茶特征成分合成相關(guān)新轉(zhuǎn)錄因子鑒定

邰玉玲，楊林，王歡歡，劉春

摘要：茶是世界流行的三大無酒精飲料之一，由茶樹葉片加工而成，因其中含有三大茶樹特征代謝產(chǎn)物（兒茶素、茶氨酸和咖啡堿）而具有獨特風味。轉(zhuǎn)錄因子不僅在植物生長發(fā)育中起重要調(diào)控作用，也影響植物的次級代謝產(chǎn)物合成，而茶樹中關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控兒茶素，茶氨酸和咖啡堿的報道較少。本研究結(jié)合茶樹全器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與茶樹基因組數(shù)據(jù)重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，獲得大量新基因和新轉(zhuǎn)錄本，進而結(jié)合茶樹不同器官中兒茶素、茶氨酸和咖啡堿的含量差異，分別建立茶樹中兒茶素、茶氨酸和咖啡堿與差異表達基因之間的相關(guān)性，篩選鑒定與茶樹中兒茶素、茶氨酸和咖啡堿相關(guān)的基因及轉(zhuǎn)錄因子，并分別對與茶樹中兒茶素、茶氨酸和咖啡堿合成相關(guān)的3條轉(zhuǎn)錄因子WAKY、bZIP、BES基因進行克隆，結(jié)果表明，其ORF框大小分別為1 011 bp，1 692 bp和867 bp，與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：茶樹;轉(zhuǎn)錄因子;茶氨酸;兒茶素;咖啡堿

中圖分類號：S571.1文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2021）06-1534-11

Identification of new transcription factors related to the synthesis of characteristic components in tea

TAI Yu-ling1，2，YANG Lin1，WANG Huan-huan1，LIU Chun1

（1.School of Life Science， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China;2.State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China）

Abstract：Tea is one of the three major non-alcoholic beverages in the world. It is processed from tea leaves and has unique flavor due to the three characteristic metabolites （catechin， theanine and caffeine） of tea. Transcription factors not only play an important role in the regulation of plant growth and development， but also affect the synthesis of secondary metabolites. There are few reports on the regulation of catechin， theanine and caffeine by transcription factors in tea plants. In this study， a large number of new genes and transcripts were reconstructed by combining whole-organ transcriptome data with genomic data of tea tree. Furthermore， the correlation between catechin， theanine and caffeine and differentially expressed genes was established based on the content differences of catechin， theanine and caffeine in different organs of tea tree. The genes transcripts and transcription factors related to the three characteristic metabolic components of tea tree were screened and identified. In addition， three transcription factors （WAKY， bZIP and BES） genes associated with the synthesis of catechin， theanine and caffeine in tea tree were cloned， and the sizes of open reading frame （ORF） were 1 011 bp， 1 692 bp and 867 bp， respectively. The results were consistent with those of transcriptome analysis.

Key words：tea;transcription factor;theanine;catechin;caffeine

茶樹（Camellia sinensis L.）作為中國重要的木本經(jīng)濟作物之一，在中國擁有悠久的栽培歷史。而由茶樹葉片加工而成的茶是世界三大無酒精飲料之一，富含大量生物活性成分。茶作為一種重要的保健飲品在全世界風靡，其保健功能與兒茶素、茶氨酸、咖啡堿等茶樹特征性代謝產(chǎn)物有關(guān)[1-2]，這些次生代謝成分在茶樹生長發(fā)育過程中產(chǎn)生，不僅影響到茶樹自身的生長發(fā)育和新陳代謝，也影響到成茶品質(zhì)和保健功能[3]。

兒茶素具有苦澀味，是茶樹特征次生代謝物質(zhì)之一，對茶的色、香、味等品質(zhì)具有重要作用。同時兒茶素也是茶保健功能的重要組成成分，具有降血脂[4]、降血壓[3]、增強免疫力、抗菌、抗氧化[5]、預(yù)防心血管疾病[6]等多種藥理作用。茶樹中主要有2種類型的兒茶素（非酯型兒茶素和酯型兒茶素），其中非酯型兒茶素包括兒茶素（Catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）。酯型兒茶素有2種，分別為表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin-3-gallate，ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）[7]。酯型兒茶素是茶湯苦澀味的主要來源，其中EGCG含量最高，抗氧化能力也最強 [8]，為茶中特色成分。

