Anti-HER2免疫脂質(zhì)體的制備及其靶向特異性的檢測(cè)1

崔 瀟，馬亞平，張亞柯，李 英，張芳霞，王 瑞

(聊城大學(xué) 藥學(xué)院， 山東 聊城 252059)

0 引言

納米醫(yī)學(xué)具有提高藥物功效、降低毒性、優(yōu)化藥物特性、遞送生物大分子藥物和克服腫瘤驅(qū)動(dòng)的免疫抑制信號(hào)等獨(dú)特特征[1]，在解決諸如單克隆抗體等生物制劑的缺點(diǎn)方面具有巨大潛力[2]。脂質(zhì)體作為第一類獲得臨床批準(zhǔn)用于癌癥治療的治療性納米粒，因其良好的生物相容性、高效的給藥途徑和保護(hù)抗體不被降解的能力而備受關(guān)注。脂質(zhì)體已被證明是能使多種藥物有效傳遞到靶細(xì)胞的載體[3]，藥物與脂質(zhì)體結(jié)合可以顯著改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，使藥物毒性降低和治療效果提高[4,5]，因此脂質(zhì)體制劑在抗腫瘤藥物傳遞方面具有廣闊的發(fā)展前景。據(jù)報(bào)道，聚乙二醇(PEG)通過(guò)被動(dòng)靶向機(jī)制以及增強(qiáng)的滲透性和保留EPR效應(yīng)自發(fā)積累在實(shí)體腫瘤中[6]，因此脂質(zhì)體的表面可以用柔性的親水性聚合物如聚乙二醇(PEG)進(jìn)行改性，從而克服傳統(tǒng)脂質(zhì)體在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)中被快速清除的缺點(diǎn)。

在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，主動(dòng)靶向是克服低選擇性和全身毒性，提高治療效果的重要策略[7,8]。具有可控和靶向功能的藥物傳遞裝置可以理想地將高劑量的治療劑特異性地傳遞給病變細(xì)胞，減少對(duì)健康細(xì)胞的干擾，從而產(chǎn)生預(yù)期的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布，達(dá)到更高的治療效果和更少的副作用。人們對(duì)各種先進(jìn)的靶向策略的開發(fā)有持續(xù)的興趣，其中配體偶聯(lián)的納米顆粒[9](包括軟納米顆粒如膠束和脂質(zhì)體，固體納米顆粒如可生物降解聚合物)可能是各種靶向中最有前景的聚合物納米粒子，能夠?qū)⑹杷运幬锶芙庠诰酆衔锘w中[10,11]，解決藥物溶解性問題，同時(shí)具有穩(wěn)定性高、藥物負(fù)載效率高、藥物持續(xù)釋放、血液循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)、癌細(xì)胞靶向空間活躍等優(yōu)點(diǎn)[12]。

HER2(人表皮生長(zhǎng)因子受體-2)是一種185 KD跨膜糖蛋白，具有胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和胞外配體結(jié)合域，參與細(xì)胞分化等重要階段。HER2作為一個(gè)細(xì)胞存活的關(guān)鍵基因，過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致惡性腫瘤進(jìn)展與乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌的預(yù)后不良[13]。大約25%的乳腺癌中存在HER2的過(guò)度表達(dá)，由于其具有耐藥性，導(dǎo)致曲妥珠抗體直接使用臨床療效不佳[14]，而空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體可以增加血液循環(huán)時(shí)間，通過(guò)抗體修飾可以選擇性地將膠囊藥物輸送到HER2過(guò)度表達(dá)的癌細(xì)胞[15]，因此Anti-HER2免疫脂質(zhì)體是一種靶向給藥治療HER2過(guò)度表達(dá)癌癥很有前途的策略。本文主要優(yōu)化并對(duì)比了兩種不同的聚乙二醇連接方法，相較之前常見的DSPE-PEG2000-Mal連接方法，DSPE-PEG2000-NHS連接方法更為簡(jiǎn)單、高效，為今后靶向藥物的研究提供一種更簡(jiǎn)單、高效的免疫脂質(zhì)體的制備方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

