血清白蛋白-銅酞菁納米粒子用于線粒體靶向光療

于富強(qiáng)，杜健軍，2，路楊，馬賀，樊江莉，2，孫文，2，龍颯然，2，彭孝軍

（1 大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116024； 2 大連理工大學(xué)寧波研究院，浙江寧波315016）

引 言

光動力治療，作為一種新型腫瘤治療方法，可與傳統(tǒng)治療方法(如化療、放療和手術(shù))優(yōu)勢互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療腫瘤的效果。光動力治療主要是利用光敏劑在光照條件下通過能量或電子轉(zhuǎn)移等方式與周圍氧氣、溶劑等小分子反應(yīng)產(chǎn)生有毒的活性氧物種(reactive oxygen species,ROS)，從而殺死腫瘤細(xì)胞。由于腫瘤細(xì)胞的惡性繁殖，大量消耗氧氣，實(shí)體腫瘤內(nèi)部的乏氧環(huán)境嚴(yán)重影響了光動力治療、化療及放療的治療效果[1-2]。同為光療策略，光熱治療的原理是基于小分子的光熱轉(zhuǎn)換能力，將光能轉(zhuǎn)化為熱能，通過提升局部微環(huán)境的溫度殺死腫瘤細(xì)胞[3]。由于光熱治療不依賴于氧氣，且同為光激發(fā)治療方法，因此常和光動力治療聯(lián)合使用[4]。目前，各類無機(jī)或無機(jī)-有機(jī)雜化材料被開發(fā)用于光動力-光熱聯(lián)合治療[5-7]，如金納米粒子[8]、碳納米管[9]、二氧化鈦[10]等。但上述無機(jī)材料的生物相容性及其生物代謝成為阻礙其臨床應(yīng)用的障礙。然而，多數(shù)文獻(xiàn)中報(bào)道的光療小分子大多只具備單一的光熱治療或光動力治療能力[3]。近期，研究發(fā)現(xiàn)Cy7菁染料同時具備光動力與光熱治療效果，但其光、熱穩(wěn)定性需要極大提升以滿足臨床應(yīng)用[11]。因此，開發(fā)具有良好生物相容性及光熱穩(wěn)定性的功能染料分子是實(shí)現(xiàn)光熱-光動力聯(lián)合治療的有效途徑。

酞菁類化合物具有吸收波長長(λmax＞660 nm)、消光系數(shù)高(εmax＞105L·mol-1·cm-1)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于太陽能電池、傳感器和催化等領(lǐng)域[12]。研究發(fā)現(xiàn)，鋅酞菁可以作為一種光敏劑，用于光動力治療[13-15]。Li 等[16]報(bào)道了通過超分子自組裝的方法，即直接用抗癌藥物米托蒽醌和鋅酞菁光敏劑組裝成納米結(jié)構(gòu)，該納米結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出核酸響應(yīng)分解的能力，能夠用于腫瘤成像，并顯著提高了抗癌效果。Li等[17]報(bào)道了銅酞菁(CuPc)可用于光熱治療，可有效地避免因腫瘤缺氧而導(dǎo)致治療效果下降的情況。Jiang等[18]報(bào)道了石墨烯作為CuPc的載體，有效增加了其光熱治療效果。藥物輸送系統(tǒng)能夠有效地增加循環(huán)時間并且能夠在病變部位釋放藥物[19-21]，不僅可以應(yīng)用于化療藥物[22-23]、基因藥物的輸送[24]，還適用于光熱治療[25]與光動力治療[26-27]試劑的輸送。血清白蛋白是血液中最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，在血液循環(huán)中具有良好的穩(wěn)定性，是構(gòu)建納米藥物輸送系統(tǒng)最合適的原料之一[28]。小分子藥物與蛋白質(zhì)相互作用時一般存在以下幾種作用力：(1)小分子藥物進(jìn)入血清白蛋白質(zhì)大分子的空腔中，藥物的疏水基團(tuán)與血清白蛋白質(zhì)疏水空腔的疏水作用；(2)藥物與血清白蛋白超分子化合物形成過程中產(chǎn)生的氫鍵作用和范德華力；(3)藥物所帶的電荷與血清白蛋白所含電荷存在靜電作用[29]。血清白蛋白不但可以增加體系的生物相容性，還可以有效地?cái)y帶藥物穿透細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，作用于細(xì)胞核或各種亞細(xì)胞器[30-31]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS 的主要來源，在基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞氧化應(yīng)激等細(xì)胞活動中都有著重要的調(diào)控作用?；蛲蛔?、代謝異常等會引起線粒體功能障礙從而導(dǎo)致ROS 的聚集，進(jìn)而使線粒體結(jié)構(gòu)損傷、代謝異常，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞具有快速增殖的特點(diǎn)，致癌基因的活化會使線粒體為其代謝活動提供足夠的能量。靶向線粒體的治療策略會影響線粒體的相關(guān)代謝活動，進(jìn)而對細(xì)胞造成損傷[32]。