茶氨酸是植物中罕有的非蛋白氨基酸，也是茶樹特有的次級代謝產(chǎn)物，占茶樹游離氨基酸含量的40%～70%，占茶葉干質(zhì)量的1%～2%[9]。迄今茶氨酸只在山茶科植物和蕈中[10-11]被檢測出，且含量少[12]。茶氨酸作為茶樹特征性成分之一，具有獨特的鮮爽味，可以緩解茶湯的苦澀味，增加其甜味，極大地影響茶湯品質(zhì)，也是鑒定綠茶品質(zhì)的一項重要標準。此外，茶氨酸具有抗腫瘤、抗疲勞、降血壓、鎮(zhèn)靜安神[13-15]和提高記憶力[6]等多種保健功能，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[16-17]。研究結(jié)果表明，茶氨酸主要在茶樹根部合成，再從根部運輸至芽、葉并積累[18]。

茶樹中主要含有3種嘌呤堿，分別為咖啡堿、可可堿和茶葉堿，其中咖啡堿含量最高，約占茶葉干質(zhì)量的2%～5%[19]，在茶樹芽中的含量較高?？Х葔A是具有苦味的植物嘌呤堿，是茶樹重要的次生代謝產(chǎn)物之一，也是影響茶湯滋味品質(zhì)的主要成分之一，具有興奮、利尿、解乏、增加心血管系統(tǒng)活動、抗菌和提高思維效率等保健作用。

植物生長的自然環(huán)境復(fù)雜多變，因此植物會根據(jù)自然環(huán)境變化調(diào)控體內(nèi)特定基因的表達以提高對環(huán)境的適應(yīng)性。植物中各種誘導(dǎo)型基因的表達主要受特定轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育及其對外界環(huán)境的反應(yīng)中起重要作用。轉(zhuǎn)錄因子（反式作用因子）能與啟動子中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，從而激活或抑制轉(zhuǎn)錄[20]。茶樹三大代謝物相關(guān)的研究主要集中在活性成分提取鑒定以及合成途徑、基因克隆驗證等，關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其合成研究較少，近期有研究者在茶樹中鑒定并研究了 bHLH 的功能，發(fā)現(xiàn) bHLH 轉(zhuǎn)錄因子主要和茶樹抗性相關(guān)[21-22]。 而關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控茶樹次生代謝成分合成相關(guān)基因的報道較少，李明卓等[23]發(fā)現(xiàn)MYB 轉(zhuǎn)錄因子與茶樹黃酮類及木質(zhì)素合成相關(guān)，Wen等[24]對參與茶氨酸合成調(diào)控的 MYB 進行了研究，結(jié)果表明，MYB 與茶氨酸的積累呈負調(diào)控關(guān)系。本研究結(jié)合已發(fā)表的茶樹基因組數(shù)據(jù)[25]，利用茶樹全器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[26]重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，并對這些重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本進行鑒定及分析。同時鑒定與茶樹三大特征代謝物（兒茶素、茶氨酸、咖啡堿）合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并對這些轉(zhuǎn)錄因子基因進行克隆驗證。本研究利用重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本的新方法對茶樹基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，為利用茶樹基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供重要的參考方法，同時鑒定出的轉(zhuǎn)錄因子為進一步研究茶樹三大特征代謝物合成調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1參考基因組比對

對測序獲得的茶樹全器官原始測序數(shù)據(jù)（Raw reads）進行過濾，去除低質(zhì)量，包含接頭污染以及未知堿基氮含量高于5%的reads，獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)（Clean reads），并保存為FASTQ格式[27]，以保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果的可靠性。用HISAT軟件[28]將過濾后的Clean reads比對到茶樹參考基因組（http：//tpia.teaplant.org/download.html）。

