聚乙二醇二羧基醚合成工藝優(yōu)化

張用芳,米玉偉,劉 敏,,曾涑源,孫德志

(1.聊城大學(xué) 生物制藥研究院，山東 聊城 252059；2.聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252059)

0 引言

水溶性聚合物修飾劑聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，又名α-氫-ω-羥基(氧-1，2-乙二基)聚合物、聚氧化乙烯(PEO-LS)，是平均分子量在200-6000 u的乙二醇高聚物的總稱(chēng)，其結(jié)構(gòu)式為HO(CH2CH2O)nH.隨著平均分子量的增加，其外觀逐漸從無(wú)色無(wú)臭粘稠液體轉(zhuǎn)變?yōu)橄灎罟腆w，分子量200-600 u者常溫下是液體，分子量在600 u以上者就逐漸變?yōu)榘牍腆w狀，分子量1000 u以上為固體，其吸濕能力相應(yīng)降低。工業(yè)上，一般采用乙二醇在高溫高壓下聚合、環(huán)氧乙烷與水/乙二醇逐步加成聚合合成。

PEG是非離子型水溶性聚合物，PEG及其系列產(chǎn)品無(wú)毒、無(wú)刺激性，具有良好的兩親性，易溶于水和乙醇、氯仿、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氧六環(huán)等絕大多數(shù)有機(jī)溶劑，對(duì)熱、酸、堿穩(wěn)定，常用作藥物賦形劑、增塑劑、乳化劑及潤(rùn)濕劑等[1-6]。PEG是美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的幾種可用于藥用合成的聚合物之一，PEG具有生物相容性良好、免疫原性低、對(duì)人體刺激不明顯等優(yōu)點(diǎn)[2，3，6-8]，而且可以通過(guò)腎臟排出體外，在體內(nèi)無(wú)積累[9，10]。

藥物的PEG修飾是將活化的PEG經(jīng)由化學(xué)方法偶聯(lián)到藥物上的過(guò)程，即PEG化(PEGylation)。活化的PEG常用來(lái)修飾酶、多肽、蛋白質(zhì)[11-13]及小分子藥物(如喜樹(shù)堿、紫杉醇等[14-16])等非水溶性藥物，用以克服此類(lèi)藥物的諸多缺點(diǎn)，如不良物理化學(xué)性質(zhì)、半衰期短、穩(wěn)定性差和毒性高等，同時(shí)保持他們的治療效果。然而，由于PEG的端基羥基與其它基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)時(shí)，極容易破壞被修飾的藥物或其他物質(zhì)，一般需要先對(duì)其進(jìn)行活化?；罨腜EG能夠有效地改善藥效及藥物動(dòng)力學(xué)等特性，進(jìn)一步增加非水溶性藥物的臨床應(yīng)用范圍。

PEG的傳統(tǒng)活化方法有氰脲酞氯法、烷基化、?；?，以上方法具有毒性大、溫度高、反應(yīng)條件苛刻等缺點(diǎn)[17-19]。本研究采用丁二酸酐(SA)對(duì)PEG進(jìn)行活化，以低毒的DMF為溶劑，低溫合成了平均分子量約2200 u的聚乙二醇二羧基醚(PEG-biCOOH)。核磁共振氫譜、紅外光譜和質(zhì)譜測(cè)試結(jié)果表明，在催化劑(4-二甲氨基吡啶，DMAP)的作用下，開(kāi)環(huán)的SA與PEG端基羥基鍵合，成功合成目標(biāo)產(chǎn)物PEG-biCOOH，且PEG分子鏈本身未引入其它基團(tuán)，為其在非水溶性藥物的修飾、改性、制備藥物納米顆粒及合成前體藥物等研究打下了良好的基礎(chǔ)。此研究系統(tǒng)考察了合成聚乙二醇二羧基醚的影響因素，反應(yīng)溶劑為DMF時(shí)，探明其最優(yōu)反應(yīng)條件為PEG與SA的摩爾比1:2.8，反應(yīng)時(shí)間24 h，反應(yīng)溫度60 ℃，所得產(chǎn)品收率為97.8%，經(jīng)透析后收率為86.7%，高于文獻(xiàn)值[2].此研究為以PEG為醫(yī)藥中間體合成前體藥物等相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG，平均分子量2000 u)，丁二酸酐(Succinic anhydride，SA，分子量100 u)，二氧六環(huán)(Dioxane)，N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF)，甲苯(Methylbenzene)，鹽酸(Hydrochloric acid，HCl)，二氯甲烷(Dichloromethane，CH2Cl2)，乙醚(Ether)，均為國(guó)藥分析純?cè)噭?-二甲氨基吡啶(4-Dimethylaminopyridine，DMAP，純度99%)購(gòu)于Alfa Aesar試劑公司。所有試劑未經(jīng)進(jìn)一步提純。實(shí)驗(yàn)中使用的水為超純水，其電阻率≥18.2 MΩ，采用Ultra-Pure 型超純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)制備。

