蛇毒中生物活性酶的研究進(jìn)展

劉秉宜,王慶鵬,王正平,2,張瑞巖,韓 軍,2

(1.聊城大學(xué) 生物制藥研究院，山東 聊城 252059；2.聊城高新生物技術(shù)有限公司，山東 聊城 252059)

0 引言

蛇毒是一味中藥，早在唐開元29年的《本草拾遺》一書中就有記載。書中描述了蛇毒的功效為“主破血，止血痢”。古人通過經(jīng)驗(yàn)和大膽的嘗試，發(fā)現(xiàn)蛇毒是止血的良藥。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度上解釋，蛇毒中的某類蛋白酶具有凝血的功能，能夠激活人的凝血系統(tǒng)。事實(shí)上，蛇毒的功能很多，止血作用只是其中之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)要求我們不能像古人一樣憑借經(jīng)驗(yàn)使用蛇毒，再去發(fā)掘蛇毒的功能，而是需要應(yīng)用先進(jìn)的技術(shù)手段對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，還要不斷地分離、純化、鑒定蛇毒蛋白或小分子肽，從而發(fā)現(xiàn)蛇毒的新價(jià)值并對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)進(jìn)行可行性分析。本文以蛇毒類藥物研究的過程為線索，從蛇毒生物活性酶的功能分析到分離純化、鑒定，并對(duì)已上市的蛇毒藥物進(jìn)行綜述，并以此概括蛇毒藥物的研究進(jìn)展。

1 蛇毒生物活性酶的分離純化方法

蛋白酶類樣品的分離和純化方法的選擇要根據(jù)其性質(zhì)和具體的研究目的來決定。常用于初步提取和濃縮蛋白質(zhì)的方法主要有吸附法、超濾法、沉淀法(如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀和選擇性沉淀等)和透析法等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，色譜法(如凝膠過濾、離子交換、親和色譜和共價(jià)色譜等)和電泳法(如等電聚焦、雙向電泳、毛細(xì)管電泳和免疫電泳等)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離和純化中。這些分離純化方法的原理主要是基于蛋白質(zhì)的溶解性、帶電荷性、分子量大小和親和特異性等方面的差異。1980年Schmaier AH等人應(yīng)用凝膠過濾法在響尾蛇毒液中分離純化出Crotalocytin蛋白，并且研究了被響尾蛇咬后病人血小板數(shù)量下降、深靜脈凝血、纖維蛋白原含量急劇降低等癥狀與Crotalocytin蛋白的關(guān)系。其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，響尾蛇Crotalocytin蛋白具有聚集血小板和降解纖維蛋白原的功能[1]。

此外，離子交換層析是以離子交換樹脂或化學(xué)鍵合離子交換劑為固定相，利用被分離組分離子交換能力的差別而實(shí)現(xiàn)樣品分離的色譜方法。按照可交換離子所帶電荷的不同又可分為陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。1998年，錢亞雯等人使用離子交換色譜法分離了腹蛇毒液中的蛋白質(zhì)，他們觀察到蛇毒毒液中有多種活性較高的組分[2]。另外，Qiao XX 團(tuán)隊(duì)用陽離子交換層析法分離出一種活性很高的蛋白TJUQ1[3]，并對(duì)其廣譜抗菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和研究的不斷深入，單一的分離方法并不能滿足科研人員的需求，很多團(tuán)隊(duì)使用多種方法相組合的策略對(duì)蛇毒樣品進(jìn)行分離純化。例如，鐘讀波等人使用DEAE-Sephadex A-25及Sephadex G-25層析的方法對(duì)長白山白眉蝮蛇蛇毒中類凝血酶進(jìn)行分離純化，得到一個(gè)分子量為35.5 ku、體外比活力為12.57 IU·mg-1的凝血酶[4]。另外，Soares TG團(tuán)隊(duì)使用RP-HPLC和SEC-HPLC方法分離蛇毒中的組分，結(jié)果用SEC-HPLC方法得到的 MipLAAO-SEC蛋白有活性，而用RP-HPLC法得到的蛋白卻沒有活性[5]。由此可見，在進(jìn)行目標(biāo)蛋白的分離純化時(shí)應(yīng)該考慮被分離蛋白的性質(zhì)后再確定分離方法，并且應(yīng)該多種分離法同時(shí)使用，選出最適合目標(biāo)蛋白的分離方法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 蛇毒生物活性酶的分析鑒定方法