1.2新轉(zhuǎn)錄本及其編碼能力預(yù)測

利用StringTie軟件[29]對方法1.1里獲得的數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)，之后用Cuffcompare 將重構(gòu)后的轉(zhuǎn)錄本與參考注釋信息進行比較分析，挑選 Class code 類型為u、i、o、j的轉(zhuǎn)錄本，定義為新轉(zhuǎn)錄本和新基因（即Novel gene，指原基因組未注釋到的基因）。將得到的新轉(zhuǎn)錄本和新基因用CPC[30]進行蛋白質(zhì)編碼能力預(yù)測，進一步鑒定可能具有蛋白質(zhì)編碼能力的新轉(zhuǎn)錄本和新基因，將預(yù)測具有蛋白質(zhì)編碼能力的新轉(zhuǎn)錄本和新基因加入到參考基因序列中進而補充茶樹基因組的基因注釋信息，獲得完整的參考序列信息。

1.3基因表達量分析

將具有蛋白質(zhì)編碼能力的新轉(zhuǎn)錄本和新基因與參考基因序列構(gòu)建成為完整的參考基因數(shù)據(jù)庫。使用Bowtie 2[31]將茶樹全器官Clean reads比對到參考序列，基于比對后的bam文件，使用RSEM軟件[32]計算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達水平。根據(jù)表達信息，使用R語言繪制箱線圖，展示茶樹全器官樣品基因表達水平的分布情況。

1.4差異表達基因檢測與樣品間差異表達基因分析

根據(jù)各個樣品基因表達水平檢測不同樣品間的差異表達基因。使用DEseq2算法對樣品進行差異表達基因分析（差異倍數(shù)≥2.00，Q≤0.05）。由于兒茶素、茶氨酸和咖啡堿主要集中在茶樹芽和幼嫩的葉片中，因此本研究以茶樹芽（CS-B）作為對照，分別與茶樹莖（CS-S）、茶樹根（CS-R）、茶樹花（CS-FL）、茶樹果實（CS-FR）進行比較，鑒定共有差異表達基因。同時，以茶樹第一葉（CS-L1）作為對照，分別與茶樹莖、茶樹花、茶樹根和茶樹果實進行比較，鑒定共有差異表達基因。最后，以茶樹根作為對照，分別與茶樹莖、茶樹花、茶樹芽、茶樹第一葉和茶樹果實進行比較，鑒定共有差異表達基因。采用RSEM軟件中的hclust 函數(shù)對樣品進行層次聚類分析，并繪制韋恩圖用來展示樣品間基因表達分布。

1.5兒茶素、茶氨酸和咖啡堿相關(guān)基因分析

兒茶素、茶氨酸和咖啡堿是茶中三大特征性代謝成分，因而本研究主要鑒定和篩選與三大特征代謝成分相關(guān)的基因。首先，根據(jù)鑒定到的差異表達基因，使用R語言的cor.test軟件包計算差異表達基因與兒茶素、茶氨酸和咖啡堿的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，篩選相關(guān)系數(shù)絕對值>7且P<0.05的基因作為候選基因。由于兒茶素在幼嫩芽、葉中含量較高，本研究進一步篩選在茶樹第一葉和茶樹芽中顯著差異表達的基因。同時，由于茶氨酸在茶樹根中含量較高，本研究進一步篩選在茶樹根中顯著差異表達的基因，繪制韋恩圖展示交集和并集的信息。

1.6兒茶素、茶氨酸和咖啡堿相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因克隆分析

為了鑒定得到與茶樹三大特征代謝成分相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在方法1.5的基礎(chǔ)上，結(jié)合TFDB[33]數(shù)據(jù)庫和iTAK [34]軟件，從三大特征代謝成分相關(guān)基因中鑒定得到轉(zhuǎn)錄因子。為了驗證本研究獲得的新基因的準確性，我們篩選了3個與兒茶素、茶氨酸和咖啡堿具有較高相關(guān)性的轉(zhuǎn)錄因子進行驗證，分別為TEAnew241900002、TEAnew379700001、TEAnew185700003，并分別對3個候選轉(zhuǎn)錄因子基因進行克隆驗證和分析。

1.6.1總RNA提取取0.2 g茶樹樣品，按照Tai等[12]的方法提取茶樹總RNA。提前將交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）加入預(yù)冷的研缽中，加入組織樣品后液氮磨成粉末，取適量粉末加入已加入600 μl Buffer RLB和30 μl β-巰基乙醇的離心管中。加入50 μl Plantaid混勻，然后參考天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep pure Plant Kit試劑盒說明書操作，用瓊脂糖凝膠電泳對總 RNA 完整性進行檢測。

