáng)度和單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生效率均得到增強(qiáng)。在帶有4T1細(xì)胞的小鼠活體治療實(shí)驗(yàn)中，ZnPc(TAP)4不僅消融了腫瘤細(xì)胞，還能對(duì)腫瘤部位進(jìn)行熒光成像，實(shí)現(xiàn)診斷與治療一體化。

圖5 基于PET的可激活光敏劑猝滅機(jī)理示意圖Fig.5 Schematic illustration of quenching mechanism of PET-based activatable photosensitizer

Sun 等[53]利用帶有正電荷的三苯基膦作為線(xiàn)粒體靶向配體[54-55]，合成了谷胱甘肽與H2O2雙重響應(yīng)的可激活光敏劑mitoaPs[圖5(b)]。在正常組織中，mitoaPs 的光毒性被徹底猝滅。在腫瘤組織中，mitoaPs與H2O2和谷胱甘肽發(fā)生反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為具有光毒性的光敏劑。激活的光敏劑可通過(guò)Ⅰ型和Ⅱ型兩種反應(yīng)機(jī)理生成O2-?和1O2，減輕PDT 的氧氣依賴(lài)程度。無(wú) 論 在21% O2還 是1% O2條 件 下，使 用H2O2（50 μmol/L）和mitoaPs（10 μmol/L）處理Hela（宮頸癌細(xì)胞）細(xì)胞24 h 后，再用激發(fā)光（405 nm, 30 mW/cm2）照射5～6 min，癌細(xì)胞存活率都低于10%。

Radunz 等[56]報(bào)道了一種基于酚羥基調(diào)控的pH響應(yīng)型BODIPY類(lèi)可激活光敏劑[圖5(c)]。在正常生理pH下，去質(zhì)子的酚羥基通過(guò)PET過(guò)程猝滅光敏劑的單線(xiàn)態(tài)氧和熒光的產(chǎn)生。在腫瘤組織的弱酸性條件下（pH =5.5），酚羥基發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，PET 過(guò)程被抑制，導(dǎo)致光敏劑的熒光恢復(fù)，產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧。將HeLa 細(xì)胞與0.1 μmol/L 的光敏劑共孵育24 h 后，使用532 nm 的激光二極管照射5 min，腫瘤細(xì)胞幾乎完全被殺死。但該BODIPY 類(lèi)光敏劑的水溶性有待改善。

光敏劑的細(xì)胞攝取水平對(duì)光動(dòng)力抗腫瘤效果有很大的影響[57]。Akkaya等[58]報(bào)道了一種GSH 響應(yīng)的BODIPY 類(lèi)可激活光敏劑PS1[圖5(d)]。由于聚乙二醇鏈的引入，PS1 的細(xì)胞滲透性和水溶性得到了提高，從而提高了其細(xì)胞攝取水平。在正常組織中，2,4-二硝基苯磺酸基團(tuán)通過(guò)PET 過(guò)程猝滅PS1的單線(xiàn)態(tài)氧和熒光的產(chǎn)生。在腫瘤組織中，過(guò)表達(dá)的GSH 將2,4-二硝基苯磺酸基團(tuán)切斷，PS1 的光敏性得到恢復(fù)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，在625 nm 的紅光LED 照射下，PS1 對(duì)正常MRC-5（人胎肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞系沒(méi)有明顯的毒性，但對(duì)HCT116（結(jié)腸癌細(xì)胞）細(xì)胞系具有顯著的光毒性，IC50值僅為20 nmol/L。得益于其較高的細(xì)胞攝取水平，PS1 僅在低濃度下即可高效殺傷腫瘤細(xì)胞。

目前報(bào)道的pH 激活的光敏劑大多需要在pH ≤5.5 時(shí)才能發(fā)揮作用。然而，腫瘤組織細(xì)胞外pH 通常在6.0～6.8。因此，制備能夠在微酸性環(huán)境下被顯著激活的光敏劑具有重要意義。

4.2 基于抑制分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移猝滅

基于抑制分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer, ICT）的可激活光敏劑的調(diào)控機(jī)理如下：在正常組織中，aPSs 的ICT 過(guò)程被抑制。此時(shí)，激發(fā)態(tài)能量主要通過(guò)振動(dòng)弛豫釋放，aPSs 的系間竄越過(guò)程被阻止，從而限制aPSs 在正常組織中的單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生能力，使其光毒性最小化[59-62]。而在腫瘤組織中，aPSs被特異性激活轉(zhuǎn)化為D-π-A結(jié)構(gòu)的光敏劑，ICT 過(guò)程恢復(fù)，從而恢復(fù)光敏劑的單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生和熒光發(fā)射。