圖1 用于線粒體靶向光療的血清白蛋白-銅酞菁(LGSCuPc-BSA)納米粒子的制備及光療過程Fig.1 Schematic illustration of preparation of LGS-CuPc-BSA NPs for mitochondrial targeted phototherapy

綜上，如圖1，本文利用牛血清白蛋白(BSA)與β位磺酸二取代的銅酞菁染料直接藍(lán)86(LGS-CuPc)自組裝，制備了LGS-CuPc-BSA 納米粒子。結(jié)果表明，在671 nm 光源激發(fā)下，LGS-CuPc-BSA 表現(xiàn)出明顯光動力效果，其ROS 產(chǎn)率約為23.3%；同時，LGS-CuPc-BSA 展現(xiàn)出其固有光熱治療效果(光熱轉(zhuǎn)換效率為36.8%)。測試結(jié)果表明，BSA 不僅能夠增加體系的生物相容性，還可以提升光熱效果以及增加ROS 產(chǎn)率。經(jīng)BSA 負(fù)載的LGS-CuPc 納米粒子具有很好的穩(wěn)定性和較低的生物毒性，能夠穿透細(xì)胞膜定位于腫瘤細(xì)胞線粒體，為光動力-光熱聯(lián)合靶向治療腫瘤提供了一種有效的方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

牛血清白蛋白(BSA)；直接藍(lán)86(LGS-CuPc，C.I.Direct Blue86，購于上海染料研究所有限公司，結(jié)構(gòu)如圖A1)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)；1,3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)；亞甲基藍(lán)(MB)；鋅酞菁(ZnPc)；培養(yǎng)基(DMEM)；消化酶(EDTA)；噻唑藍(lán)(MTT)；鈣黃素(AM)；碘 化 丙 啶(PI)；Mito-Tracker Green；ROS 試 劑 盒(DCFH-DA); Hoechst33324；無水甲醇；實(shí)驗(yàn)所用的去離子水均來自milli-Q 系統(tǒng)。人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所(IBMS)購買。

1.2 分析測試儀器

Cary60紫外可見分光光度計(jì)(美國Aglien公司)；HT7700 EXALENS 透射電子顯微鏡(日本日立公司)；ZS90 型納米粒徑/Zeta 電位分析儀；FV1000-IX81 共 聚 焦 熒 光 顯 微 鏡(日 本Olympus 公 司)；Thermo VarioskanTMLUX 多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)；小動物活體成像系統(tǒng)(NightOWL ⅡLB983)。

1.3 LGS-CuPc-BSA NPs的制備

將2 mg 的LGS- CuPc 分散在1 ml 甲醇中，將LGS-CuPc 甲醇溶液(1 ml)與BSA(30 mg)水溶液(11 ml)室溫?cái)嚢?2 h，然后用透析法透析除去游離的染料分子，離心后冷凍干燥得到LGS-CuPc-BSA 納米粒子。

1.4 LGS-CuPc-BSA NPs的表征

采用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行吸收測試，使用透射電子顯微鏡對納米粒子進(jìn)行形貌分析以及粒徑檢測，采用納米粒徑/Zeta 電位分析儀進(jìn)行粒徑大小和電位測試以及穩(wěn)定性測試。