1.6.2目的基因克隆及分析用TransScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒對獲得的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)篩選的候選基因，結(jié)合NCBI確定候選基因的ORF框，采用Primer 5軟件設(shè)計引物（表1），采用PCR方法進行擴增。PCR反應(yīng)體系為20.0 μl，分別為10×PCR Buffer 2.0 μl，dNTP Mixture 2.5 μl，上下游引物各0.8 μl，25 mmol/L MgSO4 1.5 μl，KOD酶 0.5 μl，添加dd H2O至20.0 μl。PCR程序：94 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，68 ℃ 10 min，16 ℃保存，設(shè)置30個循環(huán)，PCR后，用瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳檢測目的片段。利用膠回收試劑盒對獲得的PCR產(chǎn)物進行純化，用克隆載體pEASY-Blunt Zero進行連接，轉(zhuǎn)至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞培養(yǎng)并篩選陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進行基因測序，用 DNAMAN、Bioedit、seqMan 等軟件對測序結(jié)果進行分析，并與 NCBI 進行 Blast 分析，確認是否獲得完整的 ORF框。

2結(jié)果與分析

2.1參考基因組比對

利用HISAT軟件將Clean reads 比對到參考基因組序列（表2）。每個樣品的平均比對率均大于84%，唯一比對率均大于63%，說明測序結(jié)果較好，符合進一步分析的要求。

2.2新轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)及編碼能力預(yù)測

將與參考基因組比對后的樣品進行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)和注釋[35]，共獲得81 045個新轉(zhuǎn)錄本。其中具有蛋白質(zhì)編碼能力的新轉(zhuǎn)錄本有50 111個，不具有蛋白質(zhì)編碼能力的新轉(zhuǎn)錄本有30 934個，在茶樹基因組中，已有基因的新轉(zhuǎn)錄本有34 155個，新基因轉(zhuǎn)錄本有15 956個。

2.3基因表達量分析

將茶樹各器官樣品的Clean reads 通過Bowtie2比對到參考序列。采用箱線圖（圖1）展示各樣品基因表達水平的分布情況，log2（FPKM）值大小可表示表達量的高低。圖1表明，茶樹各器官新鑒定的轉(zhuǎn)錄本的表達量都低于已知轉(zhuǎn)錄本，表明基因組裝的時候?qū)τ诒磉_量較高的轉(zhuǎn)錄本的組裝效果較好，而對于一些表達量低或者組織特異表達的基因鑒定效果較差，利用轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)的方法可以鑒定出表達量較低的轉(zhuǎn)錄本。

A：茶樹芽中已有的基因;B：茶樹芽中新鑒定的基因;C：茶樹第一葉中已有的基因;D：茶樹第一葉中新鑒定的基因;E：茶樹第二葉中已有的基因;F：茶樹第二葉中新鑒定的基因;G：茶樹第三葉中已有的基因;H：茶樹第三葉中新鑒定的基因;I：茶樹莖中已有的基因;J：茶樹莖中新鑒定的基因;K：茶樹根中已有的基因;L：茶樹根中新鑒定的基因;M：茶樹花中已有的基因;N：茶樹花中新鑒定的基因;O：茶樹果實中已有的基因;P：茶樹果實中新鑒定的基因。

2.4差異表達基因檢測

根據(jù)茶樹各器官樣品基因表達水平，可以檢測樣品之間的差異表達基因，檢測結(jié)果見圖2。以茶樹花作為對照，分別將茶樹芽、茶樹第一葉、茶樹根與茶樹花做差異表達基因分析。其中茶樹花和茶樹芽比較組上調(diào)表達的差異基因個數(shù)最多（13 042個），其次為茶樹花和茶樹第一葉比較組（12 140個）和茶樹第三葉和茶樹根比較組（11 836個）。下調(diào)表達的差異基因個數(shù)最多的為茶樹莖和茶樹根比較組（10 589個），其次為茶樹第二葉和茶樹根比較組（9 418個）、茶樹第一葉和茶樹根比較組（9 064個）。