MCF-7細(xì)胞(HER2表達(dá)陰性細(xì)胞系，HER2-cell)和SKOV-3細(xì)胞(HER2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞系，HER2+cell)購(gòu)買于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)買于美國(guó)Thermo Fisher Scientific(GIBCO)公司；氫化卵磷脂、DSPE-mPEG2000(二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000)、DSPE-PEG2000-Mal(磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺)、DSPE-PEG2000-NHS(二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000-N-羥基丁二酰亞胺)、Cy5-PEG2000-DSPE(近紅外染料Cy5-聚乙二醇-磷脂)購(gòu)買于西安瑞禧公司；膽固醇、2-IT(2-Iminothiolane HCL)購(gòu)買于Sigma公司；HER2單克隆抗體由張江生物科技有限公司贈(zèng)送；PBS、無(wú)水乙醇等試劑購(gòu)自J.T.Baker公司；50、100、200 nm孔徑聚碳酸酯膜購(gòu)買于Whatman公司；Zetasizer Nano ZS是由英國(guó)Malvern公司制造，脂質(zhì)體擠出器LF-1由美國(guó)Avestin公司制造；超微量天平為德國(guó)梅特勒-托利多XP6百萬(wàn)分之一超微量天平；OLYMPUS共聚焦顯微鏡；流式細(xì)胞儀為Millipore Guava 8HT；多功能微孔板檢測(cè)儀為Synergy H1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NHS/Mal脂質(zhì)體(NHS/Mal LP)以及空白脂質(zhì)體(LP)的制備——乙醇注入法。 取3 mL PBS于圓底玻璃離心管中，65℃水浴預(yù)熱，磁力攪拌使PBS形成漩渦。0.5 mL無(wú)水乙醇溶液65 ℃水浴預(yù)熱，精確稱取28.74 mg氫化卵磷脂、7.3 mg DSPE-mPEG2000、9.57 mg膽固醇、2.394 mg DSPE-PEG2000-Mal /DSPE-PEG2000-NHS溶解于預(yù)熱無(wú)水乙醇中，渦旋均勻，吸取至1 mL注射器中，將注射器懸空放置于水相圓底玻璃離心管中,待乙醇脂溶液溫浴充分后，快速將油相注入水相中，65 ℃ 渦旋30 min，形成脂質(zhì)體。將制備好的的脂質(zhì)體溶液通過(guò)脂質(zhì)體擠出器，聚碳酸酯膜的粒徑為 200，100，50 nm，反復(fù)擠出 21 次，獲得粒徑均一的NHS/Mal脂質(zhì)體?？瞻字|(zhì)體(LP)制備時(shí)未加入Mal- DSPE-PEG2000 /NHS-DSPE-PEG2000，其制備方法與上述方法相同。

1.2.2 Anti-HER2免疫脂質(zhì)體(Anti HER2-NHS/Mal LP)的制備。 DSPE-PEG2000-NHS連接法：將HER2抗體溶液加入至透析袋(截留分子量為100 ku)，放置于透析液(50 mM Na2HPO4、50 mM NaH2PO4、10 mM EDTA、0.15 M NaCl，pH 7.4)中，4 ℃，6 h，每2 h換一次透析液。透析后抗體與NHS脂質(zhì)體混勻，摩爾比為1：50，室溫震蕩孵育3 h，PBS透析(透析袋截留分子量為300 ku)除去未與脂質(zhì)體連接的HER2抗體。

DSPE-PEG2000-Mal連接法：將HER2抗體溶液加入至透析袋(截留分子量為100 ku)，放置于透析液(50 mM Na2HPO4、50 mM NaH2PO4、10 mM EDTA、0.15 M NaCl，pH 8.0)中，4℃，6 h，每2 h換一次透析液。將透析后的抗體與2-IT混勻，摩爾比為1：10，室溫震蕩孵育1 h，放置于PB溶液(50 mM Na2HPO4、50 mM NaH2PO4，pH 7.4)中透析0.5 h，去除未連接2-IT。將2IT-Anti HER2與Mal脂質(zhì)體混勻，摩爾比為1：50，室溫震蕩孵育3 h。 PBS透析(透析袋截留分子量為300 ku)除去未與脂質(zhì)體連接的2IT-Anti HER2。

空白脂質(zhì)體對(duì)照：將空白脂質(zhì)體與HER2抗體混勻，摩爾比為1：50，室溫震蕩孵育3 h，PBS透析除去未與脂質(zhì)體連接HER2抗體。

熒光免疫脂質(zhì)體的制備：將0.2 μg Cy5-PEG2000-DSPE(645 nm激發(fā)紅光熒光染料)與100 μL空白脂質(zhì)體混合均勻，65 ℃水浴1 h后連接HER2抗體，連接方法同上，制備插入Cy5-PEG2000-DSPE的空白熒光免疫脂質(zhì)體、NHS/Mal熒光免疫脂質(zhì)體。透析去除未連接的抗體和游離的熒光染料，成功獲得Lip(空白熒光免疫脂質(zhì)體)、NLip(Anti HER2-NHS-Cy5熒光免疫脂質(zhì)體)和MLip(Anti HER2-Mal-Cy5熒光免疫脂質(zhì)體)。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)。 SKOV-3細(xì)胞(HER2+cell)用RPMI-1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(FBS)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)；MCF-7細(xì)胞(HER2-cell)用DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(FBS)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，密度達(dá)到80-90% 即可傳代，傳代時(shí)用0.25% 胰酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，將適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞懸液按照實(shí)驗(yàn)需要接入含有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板中，補(bǔ)足培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以備實(shí)驗(yàn)所需。