1.2 聚乙二醇二羧基醚的合成

稱(chēng)取2 mmol PEG(4 g)和一定量的SA(4.4-8.4 mmol)，溶于30 mL不同溶劑(分別是DMF、甲苯、二氧六環(huán))中，再加入一定量的DMAP(用量與SA相同)，于氮?dú)夥諊?，混合物反?yīng)不同的溫度(25-100 ℃)和時(shí)間(3-48 h)。反應(yīng)完成后，加入20 mL水，用5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.5，用二氯甲烷萃取三次(50 mL/次)，濃縮后加入過(guò)量的乙醚，使產(chǎn)物沉淀，將粗產(chǎn)物溶于少量水，之后用三次水透析(透析袋截留分子量1000 u)兩天，除水濃縮后進(jìn)行冷凍干燥(12 h)，最終得白色絮狀粉末，4 ℃下儲(chǔ)存[20-24]。

實(shí)驗(yàn)得出的聚乙二醇二羧基醚(PEG-biCOOH)的最優(yōu)反應(yīng)條件為：以DMF為溶劑，PEG與SA(5.6 mmol)的摩爾比為1:2.8，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為24 h，此條件下得到的產(chǎn)品記為S1。具體反應(yīng)條件和產(chǎn)品編號(hào)列于表1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3次，取平均值反應(yīng)方程式如：

1.3 表征

以氘代DMSO-d6為溶劑，采用400 MHz核磁共振譜儀(Bruker，Mercury plus 400 MHz spectrometer)測(cè)試所得樣品的1H-NMR；用VECTOR 22型紅外光譜儀(Bruker AXS Co.，Ltd.，Germany)測(cè)試樣品的紅外光譜，KBr壓片，波段為4000-400 cm-1；樣品的質(zhì)譜是在Bruker MALDI-TOF(基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間)質(zhì)譜儀(Billerica，MA，USA)上進(jìn)行的。

2 結(jié)果與討論

2.1 核磁共振氫譜分析

反應(yīng)原料PEG、SA和產(chǎn)品S1的核磁共振氫譜測(cè)試采用氘代DMSO-d6作溶劑，結(jié)果如圖1所示。溶劑峰位于2.50 ppm處，0 ppm為內(nèi)標(biāo)TMS(四甲基硅烷)的化學(xué)位移。在圖1(a)中，PEG的1H-NMR峰歸屬如下：a處，δ3.36-3.69 ppm(4H，m，-CH2-CH2-)；b處，δ4.55 ppm(1H，t，-OH)；在圖1(b)中，c處為SA的化學(xué)位移(2.85 ppm)；在圖1(c)中，PEG-biCOOH的1H-NMR峰歸屬如下：e處δ3.43-4.15 ppm(nH，m，PEG中-CH2-CH2-)；d處，δ2.41-2.58 ppm(nH，s,-CH2-CH2-)；f處，δ12.1 ppm(1H，s,-COOH)。DMSO的溶劑殘留峰與PEG-biCOOH的d處峰有所重疊，化學(xué)位移為12.1 ppm是羧基的特征峰。圖1(c)中的d、f峰的出現(xiàn)表明開(kāi)環(huán)的丁二酸酐已經(jīng)接在PEG兩端[21，25，26]，樣品經(jīng)乙醚沉淀、二氯甲烷萃取及三次水透析后無(wú)其他雜質(zhì)。