由于兒茶素和咖啡堿在茶樹芽中含量最高，在茶樹的其他器官中含量較低。因此將茶樹芽中與茶樹根、茶樹花、茶樹莖、茶樹果實中的差異表達基因分別進行比較，鑒定出的共有差異表達基因命名為DEG-CS-B。采用R語言軟件包進行統(tǒng)計分析，對樣品組的差異表達基因進行層次聚類分布，用韋恩圖來表示樣品間差異表達基因的分布（圖3A），獲得3 859個共同差異表達基因，茶樹第一葉中兒茶素和咖啡堿的含量僅次于芽，以茶樹第一葉與其他器官中差異表達基因進行比較， 鑒定共有差異表達基因命名為DEG-CS-L1，以韋恩圖展示樣品間差異表達基因的分布（圖3B）。茶氨酸在茶樹根中的含量最高，以根作為對照，分別用茶樹根與其他器官進行比較，采用R語言軟件分析統(tǒng)計，繪制韋恩圖來表示樣品間的差異表達基因分布（圖3C）， 鑒定出的共有差異表達基因命名為DEG-CS-R。獲得5 540個共同差異表達基因。

a：茶樹花和茶樹芽比較組;b：茶樹花和茶樹第一葉比較組;c：茶樹花和茶樹根比較組;d：茶樹果實和茶樹芽比較組;e：茶樹果實和茶樹第一葉比較組;f：茶樹果實和茶樹根比較組;g：茶樹第一葉和茶樹根比較組;h：茶樹第二葉和茶樹芽比較組;i：茶樹第二葉和茶樹第一葉比較組;j：茶樹第二葉和茶樹根比較組;k：茶樹第三葉和茶樹芽比較組;l：茶樹第三葉和茶樹第一葉比較組;m：茶樹第三葉和茶樹根比較組;n：茶樹根和茶樹芽比較組;o：茶樹根和茶樹第一葉比較組;p：茶樹莖和茶樹芽比較組;q：茶樹莖和茶樹第一葉比較組;r：茶樹莖和茶樹根比較組。

A：茶樹芽與茶樹根、茶樹花、茶樹莖、茶樹果實差異表達基因比較分析;B：茶樹第一葉與茶樹根、茶樹花、茶樹果實、茶樹莖差異表達基因比較分析;C：茶樹根與茶樹第一葉、茶樹花、茶樹果實、茶樹莖差異表達基因比較分析。CS-FL-VS-CS-B：茶樹花和茶樹芽比較組;CS-S-VS-CS-B：茶樹莖和茶樹芽比較組;CS-R-VS-CS-B：茶樹根和茶樹芽比較組;CS-FR-VS-CS-B：茶樹果實和茶樹芽比較組;CS-FL-VS-CS-L1：茶樹花和茶樹第一葉比較組;CS-S-VS-CS-L1：茶樹莖和茶樹第一葉比較組;CS-R-VS-CS-L1：茶樹根和茶樹第一葉比較組;CS-FR-VS-CS-L1：茶樹果實和茶樹第一葉比較組;CS-FL-VS-CS-R：茶樹花和茶樹根比較組;CS-FR-VS-CS-R：茶樹果實和茶樹根比較組;CS-S-CS-R：茶樹莖和茶樹根比較組。

2.5與兒茶素、茶氨酸和咖啡堿合成相關(guān)的差異表達基因分析

首先，通過相關(guān)性分析，獲得與兒茶素、茶氨酸、咖啡堿具有相關(guān)性的差異表達基因。

由于茶樹芽與第一葉中兒茶素含量較高，本研究進一步篩選CatechinCor（與兒茶素合成相關(guān)的基因）且屬于DEG-CS-L1和DEG-CS-B的基因，獲得與兒茶素具有相關(guān)性且在芽和第一葉中顯著差異表達的基因，這些基因可能在茶樹的兒茶素積累中起到作用（圖4A）。與兒茶素合成相關(guān)的共有差異表達基因1 781個，芽中與兒茶素合成相關(guān)基因2 734個，第一葉中與兒茶素合成相關(guān)基因2 672個。芽中與兒茶素合成相關(guān)基因略高于第一葉，而芽中的兒茶素含量也略高于第一葉，推測這些差異表達基因可能與兒茶素合成代謝相關(guān)，且與兒茶素合成代謝相關(guān)的差異表達基因越多，兒茶素的含量也越高。