蛇毒粗毒經(jīng)過分離純化后可獲得高純度的活性蛋白酶，為了對(duì)該組分進(jìn)行更深入的研究，需要進(jìn)一步對(duì)其理化性質(zhì)、氨基酸序列信息和高級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析。蛇毒組分的詳細(xì)信息包括分子量大小、等電點(diǎn)、氨基酸序列、蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)(通過CD、 IR、NMR、X-ray、TEM等技術(shù)進(jìn)行分析)和是否含有金屬離子等。1992年，Burakhart W 發(fā)表了一篇關(guān)于Ancord(安克洛酶)活性成分Viprinex的研究文章，他們發(fā)現(xiàn)Viprinex是由234個(gè)氨基酸組成的分子量為26570 u的多肽。經(jīng)儀器測量分析Viprinex的氨基酸序列后，作者推斷出Viprinex N端有5個(gè)糖基化位點(diǎn)、兩個(gè)二硫鍵、無金屬結(jié)合位點(diǎn)等相關(guān)信息[6]。

對(duì)于分離純化的已知蛋白，則可以使用western blotting來確定被分離的蛋白是否是目標(biāo)蛋白。2016年，Colla?o RC等人使用western blotting考察了市售的抗蛇毒血清(CAv)與不同種類腹蛇的粗毒液的結(jié)合情況。發(fā)現(xiàn)CAv可以與不同濃度的腹蛇粗毒液結(jié)合，證明了CAv在中和蛇毒毒液上有顯著作用[7]。

蛇毒蛋白酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的確定多使用圓二色譜法(CD)確定。Vishwanath BS等人通過圓二色譜在320 nm處觀察到從蛇毒中提取的phospholipase A2(PLA2)與從馬鈴薯中提取到的馬兜鈴酸(aristolochic acid)有額外的結(jié)合條帶。并且兩者結(jié)合后觀察到PLA2的α螺旋的含量顯著增加，磷脂酶A2的活性下降。因此得出馬兜鈴酸是蛇毒磷脂酶A2的非競爭型抑制劑的結(jié)論[8]。

在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究中通常需要結(jié)合氨基酸序列、殘基信息、圓二色譜、核磁共振等信息來推斷蛋白質(zhì)可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其位置。蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，解析三級(jí)結(jié)構(gòu)需要有昂貴的設(shè)備支撐。X-ray可以檢測到蛋白質(zhì)的各原子組成的官能團(tuán)的電子云，根據(jù)電子云的分布可以計(jì)算出肽鏈的折疊情況。

3 蛇毒中生物活性成分的分類及功能

蛇毒粗毒由多種生物活性酶組成，根據(jù)蛋白酶作用部位的不同可分為細(xì)胞毒素、神經(jīng)毒素和肌肉毒素。蛇毒中分子的多樣性決定蛇毒功能的多樣性。蛇毒蛋白酶的生物功能主要包括抗栓溶栓、止血、降血壓、止痛和抗腫瘤等。表1匯總了各個(gè)功能對(duì)應(yīng)的生物活性蛋白的結(jié)構(gòu)和活性等信息。