圖1 (a)PEG、(b)SA和(c)PEG-biCOOH產(chǎn)品S1的核磁共振氫譜

2.2 紅外光譜分析

PEG和S1的紅外光譜如圖2所示。其中，3430 cm-1處的寬吸收峰是由水中的羥基峰伸縮振動(dòng)引起的。對(duì)于PEG，2888 cm-1處為-CH2-的對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰；1467 cm-1處的中強(qiáng)吸收峰為-CH2-的變形振動(dòng)峰；-CO-C-的伸縮振動(dòng)峰在1109 cm-1處；1342、1280、962和842 cm-1處表示C-C骨架伸縮振動(dòng)峰及-C-H-的變形振動(dòng)峰。對(duì)于PEG-biCOOH，PEG本身的振動(dòng)峰都與之相同，-CO的伸縮振動(dòng)峰在1732 cm-1處[25，27]，為酯的特征吸收峰，而PEG本身沒(méi)有此峰，這證明了丁二酸酐與PEG端基羥基鍵合成功。

圖2 PEG及產(chǎn)品S1的紅外光譜圖

2.3 MALDI-TOF質(zhì)譜分析

采用MALDI-TOF質(zhì)譜法測(cè)定了PEG和產(chǎn)品S1的分子量(圖3)。如圖所示，PEG和PEG-biCOOH的平均分子量分別為2000-2206 u。且PEG-biCOOH的分子量與理論值一致(～2200)，表明丁二酸酐與聚乙二醇兩端均被鍵合。

圖3 PEG及產(chǎn)品S1的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖

2.4 不同溶劑對(duì)聚乙二醇與丁二酸酐反應(yīng)的收率的影響

活化PEG常用的溶劑有DMF、甲苯和二氧六環(huán)[20，21，23]。為考察不同溶劑對(duì)PEG-biCOOH收率的影響，分別用二氧六環(huán)和甲苯替代DMF作為反應(yīng)溶劑，其他條件與S1合成條件一致，編號(hào)為S2和S3。如表1所示，S1和S2透析前后的平均收率(97.5、86.7%和94.6、85.1%)相差不大，明顯高于S3(87.8、80.6%)。另外，從溶劑毒性上考量，二氧六環(huán)對(duì)皮膚、眼部和呼吸系統(tǒng)均有刺激性，并且可能對(duì)肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，急性中毒時(shí)可能導(dǎo)致死亡；甲苯對(duì)皮膚、粘膜有刺激性，高濃度氣體對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用。鑒于甲苯和二氧六環(huán)做溶劑危險(xiǎn)性較大，而DMF無(wú)色、價(jià)格較低、沸點(diǎn)較高(153 ℃)不易揮發(fā)，毒性低，且收率高，故選擇DMF為反應(yīng)溶劑。