茶樹中，根中的茶氨酸含量最高，篩選TheanineCor（與茶氨酸合成相關(guān)的基因）且屬于DEG-CS-R的基因，獲得跟茶氨酸合成相關(guān)的基因且在根中顯著差異表達的基因（圖4B）。與茶氨酸合成相關(guān)的共有的差異表達基因有3 275個。

A：兒茶素與DEG-CS-L1相關(guān)性分析;B：茶氨酸與DEG-CS-R相關(guān)性分析;C：咖啡堿與DEG-CS-B和DEG-CS-L1相關(guān)性分析。DEG-CS-L1：茶樹第一葉差異基因;DEG-CS-B：茶樹芽差異基因;CatechinCor：與兒茶素相關(guān)的基因;DEG-R：茶樹根差異基因;TheanineCor：與茶氨酸相關(guān)基因;DEG-CS-B：茶樹芽差異基因;DEG-CS-L1：茶樹第一葉差異基因;CaffeineCor：與咖啡堿相關(guān)基因。

茶樹芽中咖啡堿含量最高，其次為第一葉，因此，篩選CaffeineCor（與咖啡堿合成相關(guān)的基因）且屬于的DEG-CS-L1和DEG-CS-B的基因，獲得與咖啡堿合成相關(guān)的基因且在芽和第一葉中顯著差異表達的基因（圖4C）。分析獲得與咖啡堿合成相關(guān)的共有差異表達基因1 220個。芽中與咖啡堿合成相關(guān)基因有1 827個，第一葉中與咖啡堿合成相關(guān)基因有1 412個。芽中與咖啡堿代謝有關(guān)的基因高于第一葉，而芽中咖啡堿含量高于第一葉，推測這些差異表達基因可能與咖啡堿合成代謝相關(guān)，且與咖啡堿合成代謝相關(guān)的差異表達基因越多，咖啡堿含量也越高。

2.6與茶樹中兒茶素、茶氨酸和咖啡堿合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

對篩選得到的與兒茶素、茶氨酸和咖啡堿合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進行分析和鑒定，結(jié)果（圖5）表明，與兒茶素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多，其次為茶氨酸，與咖啡堿合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最少。其中AP2/ERF-ERF、MYB、C2H2、WRKY和bHLH等轉(zhuǎn)錄因子在三大代謝成分相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子中占的比例較高。

與兒茶素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有AP2/ERF-ERF、MYB、C2H2、WRKY和bHLH，與茶氨酸合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有AP2/ERF-ERF、MYB、WRKY、GRAS和C2H2，與咖啡堿合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有bHLH、MYB、WRKY、TCP和C2H2。在與兒茶素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子中，鑒定了注釋為WRKY、MYB和bHLH的新轉(zhuǎn)錄因子，在與茶氨酸合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子中，鑒定了注釋為WRKY、NAC、MYB、MADS-M-type、MADS-MIKC、LOB、GRAS、FAR1、C2H2、C2C2-Dof、bZIP、bHLH和AP2/ERF-ERF的新轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子與茶樹三大代謝物密切相關(guān)。本研究進一步分析了這些新轉(zhuǎn)錄因子并注釋其功能，并篩選新轉(zhuǎn)錄因子進行功能驗證（表3）。

2.7與兒茶素，茶氨酸和咖啡堿合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆驗證

通過PCR方法克隆獲得與茶樹中兒茶素，茶氨酸和咖啡堿合成相關(guān)的3條轉(zhuǎn)錄因子[TEAnew379700001（WAKY）、TEAnew185700003（bZIP）、TEAnew241900002（BES）]基因，其ORF框大小分別為1 011 bp，1 692 bp和867 bp，分別編碼336個，563個和288個氨基酸（圖6）。分別將克隆獲得的3個轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的氨基酸序列與通過轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)方法獲得的序列進行比較，發(fā)現(xiàn)其相似度均大于99% （圖 7），其中BES的相似度為100%，表明，轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)獲得新轉(zhuǎn)錄本的方法準確度較高。