3.1 蛇毒蛋白酶的凝血功能

凝血酶的本質(zhì)是一類凝血因子，主要的功能是通過凝血因子Xa的作用將凝血酶原轉(zhuǎn)化為有活性的凝血酶，凝血酶裂解纖維蛋白原(如圖1所示)的A,B鏈形成纖維蛋白，之后纖維蛋白結(jié)合血小板達(dá)到凝血的效果，需要指出的是，凝血酶的副作用是形成血栓。還有研究表明凝血酶通過活化血小板細(xì)胞膜上的蛋白酶活化受體來促進(jìn)血小板的活化和聚集[9]。對(duì)于人源凝血酶研究較多的是凝血酶與細(xì)胞膜上受體的結(jié)合后觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)控的機(jī)理研究。但是 2019年Kacmaz C等人開發(fā)出凝血酶的新價(jià)值，他們研究了凝血酶在脂肪移植領(lǐng)域的作用。通過組織學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估表明，凝血酶減少了移植脂肪的重量和體積損失，增加了活脂肪細(xì)胞的數(shù)量，并降低了接受部位的炎癥發(fā)生率[10]。不同于人源凝血酶的凝血機(jī)制，蛇毒凝血酶的凝血機(jī)制主要依賴一類絲氨酸蛋白酶的成分。例如，研究較多的安克洛酶(Ancrod)和巴曲酶(Batroxobin)。Mattock等人研究發(fā)現(xiàn)，用Ancrod活化的凝血因子XIII(凝血酶原酶)能產(chǎn)生少量的γ二聚體，作者認(rèn)為絲氨酸蛋白酶(Ancrod)可以將無活性凝血酶原酶轉(zhuǎn)換為有活性的凝血酶，進(jìn)而生成少量的纖維蛋白(γ二聚體)，γ二聚體再與血小板等成分結(jié)合達(dá)到凝血的作用。1977年Rizza C等人在Mattock的研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)Ancrod和Batroxobin可能是將凝血因子XIII轉(zhuǎn)化為一個(gè)中間體，這個(gè)中間體有類似XIIIa的活性，進(jìn)而催化γ二聚體的形成。2016年Nielsen VG等人研究發(fā)現(xiàn)，由蛇毒誘導(dǎo)的血栓形成速度接近凝血酶誘導(dǎo)的凝血速度的兩倍。并且，在腦中風(fēng)患者中發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原被鐵和一氧化碳修飾，這可能是安克洛酶對(duì)腦中風(fēng)患者不起作用的原因，他們進(jìn)而提出消耗纖維蛋白原法治療腦中風(fēng)的方案[11]。同為凝血酶的Batroxobin也從蛇毒中提取的生物活性酶。Stocker K等人通過比較不同蛇毒來源Batroxobin的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，Batroxobin不同的的糖基化程度使其所帶電荷量不一樣，所以不同來源的Batroxobin凝血速度也會(huì)有差異。另外，Batroxobin的凝血機(jī)制是通過裂解纖維蛋白原α鏈的Arg-Gly鍵來釋放纖維蛋白A，加入咪唑和苯酚能加快Batroxobin的凝血作用。因?yàn)锽atroxobin不受凝血酶抑制劑的影響，所以將Batroxobin分類為類凝血酶[12]。2019年， Masuda H等人通過對(duì)后肢缺血型小鼠模型腹腔注射Batroxobin，觀察到隨著注射天數(shù)的增加，小鼠體內(nèi)Arg-1，Plgf，Myog等生長因子的逐漸上調(diào)和肌纖維的成熟等現(xiàn)象，表明Batroxobin還有加速組織修復(fù)的功能[13]。

圖1 纖維蛋白原的結(jié)構(gòu)圖[14]

3.2 蛇毒蛋白酶的抗栓溶栓功能

蛇毒蛋白酶中的抗栓溶栓組分可以抑制血小板之間的聚集，影響機(jī)體凝血和血栓的生成。例如，王晴川等人在尖吻蝮蛇毒液中提取出蘄蛇酶，并觀察到蘄蛇酶可以裂解纖維蛋白原的α鏈從而降低血液的纖維蛋白原，還能抑制血小板的聚集[15]。2014年Tsai IH等人通過基因敲除蘄蛇酶的特定糖基化位點(diǎn)，考察了蘄蛇酶糖基化對(duì)酶降纖維蛋白原的影響。結(jié)果表明，敲除氨基酸序列中229位的天冬氨酸后蘄蛇酶的活性發(fā)生顯著變化。與正常的蘄蛇酶相比，突變蛋白不再特異性水解纖維蛋白原的Aα鏈，變得沒有特異性了。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，敲除77、81和100位天冬氨酸后，蘄蛇酶蛋白不能正確折疊。除此之外，在功能探索方面，有報(bào)道指出，蘄蛇酶有降低腦動(dòng)脈缺血對(duì)腦損傷的功能[16]。