2.5 反應(yīng)摩爾比對(duì)收率的影響

改變反應(yīng)中加入的SA摩爾量，保持其他條件和S1一致，考察一系列PEG與SA的反應(yīng)摩爾比對(duì)產(chǎn)品收率的影響。加入SA的量為4.4、4.8、5.2、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0和8.4 mmol時(shí)，對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品編號(hào)分別為S4-S13，與S1(SA的摩爾量為5.6 mmol)作比較，結(jié)果如圖4所示。隨著加入的SA摩爾量的增加，透析后PEG-biCOOH的收率逐漸增加；當(dāng)SA增加到5.6 mmol時(shí)(產(chǎn)品S1)，PEG與SA的反應(yīng)摩爾比為1:2.8，收率達(dá)到峰值，為86.7%；然后，隨著SA的量的繼續(xù)增加，收率逐漸下降至67.2%(產(chǎn)品S14)。各產(chǎn)品透析前收率列于表1，與圖3趨勢(shì)一致。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著SA濃度的增加，反應(yīng)物混合溶液的顏色也出現(xiàn)了相應(yīng)的變化：S4-S10號(hào)反應(yīng)溶液為淺黃色，S11-S13號(hào)反應(yīng)溶液為深黃色，S14號(hào)反應(yīng)溶液則開(kāi)始變?yōu)榫萍t色，收率急劇下降。經(jīng)純化，所得樣品均為白色絮狀粉末，其核磁共振氫譜和紅外光譜結(jié)果與最優(yōu)條件下所合成樣品一致。

2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)收率的影響

在PEG與SA的摩爾比為1:2.8，反應(yīng)溶劑為DMF，反應(yīng)溫度為60 ℃的條件下，考察了不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)品收率的影響。反應(yīng)時(shí)間分別為3、6、9、12、18、36和48 h時(shí)，樣品編號(hào)為S14-S20，與S1(反應(yīng)時(shí)間24 h)作對(duì)比，結(jié)果如圖5所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，透析后PEG-biCOOH的收率逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到24 h時(shí)(產(chǎn)品S1)，收率達(dá)到峰值，為86.7%；延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至36 h和48 h時(shí)，其產(chǎn)品收率基本不變，分別為～86.5(S19)，～86.6%(S20)。各產(chǎn)品透析前收率列于表1，透析前PEG-biCOOH的收率與圖4趨勢(shì)一致，說(shuō)明24 h即為此反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間。

表1 各產(chǎn)品的反應(yīng)條件及其收率

圖4 SA的摩爾量對(duì)透析后收率的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)透析后收率的影響

2.7 反應(yīng)溫度對(duì)收率的影響

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)透析后收率的影響

反應(yīng)溶劑為DMF，反應(yīng)時(shí)間為24 h，反應(yīng)摩爾比例PEG:SA為1:2.8時(shí)，考察了不同反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)品收率的影響。反應(yīng)溫度分別為25、40、80和100 ℃，所得樣品編號(hào)為S21-S24，與S1(反應(yīng)溫度60 ℃)做對(duì)比，結(jié)果如圖6所示。從25 ℃升高至60 ℃，透析后平均收率分別為～62.4，～78.7，～86.7%，60 ℃時(shí)達(dá)到最大收率(產(chǎn)品S1)。反應(yīng)溫度為80和100 ℃時(shí)，其反應(yīng)溶液的顏色由淺黃色變?yōu)辄S色，制得的產(chǎn)品收率逐漸降低，分別為～85.6(S23)，～84.4%(S23)。各產(chǎn)品透析前收率亦列于表1，均表明了60 ℃為最優(yōu)反應(yīng)溫度。

3 結(jié)論

以4-二甲氨基吡啶為催化劑，采用聚乙二醇(PEG，平均分子量2000 u)和丁二酸酐(SA)反應(yīng)制備了聚乙二醇二羧基醚(PEG-biCOOH)?？疾炝巳軇?、投料配比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)品收率的影響，得出最優(yōu)反應(yīng)條件：反應(yīng)溶劑為DMF，PEG與SA的摩爾比為1:2.8，反應(yīng)溫度是60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為24 h，此條件下的產(chǎn)物透析后的平均收率為86.7%。核磁共振氫譜、紅外光譜和質(zhì)譜測(cè)試結(jié)果均表明PEG端基羥基與開(kāi)環(huán)后的丁二酸酐成功鍵合，制得PEG-biCOOH。相比于傳統(tǒng)方法，該方法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)溫度低，容易操作，溶劑毒性低，反應(yīng)條件溫和，收率較高。PEG-biCOOH的合成為進(jìn)一步與抗癌藥物反應(yīng)合成前體藥物、制備藥物納米顆粒等提供了一定的研究基礎(chǔ)。