3討論

茶具有特殊的滋味和香氣，同時具有多種保健功能，其保健功能主要和茶樹活性次級代謝物相關(guān)，如兒茶素、茶氨酸和咖啡堿等[36-37]，這3種成分作為茶葉的特征性代謝產(chǎn)物而受到廣泛關(guān)注。本研究主要利用已有的茶樹轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，對茶樹轉(zhuǎn)錄本進行重構(gòu)，鑒定新轉(zhuǎn)錄本，同時結(jié)合兒茶素，茶氨酸和咖啡堿在茶樹根、莖、葉等器官中的含量差異，分別建立兒茶素、茶氨酸和咖啡堿與茶樹轉(zhuǎn)錄本的相關(guān)性，鑒定與茶樹三大特征代謝成分相關(guān)的關(guān)鍵酶基因及轉(zhuǎn)錄因子。

對于茶樹中兒茶素、茶氨酸和咖啡堿的研究主要集中在成分含量檢測，關(guān)鍵酶基因的克隆及不同器官、不同品種的茶樹轉(zhuǎn)錄組測序。兒茶素合成途徑中一些關(guān)鍵酶已基本被克隆[38]，與兒茶素合成途徑有關(guān)的其他基因也相繼被報道[39]。茶氨酸合成途徑中相關(guān)酶的研究不多，且參與茶氨酸合成的酶大多較不穩(wěn)定，分離純化和酶活性檢測技術(shù)的欠缺，使得與茶氨酸合成途徑相關(guān)的酶的研究仍在初級階段?，F(xiàn)今對茶樹中兒茶素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MYB和bHLH已有研究，但茶氨酸和咖啡堿相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子研究較少。本研究結(jié)果表明，與兒茶素和咖啡堿合成相關(guān)的基因在茶樹芽和第一葉中數(shù)量較高，而與茶氨酸合成相關(guān)的基因在茶樹根中數(shù)量最高，這些結(jié)果與以往的研究結(jié)果[12，39]一致。

利用茶樹全器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，將得到的新轉(zhuǎn)錄本通過已發(fā)表的茶樹基因組數(shù)據(jù)進行鑒定及分析，鑒定出與茶樹兒茶素、茶氨酸和咖啡堿合成相關(guān)的新轉(zhuǎn)錄本及轉(zhuǎn)錄因子，同時對鑒定重構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子基因進行克隆驗證。轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)的方法，能夠鑒定出基因組組裝過程中沒有鑒定到的基因，或者組織器官特異表達的轉(zhuǎn)錄本，對與茶樹中兒茶素、茶氨酸和咖啡堿合成相關(guān)的基因進行了補充，也為進一步研究茶樹次生代謝及基因功能提供了大量的數(shù)據(jù)支撐。通過對篩選的轉(zhuǎn)錄因子基因進行克隆，再次對重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本方法進行驗證。

參考文獻：

[1]LIANG Y R， MA W Y， LU J L， et al. Comparison of chemical compositions of Ilex latifolia Thumb and Camellia sinensis L.[J]. Food Chemistry， 2001， 75（3）： 339-343.

[2]MAMATI G E， LIANG Y R， LU J L. Expression of basic genes involved in tea polyphenol synthesis in relation to accumulation of catechins and total tea polyphenols [J]. Journal of the Science of Food & Agriculture， 2010， 86（3）： 459-464.

[3]SUEOKA N， SUGANUMA M， SUEOKA E， et al. A new function of green tea： prevention of lifestyle-related diseases [J]. Annals of the New York Academy of Sciences， 2010， 928（1）： 274-280.

[4]THIELECKE F， BOSCHMANN M. The potential role of green tea catechins in the prevention of the metabolic syndrome-a review [J]. Phytochemistry， 2009， 70（1）： 11-24.

[5]YANG L， COLDITZ G A. Prevalence of overweight and obesity in the United States， 2007-2012 [J]. Jama Internal Medicine， 2015， 175（8）： 1412.

[6]林智，呂海鵬，張盛. 茶葉活性成分的化學(xué)和藥理作用 [J]. 中國茶葉， 2018， 40（11）： 1-6.

[7]YANG C S， CHEN G， WU Q. Recent scientific studies of a traditional chinese medicine， tea， on prevention of chronic diseases [J]. Journal of Traditional & Complementary Medicine， 2014， 4（1）： 17-23.