血栓塊一般由不溶性纖維蛋白、血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞混合組成，可分為靜脈血栓和動(dòng)脈血栓。血栓可由凝血酶活性過高、或者是內(nèi)源自發(fā)性、或是細(xì)胞脂肪過多等原因使血管管道變窄生成。溶栓是在血栓已經(jīng)生成的情況下，纖溶酶降解由纖維蛋白等組成的血栓塊的過程。蛇源的纖溶酶分為單鏈金屬蛋白酶、單鏈絲氨酸蛋白酶和雙鏈絲氨酸蛋白酶。蛇毒雙鏈絲氨酸蛋白酶對(duì)纖維蛋白原表現(xiàn)為非特異性作用，其優(yōu)先降解纖維蛋白原B鏈(FGB)，釋放纖維蛋白肽B，并表現(xiàn)出較低的降解纖維蛋白原A鏈(FGA)活性，釋放纖維蛋白肽A(如圖1)。也可以破壞纖維蛋白之間的結(jié)合力，使不溶性的纖維蛋白塊降解。單鏈絲氨酸蛋白酶降解纖維蛋白原的A鏈，單鏈金屬蛋白酶則表現(xiàn)出相反的活性，它優(yōu)先降解纖維蛋白的B鏈，再對(duì)A鏈和γ鏈起作用。蛇毒纖溶酶的蛋白水解活性低于人源纖溶酶，但是它對(duì)蛋白激酶C，凝血因子XIα和凝血酶都有很強(qiáng)的活性，表現(xiàn)為纖溶、抗凝的作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，大部分纖溶酶的副反應(yīng)表現(xiàn)為出血。但科研人員在眼鏡蛇蛇毒中發(fā)現(xiàn)有專一性很強(qiáng)的纖溶酶抑制劑，能夠很好地抑制纖溶酶的副反應(yīng)的發(fā)生[18]。

3.3 蛇毒蛋白的降血壓功能

蛇毒中存在一類小分子降壓肽，包括血管舒緩激肽強(qiáng)化肽、尿鈉排泄肽(利鈉肽)、Sarafo毒素、中性磷脂酶A2和L型鈣離子通道阻滯劑等。這些小分子降壓肽通過不同的方式達(dá)到降壓的效果，其中一類蛇毒是血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶的抑制劑(如圖2所示)，使血管緊張素Ⅰ不能轉(zhuǎn)換成血管緊張素Ⅱ，從而無法起到收縮血管的作用，發(fā)揮降血壓的功能。此外，血管緊張素Ⅱ可以使血管舒緩激肽失活從而抑制血管的舒張使血壓上升。并且，血管緊張素Ⅱ還可以使腎小管重吸收鈉離子，進(jìn)而重吸收水達(dá)到升壓效果。因此，蛇毒降壓肽抑制了血管緊張素Ⅱ的生成，發(fā)揮降壓作用。