1.5 LGS-CuPc-BSA NPs 的包封率以及載藥率的測定

首先測定不同濃度LGS-CuPc在DMF中的標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線，將5 μg LGS-CuPc-BSA NPs 分散在10 ml含有1 mg·ml-1胰蛋白酶溶液，37℃攪拌過夜。上層清液過濾，用紫外可見分光光度法測定在671 nm 處的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線計(jì)算濾液的濃度C0，載藥率和包封率計(jì)算如式(1)～式(2)[33-34]：

式中，C是LGS-CuPc濃度，μg·ml-1；C0是濾液中LGS-CuPc 濃度，μg·ml-1；V 是溶液體積，ml；MCuPc是LGS-CuPc總質(zhì)量，μg；MBSA是BSA總質(zhì)量，μg。

1.6 活性氧的檢測

采用活性氧響應(yīng)探針DPBF 評價LGS-CuPc-BSA NPs 的ROS 生成能力，MB 作為標(biāo)準(zhǔn)光敏劑，在DMF 中ROS 產(chǎn)率為0.52。將DPBF(30 μmol·L-1)與含LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs DMF 溶 液 混合，混合溶液在波長671 nm 光功率密度為2 mW·cm-2光照射每10 s 一次，在照射過程中記錄不同時間的吸收變化。此外，還記錄了DPBF 和LGS-CuPc以及LGS-CuPc-BSA NPs 溶液的吸收光譜變化。LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 的ROS 產(chǎn)率ΦΔ計(jì)算公式如式(3)[35]：

式中，Φ 是單線態(tài)量子產(chǎn)率；K 是DPBF 隨時間增加吸光度值逐漸減小的斜率；F 是吸光度校正因子(F=1～10-OD，OD 為光敏劑的吸光度值)；下角標(biāo)MB是標(biāo)準(zhǔn)光敏劑；PS是待測染料。

1.7 光熱轉(zhuǎn)換效率測試

用熱紅外攝像機(jī)實(shí)時記錄樣品的熱成像。LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 在PBS 中的濃度分別為20、30 和40 μmol·L-1，以PBS 作為對比，采用波長671 nm，功率為800 mW·cm-2的激光照射每1 min 記錄實(shí)時溫度，觀察溫度變化，共照射10 min。為評價LGS-CuPc-BSA NPs 的光熱穩(wěn)定性，記錄100 min 對應(yīng)的溫度變化，每個循環(huán)20 min，共五個循環(huán)，利用式(4)～式(6)計(jì)算光熱轉(zhuǎn)換效率：

式中，η 是光熱轉(zhuǎn)換效率；h 是傳熱系數(shù)；s 是容器光輻射表面積；Tmax是系統(tǒng)最高溫度，℃；Tsurr是環(huán)境溫度，℃；QDis是石英樣品池與水系統(tǒng)內(nèi)部產(chǎn)生的基準(zhǔn)能量，W；τ 是系統(tǒng)內(nèi)時間常量；I 是光照功率，W·cm-2；m 是 溶 液 質(zhì) 量，g；C 是 溶 液 比 熱 容，J·g-1·℃-1；Tmax,water是水的最高溫度，℃；Tsurr,water是水的環(huán)境溫度，℃；A671是溶液在671 nm波長處的吸光度。

1.8 MTT法測定細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將接種MCF-7 細(xì)胞(100 μl，1×105個/毫升)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h。用含有不同濃度染料的培養(yǎng)基替換，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用激光(800 mW·cm-2)照射10 min 后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含有5 mg·ml-1MTT (100 μl)的培養(yǎng)基替換并繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在觀察到有大量藍(lán)紫色的結(jié)晶生成后移走培養(yǎng)基，加入100 μl DMSO 后輕輕搖晃，用酶標(biāo)儀分別檢測570 nm和630 nm的吸光度值，依據(jù)式(7)計(jì)算細(xì)胞活性[36-37]：