Liu 等[63]通過(guò)雙硼酸酯鍵將抗癌藥5′-DFUR 和半菁光敏劑（NPS）共價(jià)連接，開(kāi)發(fā)了一種H2O2響應(yīng)的近紅外前藥PNPS，用于近紅外熒光成像和化療協(xié)同光動(dòng)力治療[圖6(a)]。在正常組織中，原光敏劑母體的羥基被苯硼酸基團(tuán)取代，ICT 過(guò)程被抑制，從而降低PNPS 的光毒性。在腫瘤組織中，過(guò)表達(dá)的H2O2可破壞雙硼酸酯基團(tuán)，釋放出光敏劑NPS 和化療藥5′-DFUR。在白光照射下，PNPS 對(duì)Hela 細(xì)胞的IC50值為9.32 μmol/L。然而，Hela 細(xì)胞存活率小于10%時(shí)所需要的PNPS 濃度高達(dá)30 μmol/L，治療效果較差，對(duì)正常組織的損傷很大。這可能是由于NPS中溴原子的取代位置不當(dāng)，重原子效應(yīng)弱，導(dǎo)致NPS的單線(xiàn)態(tài)氧量子產(chǎn)率較低。

本課題組[64]利用芐硝基干擾半菁染料的ICT 過(guò)程，合成了一種缺氧激活的近紅外可激活光敏劑ICy-N[圖6(b)]。ICy-N 的母體結(jié)構(gòu)與PNPS 相同。不同的是，通過(guò)將碘原子引入吲哚環(huán)，改善了ICy-N的系間竄越過(guò)程，從而提高了ICy-N 的單線(xiàn)態(tài)氧量子產(chǎn)率。由于引入了硝基還原酶識(shí)別基團(tuán)（芐硝基），ICy-N 的ICT過(guò)程被抑制，大大降低了ICy-N 對(duì)正常組織的光毒性。傳統(tǒng)的菁染料斯托克斯位移較小[65]。但I(xiàn)Cy-N 的最大吸收波長(zhǎng)位于660 nm 處，最大發(fā)射波長(zhǎng)位于710 nm 處，具有較大的斯托克斯位移。在腫瘤組織中，過(guò)表達(dá)的硝基還原酶將ICy-N 轉(zhuǎn)化為ICy-OH，ICT 過(guò)程恢復(fù)。在乏氧條件下（10% O2），經(jīng)光源（660 nm，12 mW/cm2）照射后，ICy-OH 可高效產(chǎn)生單線(xiàn)態(tài)氧殺傷腫瘤，IC50值僅為0.63 μmol/L。

圖6 PNPS、ICy-N、APN-CyI和ALPPS的猝滅機(jī)理示意圖Fig.6 Schematic illustration of the quenching method of PNPS,ICy-N,APN-CyI and ALPPS

隨后，本課題組[66]將氨基肽酶N（APN）響應(yīng)基團(tuán)引入半菁染料CyI-OH中，制備了APN激活的近紅外可激活光敏劑APN-CyI[圖6(c)]。使用2 μmol/L 的APN-CyI 進(jìn)行治療，在光源（660 nm，20 mW/cm2，20 min）照射下，癌細(xì)胞存活率僅為15%，而正常細(xì)胞存活率為70%，進(jìn)一步降低了可激活光敏劑對(duì)正常組織的光毒性。

Zhai 等[67]開(kāi)發(fā)了一種高效的長(zhǎng)波長(zhǎng)D-π-A 光敏劑PSSe-I，并使用磷酸酯基團(tuán)將光敏劑PSSe-I磷酸化，制備了徹底猝滅型可激活光敏劑ALPPS[圖6(d)]。PSSe-I的pKa值為5.78，適用于生理pH 環(huán)境。ALPPS 的ICT 過(guò)程被抑制，導(dǎo)致ALPPS 在可見(jiàn)光處的吸收徹底消失，光活性被徹底抑制。在腫瘤組織中，過(guò)表達(dá)的堿性磷酸酶將磷酸酯基團(tuán)切斷，ALPPS 轉(zhuǎn)化為PSSe-I，ICT 過(guò)程恢復(fù)，光活性得以恢復(fù)。PSSe-I的最大吸收波長(zhǎng)位于616 nm 處。使用5 μmol/LALPPS 處理Hela 細(xì)胞并在氙氣燈（490～700 nm，10 mW/cm2，10 min）的照射下，Hela 細(xì)胞存活率小于13%。由于A(yíng)LPPS的光活性被徹底猝滅，ALPPS對(duì)正常細(xì)胞的損傷極低，表現(xiàn)出徹底猝滅型可激活光敏劑的優(yōu)勢(shì)。

4.3 基于羅丹明衍生物分子內(nèi)螺環(huán)化猝滅

大部分的可激活光敏劑設(shè)計(jì)策略是通過(guò)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程或者抑制分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)。然而，通過(guò)這兩種策略難以徹底猝滅可激活光敏劑的基底活性氧，而少量的活性氧足以對(duì)正常組織造成破壞。因此，如何徹底抑制可激活光敏劑在正常組織中的光毒性是研究的重點(diǎn)。羅丹明衍生物處于閉環(huán)狀態(tài)時(shí)無(wú)光活性，能夠?qū)崿F(xiàn)可激活光敏劑基底活性氧的徹底猝滅[68]。當(dāng)螺環(huán)一旦被打開(kāi)，羅丹明即可恢復(fù)光活性。