3.4 蛇毒神經(jīng)毒素的止痛功能

神經(jīng)毒素是蛇毒中重要的一類麻痹獵物神經(jīng)的蛋白，在眼鏡蛇和海蛇的毒液中含量較豐富，毒性較大。由于蛇毒神經(jīng)毒素能阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和釋放過程，具有止痛藥成藥的可能性，而且蛇毒神經(jīng)毒素發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)，沒有耐受性和成癮性。又因?yàn)樯叨旧窠?jīng)毒素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞后膜受體的高特異性，強(qiáng)親和性，也被開發(fā)用于分離神經(jīng)遞質(zhì)受體的探針。根據(jù)其阻斷的部位不同，可分為突觸前神經(jīng)毒素和突觸后神經(jīng)毒素。突觸后神經(jīng)毒素又可根據(jù)其三指蛋白的二硫鍵個(gè)數(shù)分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型神經(jīng)毒素又被稱為短鏈神經(jīng)毒素(Short chain neurotoxin)，Ⅱ型神經(jīng)毒素稱為長鏈神經(jīng)毒素(Long chain neurotoxin)。大多數(shù)的神經(jīng)毒素屬于Ⅰ型神經(jīng)毒素，擁有4個(gè)二硫鍵，作用于肌肉細(xì)胞煙酰胺乙酰膽堿受體，競爭性的抑制神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿與受體結(jié)合，因此阻斷神經(jīng)與肌肉的信號(hào)傳遞。Ⅱ型神經(jīng)毒素?fù)碛?個(gè)二硫鍵。Ⅰ型和Ⅱ型神經(jīng)毒素都能結(jié)合肌肉煙酰胺乙酰膽堿受體，但只有Ⅱ型神經(jīng)毒素可以與神經(jīng)元之間的α7煙酰胺乙酰膽堿結(jié)合，阻斷神經(jīng)元之間的信號(hào)傳遞。又因?yàn)樯窠?jīng)毒素的強(qiáng)親和性，且結(jié)合能力強(qiáng)于神經(jīng)遞質(zhì)與受體的結(jié)合，所以神經(jīng)毒素是神經(jīng)遞質(zhì)的強(qiáng)抑制劑。這也是它能用來緩解惡性腫瘤疼痛，神經(jīng)性疼痛，關(guān)節(jié)痛等疾病的原因。蛇毒突觸前神經(jīng)毒素大多數(shù)具有磷脂酶A2的活性，作為鈣離子依賴性蛋白酶家族的成員，其可以結(jié)合到突觸前膜上，抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而阻斷神經(jīng)原之間的信號(hào)傳遞，使肌肉麻痹[19,20]。

圖2 蛇毒降壓肽參與血壓調(diào)節(jié)的過程圖(虛線箭頭表示血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化酶被抑制后的下游通路)

3.4.1 突觸前神經(jīng)毒素。酸性磷脂酶是作用于突觸前膜的一類蛇毒神經(jīng)毒素。在小鼠體內(nèi)毒性表現(xiàn)為浮腫、神經(jīng)毒素和間接溶血等。例如，蛇毒磷脂酶A2(BthA-I-PLA2)可以誘導(dǎo)水腫的發(fā)生，還可以抑制磷脂依賴性膠原/ADP(二磷酸腺苷)誘導(dǎo)的血小板聚集，具有降壓和抗凝的功能。此外，蛇毒磷脂酶A2會(huì)破壞大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此具有殺菌的功能[21]。

表1 蛇毒生物活性物的功能匯總

3.4.2 突觸后神經(jīng)毒素。響尾蛇毒素低劑量使用有鎮(zhèn)痛效果，高劑量使用出現(xiàn)肌肉壞死的癥狀。響尾蛇毒素同時(shí)擁有β-干擾素和α蝎毒神經(jīng)毒素的部分活性，因?yàn)樗鼈冊谌?jí)結(jié)構(gòu)上部分作用位點(diǎn)的相似性、在二級(jí)結(jié)構(gòu)上存在30%的同源性以及活性的強(qiáng)弱和它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)表面的凈正電荷成正比。響尾蛇毒素可在肌細(xì)胞表面聚集成網(wǎng)狀泡阻斷信號(hào)的傳遞與轉(zhuǎn)化，進(jìn)而使肌壞死。因?yàn)轫懳采叨舅氐摩谅菪蛄休^短，不能形成穩(wěn)定的半胱氨酸α螺旋基序，所以響尾蛇毒素可以阻斷細(xì)胞膜上的鈉離子通道的開放[22]。響尾蛇毒素是富含精氨酸和賴氨酸的短肽。這類富含精氨酸和賴氨酸的多肽稱為細(xì)胞穿透肽，帶大量正電荷的多肽和細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合從而介導(dǎo)響尾蛇毒素的內(nèi)吞，表現(xiàn)為在體內(nèi)和體外被細(xì)胞快速內(nèi)化。響尾蛇毒素這一特性使其可以作為細(xì)胞內(nèi)基因傳遞、藥物傳遞和診斷探針的載體。另外，響尾蛇毒素還可以作為一種細(xì)胞穿透性蛋白用于細(xì)胞核定位和研究細(xì)胞分裂的動(dòng)態(tài)過程[23]。