式中，ODdye是染料分子孔的吸光度值；ODKdye是染料分子孔的空白吸光度值；ODblank是對照孔的吸光度值；ODKblank是對照孔空白吸光度值。

1.9 活死細(xì)胞染色成像實(shí)驗(yàn)

Calcein AM/PI 雙染試劑盒可以實(shí)現(xiàn)多活死細(xì)胞的標(biāo)記。將MCF-7 細(xì)胞在含2 ml 培養(yǎng)基的共聚焦皿中于37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后，800 mW·cm-2的激光照射10 min，同時加入2 μl Calcein AM 和PI 對細(xì)胞進(jìn)行染色處理30 min，在共聚焦顯微鏡下觀察熒光。

1.10 細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生成像實(shí)驗(yàn)

取100 μl 的MCF-7 細(xì)胞(1×105個/毫升)在含2 ml 培養(yǎng)基的共聚焦皿中培養(yǎng)24 h(37℃，5%CO2)，隨后加入負(fù)載熒光染料的LGS-CuPc-BSA NPs，孵育1 h。PBS 清洗3 次后加入2 ml 含有10 μmol·L-1的DCFH-DA 培養(yǎng)基溶液，孵育30 min 后，用PBS 清洗3 次，加入2 ml 培養(yǎng)基，再用671 nm 的激光照射10 min后進(jìn)行共聚焦成像。

1.11 細(xì)胞核染色

取100 μl 的MCF-7 細(xì)胞(1×105個/毫升)在含2 ml培養(yǎng)基的共聚焦皿中在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后，加入負(fù)載熒光染料的LGS-CuPc-BSA NPs(10 μmol·L-1)，孵育1 h 后用Hoechst33342 進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記，孵育10 min 后用PBS 清洗3 次后加入2 ml 培養(yǎng)基，最后進(jìn)行共聚焦成像。

1.12 線粒體共定位成像

取100 μl 的MCF-7 細(xì)胞(1×105個/毫升)在含2 ml 培養(yǎng)基的共聚焦皿中在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h 后，加入負(fù)載熒光染料的LGS-CuPc-BSA NPs，孵育1 h，之后選用商業(yè)化染料(Mito-Tracker Green，λex=488 nm，λem=510～560 nm)孵育30 min 后，用PBS清洗3 遍，加入新鮮的培養(yǎng)基。共聚焦進(jìn)行成像觀察，并且記錄熒光通道圖像，并進(jìn)行疊加檢測納米粒子的定位。

1.13 體內(nèi)熒光成像

Balb/c 雌性小鼠(雌6 周齡左右)購自大連醫(yī)科大學(xué)SPF 實(shí)驗(yàn)動物中心，動物實(shí)驗(yàn)是根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行的，該動物實(shí)驗(yàn)得到了大連理工大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

將5×106個/毫升細(xì)胞PBS 懸液進(jìn)行皮下注射，7 d后進(jìn)行體內(nèi)熒光成像。由于LGS-CuPc 沒有熒光，引入亞甲基藍(lán)(MB)構(gòu)建LGS-CuPc/MB-BSA NPs；另一方面，采用具有熒光信號的ZnPc 代替CuPc。通過腫瘤小鼠尾靜脈注射50 μl PBS配制的藥物，使用小動物成像儀進(jìn)行不同時間的體內(nèi)熒光成像，采用665 nm激發(fā)激光和700 nm發(fā)射濾光片。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 LGS-BSA-CuPc NPs的表征

對LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 進(jìn)行了紫外-可見吸收光譜的測試，如圖2(a)所示，CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 的最大吸收波長均為671 nm。BSA 的透射電鏡圖如圖A2所示，并沒有形成明確的納米結(jié)構(gòu)。LGS-CuPc 通過疏水作用、范德華力以及靜電作用與BSA 相結(jié)合[38-39]，如圖2(b)所示，LGSCuPc-BSA 體系呈現(xiàn)均勻分散的球形結(jié)構(gòu)(粒徑約55 nm)，證明LGS-CuPc與BSA自組裝形成了球形納米粒子。動態(tài)光散射(DLS)結(jié)果顯示LGS-CuPc-BSA NPs 的平均粒徑約為60 nm(圖A3)，這是由于LGS-CuPc-BSA NPs 與溶劑層結(jié)合的水化粒徑略大于TEM 測量的結(jié)果[40]。LGS-CuPc-BSA NPs 的zeta電位約為-9.8 mV，表面帶負(fù)電荷和較小的粒徑能夠使其增強(qiáng)通透性和在腫瘤部位積聚滯留的效應(yīng)(圖A4)[41]。如圖A5 所示，制備的LGS-CuPc-BSA NPs 具有良好的穩(wěn)定性，從而可以延長納米顆粒的循環(huán)時間。