1.2.4 粒徑測(cè)定。 用英國(guó)Malvern公司的Zetasizer Nano ZS分析儀測(cè)定樣品的粒徑，每份樣品重復(fù)3次。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)HER2抗體與脂質(zhì)體的連接效率。 將樣品移至新的EP管中，按比例加入4×SDS Loading buffer。恒溫加熱器100 ℃煮沸30 min破乳，12000 rpm離心5 min后，15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE變性電泳。每泳道按相同體積上樣，常規(guī)電泳。注：由于透析后抗體濃度較低，為方便檢測(cè)，透析后樣品上樣體積為透析前的兩倍，計(jì)算連接效率時(shí)透析后蛋白條帶灰度值除以2。

1.2.6 細(xì)胞毒性分析。 本研究中，用MTT比色法檢測(cè)各種脂質(zhì)體對(duì)SKOV-3和MCF-7細(xì)胞增殖的影響。將SKOV-3和MCF-7細(xì)胞以5 × 103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)計(jì)4個(gè)復(fù)孔。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。每孔分別加入0.02、0.2、2 μg/mL的LP、Anti HER2-NHS LP、Anti HER2-Mal LP。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。加MTT處理4 h后，去掉培養(yǎng)基，每孔加入120 μL DMSO，輕微震蕩10 min，在490 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定OD值讀數(shù)，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，重復(fù)試驗(yàn)3次。計(jì)算相對(duì)細(xì)胞存活率 RCV(%)=測(cè)試組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.7 免疫脂質(zhì)體的靶向特異性檢測(cè)。 將SKOV-3和MCF-7細(xì)胞以5 × 104/皿接種于φ15 mm TC 共聚焦培養(yǎng)皿中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。將熒光免疫脂質(zhì)體NLip、MLip和Lip分別與SKOV-3和MCF-7細(xì)胞37℃ 孵育2 h后，4% 多聚甲醛固定5 min，DAPI(5 μg/mL)染色15 min，激光共聚焦顯微鏡拍照。將NLip、MLip和Lip分別與SKOV-3和MCF-7細(xì)胞4℃ 孵育30 min，使用密理博guava easy Cyte 8HT 微流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行熒光檢測(cè)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均以平均值(Mean ± SD)表示，各組數(shù)據(jù)差異性比較采用t-test(非參數(shù)檢驗(yàn))方法進(jìn)行分析，p> 0.05表示差異性不顯著；0.01<*p<0.05表示差異性顯著；**p<0.01表示差異性極顯著；***p<0.001表示差異具極其顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂質(zhì)體的粒徑檢測(cè)

眾所周知，粒徑大小通過(guò)影響組織分布和清除率對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)的變化起著重要的作用。應(yīng)用英國(guó)Malvern公司的zeta電位儀Zetasizer Nano ZS分別檢測(cè)NHS脂質(zhì)體(NHS LP)、Mal脂質(zhì)體(Mal LP)、Anti HER2-NHS/Mal免疫脂質(zhì)體(Anti HER2-NHS/Mal LP)、空白脂質(zhì)體(LP)粒徑。本研究制備的脂質(zhì)體平均粒徑約為100-135 nm，分布均勻，成正態(tài)性。

注：(a) NHS脂質(zhì)體與Anti HER2-NHS LP粒徑分布;

2.2 SDS-PAGE檢測(cè)HER2抗體與脂質(zhì)體的連接效率

空白脂質(zhì)體與Anti-HER2反應(yīng)透析前后對(duì)比可得出，若Anti-HER2未與脂質(zhì)體連接，樣品分子量< 300 ku，經(jīng)透析袋(截留分子量為300 ku)透析后樣品中檢測(cè)不到抗體條帶。若Anti-HER2成功與脂質(zhì)體連接，樣品分子量 > 300 ku，經(jīng)透析袋(截留分子量為300 ku)透析后樣品中能夠檢測(cè)到抗體條帶。HER2抗體經(jīng)巰基化處理后，條帶上移，圖2(a)電泳結(jié)果表明脂質(zhì)體與HER2抗體成功連接，制備了免疫脂質(zhì)體。通過(guò)ImageJ對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行相對(duì)定量，計(jì)算出3-6各泳道的條帶灰度值比，連接效率=透析后灰度值比/透析前灰度值比×100%。圖2(b)顯示，DSPE-PEG2000-NHS連接法的連接效率為44.24%，DSPE-PEG2000-Mal連接法的連接效率為36.56%。由此得出結(jié)論，DSPE-PEG2000-NHS連接法的連接效率更高。