蛇毒心臟毒素屬于細(xì)胞毒素，對(duì)心肌細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性，如β-心臟毒素是腎上腺素β受體的阻斷劑。根據(jù)腎上腺素受體對(duì)去甲腎上腺素的不同反應(yīng)情況，分為腎上腺素α受體和β受體，皮膚、腎、胃腸的血管平滑肌以α受體為主，而骨骼肌、肝臟的血管平滑肌以及心臟以β受體為主，去甲腎上腺素主要作用于α受體，而腎上腺素則作用于β受體。因?yàn)棣?心臟毒素能特異性的聚集在腎上腺素β受體上，從而阻斷心肌等細(xì)胞的電信號(hào)傳遞，所以會(huì)產(chǎn)生心率下降、運(yùn)動(dòng)減緩、對(duì)刺激不敏感等毒副作用[24]。還有一類心臟毒素的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞表面粘附受體的一個(gè)超家族——整合素αvβ3。它們在多種細(xì)胞上表達(dá)，介導(dǎo)許多生理過程，包括炎癥、遷移、粘附和增殖等。例如細(xì)胞毒素A5(cytotoxinA5)是一類不表現(xiàn)溶血溶細(xì)胞活性的非細(xì)胞毒性蛋白，對(duì)整合素αvβ3有高親和性，抑制破骨細(xì)胞差異化和骨吸收[25]。

3.5 蛇毒蛋白細(xì)胞毒素的功能

細(xì)胞毒素可分為P型和S型蛋白。P型蛋白包括cardiotoxin、cytotoxin6、7和A5，S型蛋白包括cytotoxin1、2、3、4和5。標(biāo)準(zhǔn)的P型蛋白是氨基酸序列的第31位有1個(gè)脯氨酸，P型蛋白大多數(shù)通過與心肌細(xì)胞表面上的受體結(jié)合而起作用。S型蛋白的特征是氨基酸序列的第29位有1個(gè)絲氨酸。cytotoxin1、3單體對(duì)部分細(xì)胞(C2Cl2)表現(xiàn)出溶解細(xì)胞的活性，也可以促使鈣離子釋放和促進(jìn)胰島素分泌。S型蛋白在無葡萄糖存在的條件下可以促進(jìn)胰島素的分泌，如果在有葡萄糖存在的條件下，cytotoxin1.3活性會(huì)隨葡萄糖的濃度升高而升高。然而，細(xì)胞毒素多聚體并不表現(xiàn)溶解細(xì)胞活性，大部分多聚體表現(xiàn)為α-眼鏡蛇毒活性，這種毒活性可與α-真菌素競爭結(jié)合α7/CHRNA7受體。Cytotoxin2、4、5通過結(jié)合硫化物聚集在磷脂細(xì)胞膜上形成小孔裂解細(xì)胞，也能作用于線粒體膜導(dǎo)致線粒體腫大或破碎。還有一種從印度眼鏡蛇毒液中分離純化得到的特殊細(xì)胞毒素因子(Cytotoxin NN-32)，它既不屬于P型也不屬于S型蛋白，但能通過影響細(xì)胞凋亡的過程而達(dá)到抗癌的效果[24-29]。