圖2 LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs的吸收光譜(a)和LGS-CuPc-BSA NPs的透射電鏡圖(b)Fig.2 UV-vis absorption spectra of LGS-CuPc and LGS-CuPc-BSA NPs(a)and TEM image of LGS-CuPc-BSA NPs(b)

2.2 LGS-CuPc-BSA NPs載藥率與包封率的計(jì)算

LGS-CuPc-BSA NPs 的制備是將BSA 與LGSCuPc 混合，然后在純水中透析去除游離的LGSCuPc，離心后冷凍干燥后得到納米粒子?；贚GS-CuPc在671 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖A6，圖A7)，通過式(1)、式(2)計(jì)算LGS-CuPc-BSA NPs中LGS-CuPc的加載率為90.5%，包封率為5.8%。

2.3 LGS-CuPc與LGS-CuPc-BSA NPs 的光致活性氧產(chǎn)率的檢測

以亞甲基藍(lán)為參比，將DPBF(30 μmol·L-1)與LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 溶液分別混合，使用波長671 nm(2 mW·cm-2)的光照射。其中，亞甲基藍(lán)樣品每5 s 照射一次[圖3(a)]，LGS-CuPc-BSA NPs[圖3(b)]和LGS-CuPc[圖3(c)]每10 s 照射一次，DPBF在410 nm 處的吸光度隨時間增加而不斷下降，表明LGS-CuPc 和LGS-CuPc-BSA NPs 產(chǎn)生了ROS。通過式(3)計(jì)算，LGS-CuPc 的ROS 產(chǎn)率為18.5%，LGSCuPc-BSA NPs 為23.3%[圖3(d)]。LGS-CuPc 會以二聚體或多聚體的形式存在，導(dǎo)致其吸光程度減弱，進(jìn)而降低了ROS 的產(chǎn)率，而BSA 可以使其LGSCuPc 均勻分散，進(jìn)而增強(qiáng)對光的吸收，從而增加ROS 產(chǎn)率[17]。此外，帶有磺酸基的LGS-CuPc 與BSA的胺基的相互作用，導(dǎo)致系間竄躍效率增加，有利于ROS的產(chǎn)生[42]。

2.4 光熱轉(zhuǎn)換效率測試

為了測定LGS-CuPc-BSA NPs 的光熱轉(zhuǎn)換效率，用波長671 nm(800 mW·cm-2)激光照射10 min。如圖4(a)所示，和PBS 對比溶液比較，不同濃度的LGS-CuPc 溶液溫度升高明顯，表明LGS-CuPc 可以快速將近紅外光有效地轉(zhuǎn)換為熱能。如圖4(b)所示，在相同濃度的條件下，LGS-CuPc-BSA NPs 比LGS-CuPc 的溫度平均升高2℃左右，這是由于單純的LGS-CuPc 部分會以二聚體或多聚體的形式存在，導(dǎo)致其吸光程度有所減弱，進(jìn)而降低了光熱轉(zhuǎn)換效果；而BSA 的加入會使其分散均勻，展現(xiàn)良好的光熱效果[17]。如圖4(c)所示，LGS-CuPc-BSA NPs在5次循環(huán)周期下還具有很好的光熱穩(wěn)定性。通過式(4)～式(6)和圖4(d)計(jì)算其光熱轉(zhuǎn)換效率為36.8%，高于文獻(xiàn)中已報(bào)道的無機(jī)納米結(jié)構(gòu)[43]，如Cu2-xSe(22%)和Cu3BiS3(27.4%)等[44]。因此，LGS-CuPc-BSA NPs的高光熱性能和優(yōu)異的光穩(wěn)定性使其可以作為治療癌癥的光熱試劑。