Lv 等[69]報(bào)道了一種羅丹明類(lèi)可激活光敏劑Se-NR-Az[圖7(a)]。Se-NR-Az 沒(méi)有光毒性，其基底活性氧能夠被徹底猝滅。當(dāng)Se-NR-Az 與外源性三苯基膦（TPP）發(fā)生Staudinger 反應(yīng)后[70-72]，Se-NR-Az 會(huì)轉(zhuǎn)化為具有光毒性的光敏劑Se-NR。將Hela 細(xì)胞與Se-NR-Az 和200 μmol/L 三苯基膦共孵育，并使用光源（610 nm，6 J/cm2）照射，Se-NR-Az 的IC50值僅為0.205 μmol/L。但是，Se-NR-Az 進(jìn)行光動(dòng)力治療時(shí)需要外加非細(xì)胞內(nèi)源性的三苯基膦，無(wú)法控制Se-NR-Az 在正常細(xì)胞中不與三苯基膦發(fā)生反應(yīng)轉(zhuǎn)化為Se-NR，腫瘤選擇性較差。

圖7 羅丹明類(lèi)可激活光敏劑激活機(jī)理示意圖Fig.7 Schematic illustration of the activation method of rhodamine-based activatable photosensitizers

Urano 課題組[73]將β-半乳糖苷引入羅丹明母體，合成了一例β-半乳糖苷酶激活的光敏劑HMDESeR-βGal。HMDESeR-βGal 無(wú)光活性，單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生被徹底猝滅。在β-半乳糖苷酶過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，HMDESeR-βGal與β-半乳糖苷酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化為HMDESeR，恢復(fù)其在可見(jiàn)光處的吸收和單線(xiàn)態(tài)氧產(chǎn)生能力，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

隨后，Urano 課題組[74]報(bào)道了另一例γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）響應(yīng)的羅丹明類(lèi)可激活光敏劑gGlu-HMSeR[圖7(b)]。在正常組織中，gGlu-HMSeR 無(wú)光活性，其在可見(jiàn)光處的吸收被徹底猝滅，從而徹底猝滅了其單線(xiàn)態(tài)氧的產(chǎn)生。在帶有腫瘤的雞絨膜尿囊膜模型中，gGlu-HMSeR 會(huì)被過(guò)表達(dá)的GGT 特異性裂解開(kāi)環(huán)轉(zhuǎn)化為具有光毒性的光敏劑HMSeR，選擇性殺傷腫瘤而不損害周?chē)慕】到M織。gGlu-HMSeR 的最大吸收波長(zhǎng)位于532 nm 處。使用10 μmol/L 的gGlu-HMSeR 與SHIN3 細(xì)胞（人卵巢癌細(xì)胞）共孵育，經(jīng)過(guò)光源（510～550 nm，50 mW/cm2，1 min）照射后，SHIN3細(xì)胞存活率小于20%。

綜上所述，雖然基于羅丹明類(lèi)螺環(huán)化的可激活光敏劑，在閉環(huán)狀態(tài)下能夠徹底猝滅其基底活性氧，但是，以羅丹明為母體的光敏劑最大吸收波長(zhǎng)較短，通常＜600 nm，組織穿透深度低，無(wú)法對(duì)深層腫瘤進(jìn)行殺傷。因此，開(kāi)發(fā)近紅外光激發(fā)的、徹底猝滅型可激活光敏劑至關(guān)重要且面臨巨大挑戰(zhàn)。

5 結(jié) 論

構(gòu)建靶標(biāo)型光敏劑和可激活型光敏劑能夠有效地提高光敏劑的腫瘤靶向性，極大地降低光動(dòng)力治療的毒副作用。但在臨床治療中，光動(dòng)力治療仍面臨許多挑戰(zhàn)。以下幾個(gè)方面的問(wèn)題在未來(lái)應(yīng)予以解決。

（1）目前大多數(shù)的光動(dòng)力治療均基于Ⅱ型機(jī)理，對(duì)腫瘤內(nèi)氧氣濃度具有很大的依賴(lài)。因此，開(kāi)發(fā)基于I型機(jī)理的可激活光敏劑具有重要意義。

（2）光敏劑是否具有極低的暗毒性，能否在體內(nèi)循環(huán)中盡可能少地富集在正常組織和主要器官中，是其能否用于臨床治療的關(guān)鍵因素。在熒光染料中引入重原子是設(shè)計(jì)光敏劑的主要方法之一，但重原子會(huì)使分子的暗毒性增加。因此，開(kāi)發(fā)無(wú)重原子、長(zhǎng)三線(xiàn)態(tài)壽命的光敏染料是研究的重點(diǎn)。

（3）近年來(lái)，光熱治療、免疫治療等治療方法迅速發(fā)展。將光動(dòng)力治療與光熱治療、免疫治療進(jìn)行協(xié)同治療，能夠發(fā)揮多重治療效果，有利于推動(dòng)光動(dòng)力治療的發(fā)展。