表2 國內(nèi)外蛇毒類藥物

3.6 蛇毒蛋白抗腫瘤的功能

蛇毒抗腫瘤大致可分為三大類：一類是細(xì)胞毒素介導(dǎo)的溶解細(xì)胞功能，可直接殺死腫瘤細(xì)胞；第二類是蛇毒成分誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；第三類是蛇毒的解離素成分通過抑制腫瘤細(xì)胞血管的生成，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的生長。蛇毒S型單體蛋白cytotoxin1和cytotoxin3可以直接溶解細(xì)胞從而發(fā)揮抗腫瘤功能。大部分的金屬蛋白酶具有纖溶酶活性，表現(xiàn)出水解層黏連蛋白、纖連蛋白和膠原的功能，從而破壞細(xì)胞間的連接，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的進(jìn)行。解離素有兩種酶活性：一種是解離素通過自身的RGD(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸)結(jié)構(gòu)特異性識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的RGD三肽,從而限制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；解離素的另一種活性是專一地限制腫瘤細(xì)胞周圍的血管生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。有研究表明通過Vascular endothelial growth factor(VEGF)途徑抑制血管生成的策略存在的問題是它不僅損害腫瘤血管，也損害健康血管，導(dǎo)致嚴(yán)重的出血和血栓事件的發(fā)生[30]。

4 已上市的蛇毒類藥物及存在的問題

蛇毒類藥物大部分產(chǎn)自中國、印度、韓國、日本等亞洲國家。歐美等國的蛇毒類上市藥偏少(表2)，原因可能是蛇毒的免疫原性強(qiáng)，用藥安全性得不到保障等。但是，歐美國家對(duì)蛇毒功能的研究卻一直在進(jìn)行。例如，蛇毒類藥物Ancord和Batroxobin酶開展了臨床Ⅲ期研究，因?yàn)橛盟幉话踩媾R床實(shí)驗(yàn)失敗。蛇毒產(chǎn)品的價(jià)值在于活性高并起效迅速，如何降低蛇毒類產(chǎn)品的免疫原性問題、優(yōu)化神經(jīng)毒素的分子結(jié)構(gòu)以及深入研究其活性作用機(jī)理是科研人員面臨的挑戰(zhàn)。另一方面,大部分的野生蛇類都已列入國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物行列,對(duì)于蛇毒研究人員來說,獲取蛇毒原材料相對(duì)困難。這需要借助基因重組的手段,從基因開始,在宿主中表達(dá)想要研究的生物活性酶。但通過基因轉(zhuǎn)錄翻譯出的蛋白酶相比于直接從蛇毒中提取的蛋白酶來說,前者活性低,效果不能達(dá)到預(yù)期。再者,限制蛇毒類藥物發(fā)展的因素還有提取純化的效率低，很難達(dá)到量產(chǎn)的要求。

5 結(jié)論和展望

蛇毒是藥用價(jià)值十分高的一類原材料，經(jīng)過提取分離后可以獲得有凝血功能、降壓功能、抗血栓功能、止痛功能和抗癌功能的生物活性酶。本文從作用機(jī)制出發(fā)，概述了各類生物活性酶是如何發(fā)揮相應(yīng)的功能，并列舉了各類生物活性酶的研究情況。蛇毒生物活性酶也存在許多問題，例如免疫原性強(qiáng)，純度不高等。這些因素限制了理論研究向產(chǎn)業(yè)實(shí)踐的轉(zhuǎn)化。蛇毒生物活性酶的前景在于理論向?qū)嵺`的轉(zhuǎn)化，比較成功的案例是卡托普利。它的前身是小分子降壓肽，通過化學(xué)全合成之后，可以達(dá)到量產(chǎn)，而不依賴原材料。然而大部分生物活性酶都屬于大分子物質(zhì)，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以標(biāo)準(zhǔn)化，因此全合成很難實(shí)現(xiàn)?？蒲腥藛T應(yīng)該把重心放在生物學(xué)的手段上，提高通過基因重組出的生物活性酶的活性，使之不依賴原材料而達(dá)到量產(chǎn)成為可能。