2.5 LGS-CuPc與LGS-CuPc-BSA NPs 的細(xì)胞毒性研究

選用MCF-7細(xì)胞作為研究對象，采用相同濃度梯度的LGS-CuPc 與LGS-CuPc-BSA NPs 進(jìn)行細(xì)胞毒性評價，測試結(jié)果如圖5(a)、(b)所示，在不同濃度(0～32 μmol·L-1)的LGS-CuPc-BSA NPs 與LGS-CuPc孵育下，細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的毒性(細(xì)胞存活率＞90%)。經(jīng)波長671 nm，功率為800 mW·cm-2光照射10 min后，LGS-CuPc-BSA NPs 與LGS-CuPc 對細(xì)胞都造成了明顯的殺傷，且LGS-CuPc-BSA NPs 對細(xì)胞損傷的效果明顯優(yōu)于LGS-CuPc。通過鈣黃素(calcein-AM，綠色)和碘化丙啶(PI，紅色)的細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了光照后細(xì)胞的凋亡。如圖6所示，LGS-CuPc 組細(xì)胞在未經(jīng)激光照射時細(xì)胞正常存活，而經(jīng)激光照射后的細(xì)胞則表現(xiàn)出紅色熒光和部分綠色熒光，說明部分細(xì)胞死亡。LGS-CuPc-BSA NPs組細(xì)胞在未經(jīng)激光照射時細(xì)胞幾乎未死亡(綠色熒光)；而經(jīng)激光照射后，視野內(nèi)細(xì)胞均表現(xiàn)出均勻的紅色熒光，證明細(xì)胞完全死亡，表明LGSCuPc與BSA 自組裝后能夠顯著地提升其治療效果，與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 在DMF中DPBF檢測MB(a)、LGS-CuPc(b)、LGS-CuPc-BSA NPs(c)體系ROS的產(chǎn)生；MB、LGS-CuPc和LGS-CuPc-BSA NPs的時間與吸收的線性關(guān)系(d)Fig.3 Singlet-oxygen generation of MB(a),LGS-CuPc(b),LGS-CuPc-BSA NPs(c)in DMF with DPBF,and the linear relationship between time and absorption of MB,LGS-CuPc,and LGS-CuPc-BSA NPs(d)

2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧熒光成像

為了驗(yàn)證LGS-CuPc-BSA NPs 的光動力治療機(jī)理，使用DCFH-DA(商業(yè)化的ROS 捕獲劑)，跟蹤光動力治療過程中的ROS 產(chǎn)生。如圖7 所示，在671 nm 光照射下，發(fā)現(xiàn)DCF 有強(qiáng)烈的熒光，表明LGSCuPc-BSA NPs作為一種有效的光敏劑，在光的照射下能在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS。

2.7 細(xì)胞核染色與線粒體共定位成像

將近紅外熒光染料共同負(fù)載于LGS-CuPc-BSA NPs中，在MCF-7細(xì)胞中培養(yǎng)2 h。共聚焦成像如圖8所示，LGS-CuPc-BSA NPs的熒光主要分布于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，表明納米粒子有著良好的生物相容性和快速進(jìn)入細(xì)胞的能力，并且發(fā)現(xiàn)納米粒子不定位于細(xì)胞核。

線粒體是細(xì)胞生產(chǎn)ATP 的主要場所，一旦線粒體遭到破壞將導(dǎo)致整個細(xì)胞的凋亡[45-48]。為了驗(yàn)證LGS-CuPc-BSA NPs 的定位能力，選取商業(yè)化染料Mito-Tracker Green 與LGS-CuPc-BSA NPs 在MCF-7 細(xì)胞中共同孵育。如圖9 所示，綠色通道采集到的Mito-Tracker Green 染料信號與紅色通道LGSCuPc-BSA NPs的熒光信號有很好的疊加，共定位系數(shù)為0.86，表明LGS-CuPc-BSA NPs 進(jìn)入細(xì)胞后主要分布于細(xì)胞的線粒體中。由細(xì)胞熒光成像和線粒體共定位成像表明BSA 能夠有效地提升LGSCuPc 的生物相容性和促進(jìn)其穿透細(xì)胞膜的能力，并靶向線粒體中，經(jīng)光激發(fā)破壞線粒體進(jìn)而使整個細(xì)胞凋亡。