圖2 SDS-PAGE 檢測(cè)HER2抗體與脂質(zhì)體的連接效率

2.3 細(xì)胞毒性分析

將SKOV-3和MCF-7細(xì)胞以5 × 103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)計(jì)4個(gè)復(fù)孔。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。每孔分別加入0.02 μg/mL、0.2 μg/mL、2 μg/mL的LP、Anti-HER2-NHS LP、Anti-HER2-Mal LP。 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，MTT法測(cè)定不同脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。不同濃度的脂質(zhì)體在SKOV-3細(xì)胞(圖3(b))、MCF-7細(xì)胞(圖3(a))中均顯示出較高的細(xì)胞活力，與對(duì)照相比無(wú)明顯差異。因此推測(cè)制備的脂質(zhì)體具有良好的生物相容性和低的細(xì)胞毒性。因此，本研究中成功制備的免疫脂質(zhì)體在體外實(shí)驗(yàn)中是相對(duì)安全的。

圖3 脂質(zhì)體細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分析 (a) 脂質(zhì)體處理MCF-7細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活性；(b) 脂質(zhì)體處理 SKOV-3細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活性

2.4 共聚焦顯微鏡檢測(cè)免疫脂質(zhì)體的靶向特異性

將熒光免疫脂質(zhì)體NLip、MLip和Lip分別與SKOV-3和MCF-7細(xì)胞37 ℃ 孵育2 h后，4% 多聚甲醛固定5 min，DAPI(5 μg/mL)染色15 min，激光共聚焦顯微鏡拍照。圖4(a)結(jié)果表明，NLip、MLip可與SKOV-3細(xì)胞表面的HER2受體結(jié)合，較空白熒光免疫脂質(zhì)體(Lip)熒光明顯增強(qiáng)。由于MCF-7細(xì)胞表面不表達(dá)HER2受體，將NLip、MLip與MCF-7細(xì)胞孵育后，與空白熒光免疫脂質(zhì)體(Lip)相比，并未顯示出熒光強(qiáng)度的差異,如圖4(b)。結(jié)果表明NHS/Mal熒光免疫脂質(zhì)體可與HER2受體特異性結(jié)合，并通過(guò)HER2受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用增強(qiáng)內(nèi)化。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫脂質(zhì)體的靶向特異性

將熒光免疫脂質(zhì)體Lip、NLip、MLip，分別與MCF-7細(xì)胞、SKOV-3細(xì)胞孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂質(zhì)體與HER2受體表達(dá)差異細(xì)胞的結(jié)合特異性。由于NLip和MLip可以與SKOV-3細(xì)胞表面的HER2受體特異性結(jié)合，因此流式細(xì)胞儀檢測(cè)NLip和MLip與細(xì)胞孵育后，熒光強(qiáng)度的峰較Lip明顯偏移，與空白熒光免疫脂質(zhì)體(Lip)相比，熒光明顯增強(qiáng)(圖5(a))；由于MCF-7細(xì)胞表面不表達(dá)HER2受體，將NLip、MLip與MCF-7細(xì)胞孵育后，與Lip相比，熒光強(qiáng)度的峰未見偏移，并未顯示出熒光強(qiáng)度的差異(圖5(b))，這與共聚焦顯微鏡分析結(jié)果一致。

注：***p<0.001 vs control;(a) 熒光免疫脂質(zhì)體與SKOV-3細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度；(b) 熒光免疫脂質(zhì)體與MCF-7細(xì)胞結(jié)合的熒光強(qiáng)度；(c) 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

圖5 流式檢測(cè)免疫脂質(zhì)體的靶向特異性

3 結(jié)論

采用聚乙二醇連接法成功制備了具有較小粒徑的HER2抗體免疫脂質(zhì)體。通過(guò)細(xì)胞毒性分析，本研究所制備的免疫脂質(zhì)體毒性小，具有較高安全性，可保證體外實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。SDS-PAGE檢測(cè)表明NHS -PEG2000-DSPE的連接效率更高。共聚焦顯微鏡觀察與流式檢測(cè)顯示，HER2過(guò)度表達(dá)的SKOV-3細(xì)胞中HER2抗體免疫脂質(zhì)體較空白脂質(zhì)體組的熒光強(qiáng)，這表明制備的免疫脂質(zhì)體具有較好的靶向特異性。綜上所述，本文主要研究了HER2抗體連接脂質(zhì)體的方法，為今后靶向藥物的研究提供一種更簡(jiǎn)單、高效的免疫脂質(zhì)體的制備方法。