圖4 光照(671 nm，800 mW·cm-2)不同濃度的LGS-CuPc(a)和LGS-CuPc-BSA NPs(b)的光熱曲線溫度變化，LGS-CuPc-BSA NPs五個循環(huán)的溫度變化(每個循環(huán)20 min)(c)和τ值的計(jì)算曲線(d)Fig.4 Photothermal heating curves for the change of temperature with time in different concentrations (20,30,and 40 μmol·L-1)of LGS-CuPc(a),LGS-CuPc-BSA NPs irradiated by 671 nm laser(800 mW·cm-2)(b).The temperature variations of LGS-CuPc-BSA NPs for 5 cycles(20 min per cycle)(c).Calculation of τ value(d)

圖5 在671 nm(800 mW·cm-2)激光照射10 min下經(jīng)不同濃度的LGS-CuPc-BSA NPs(a)和LGS-CuPc(b)處理的細(xì)胞活性Fig.5 Cell viabilities after treatments with different concentrations of LGS-CuPc-BSA NPs (a)and LGS-CuPc(b)with and without 671 nm(800 mW·cm-2)laser irradiation for 10 min

圖7 在MCF-7細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生Fig.7 ROS generation in MCF-7 cells

2.8 小鼠體內(nèi)熒光成像

靜脈給藥后隨著時間的延長(圖A8)，LGSCuPc/MB-BSA NPs 在腫瘤部位的富集逐漸提高，且熒光強(qiáng)度在24 h 達(dá)到最大，隨后逐漸減少，在72 h后依然有少量富集，說明LGS-CuPc-BSA NPs 在小鼠體內(nèi)具有很好的靶向效果及保留效率。相反，ZnPc(代替CuPc)在4 h腫瘤處的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，24 h后只有少量保留。同時小鼠不同器官有大量的染料分子富集，說明染料分子的靶向效果與保留效率不足，且在小鼠體內(nèi)的循環(huán)時間明顯短于納米粒子的循環(huán)時間。

3 結(jié) 論

(1)通過LGS-CuPc 和BSA 自組裝構(gòu)建得到LGS-CuPc-BSA NPs 納米顆粒，LGS-CuPc-BSA NPs在PBS緩沖溶液中分布均勻，平均粒徑約為60 nm。

(2)實(shí)驗(yàn)證明LGS-CuPc-BSA NPs 具有光動力和光熱治療效果，且LGS-CuPc-BSA 的ROS 產(chǎn)率和光熱效果均高于LGS-CuPc。這是由于BSA 的加入可以抑制LGS-CuPc 自身的聚集，從而增加對光的吸收程度及利用。

(3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明LGS-CuPc-BSA NPs 具有較低的細(xì)胞毒性和良好的光療效果，并且在體內(nèi)循環(huán)時間可以達(dá)到72 h。共定位實(shí)驗(yàn)證明該納米粒子能夠穿透細(xì)胞膜并且定位于細(xì)胞線粒體中，通過使線粒體凋亡進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

圖8 Hoechst33342和LGS-CuPc-BSA NPs在MCF-7細(xì)胞中的熒光共聚焦成像Fig.8 Confocal fluorescence images of Hoechst33342 and LGS-CuPc-BSA NPs in MCF-7 cells

圖9 LGS-CuPc-BSA NPs與Mito-Tracker Green共定位成像Fig.9 Co-localization imaging of LGS-CuPc-BSA NPs and Mito-Tracker Green in MCF-7 cells

(4)提供了一種光動與光熱聯(lián)合治療的方法，為腫瘤治療提供了一種有應(yīng)用前景的光療染料。