[8]方芳，崔志清，韓永晶. 茶兒茶素的藥效研究概況 [J]. 中草藥， 2000， 31（5）： 396-398.

[9]楊洲. 茶氨酸保健作用研究進展 [J]. 茶葉通訊， 2018， 45（2）：3-7.

[10]CHUNG F L， SCHWARTZ J， HERZOG C R， et al. Tea and cancer prevention： studies in animals and humans [J]. Journal of Nutrition， 2003， 133（10）： 3268.

[11]LI J， LI P， LIU F. Production of theanine by Xerocomus badius （mushroom） using submerged fermentation [J]. LWT - Food Science and Technology， 2008， 41（5）： 883-889.

[12]TAI Y L， WEI C L， YANG H， et al. Transcriptomic and phytochemical analysis of the biosynthesis of characteristic constituents in tea （ Camellia sinensis ） compared with oil tea （ Camellia oleifera ） [J]. Bmc Plant Biology， 2015， 15（1）： 190.

[13]ZHANG G Y， MIURA Y， YAGASAKI K. Effects of dietary powdered green tea and theanine on tumor growth and endogenous hyperlipidemia in hepatoma-bearing rats [J]. Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan， 2002， 66（4）： 711-716.

[14]譚俊峰，林智，彭群華，等. 茶氨酸復(fù)合制劑緩解體力疲勞功能評價 [J]. 茶葉科學(xué)， 2012， 32（6）： 530-534.

[15]林偉東，孫威江，郭義紅，等. 茶葉中茶氨酸的研究與利用 [J]. 食品研究與開發(fā)， 2016， 37（20）： 201-206.

[16]張瑩，施兆鵬，施玲. 茶氨酸的研究進展 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2003， 15（4）： 369-372.

[17]林雪玲，程朝輝，黃才歡，等. 茶氨酸對小鼠學(xué)習記憶能力的影響 [J]. 食品科學(xué)， 2004（5）： 171-173.

[18]HO K， KATO T， XU H L. Transport of nitrogen assimilation in xylem vessels of green tea plants fed with NH+4-N and NO-3-N[J]. Pedosphere， 2008， 18（2）： 222-226.

[19]LIU Y J， GAO L P， TAO X， et al. Investigation of the site-specific accumulation of catechins in the tea plant （Camellia sinensis （L.） O. Kuntze） via vanillin-HCl staining [J]. Journal of agricultural and food chemistry， 2009， 57（21）： 10371-10376.

[20]劉強，張貴友. 植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與調(diào)控作用 [J]. 科學(xué)通報， 2000， 45（14）： 1465-1474.

[21]CUI X， WANG Y X， LIU Z W， et al. Transcriptome-wide identification and expression profile analysis of the bHLH family genes in Camellia sinensis [J]. Functional & Integrative Genomics， 2018， 18（5）： 489-503.

[22]韓永濤. 茶樹CsbHLH2基因克隆及功能分析 [D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2015.

[23]李明卓. 茶樹CsMYB4a轉(zhuǎn)錄因子以及靶基因Cs4CLs的功能驗證 [D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[24]WEN B B， LUO Y， LIU D M， et al. The R2R3-MYB transcription factor CsMYB73 negatively regulates l -Theanine biosynthesis in tea plants （ Camellia sinensis L.） [J]. Plant Science， 2020， 298： 110546.

[25]WEI C L， YANG H， WANG S B， et al. Draft genome sequence of Camellia sinensis var. sinensis provides insights into the evolution of the tea genome and tea quality [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2018， 115（18）： 4151-4158.

[26]TAI Y L， LIU C， YU S W， et al. Gene co-expression network analysis reveals coordinated regulation of three characteristic secondary biosynthetic pathways in tea plant （Camellia sinensis） [J]. Bmc Genomics， 2018， 19（1）： 616.

[27]COCK P J A， FIELDS C J， NAOHISA G， et al. The sanger FASTQ file format for sequences with quality scores， and the Solexa/Illumina FASTQ variants [J]. Nucleic Acids Research， 2009， 38（6）： 1767-1771.

[28]DAEHWAN K， BEN L， SALZBERG S L. HISAT： a fast spliced aligner with low memory requirements [J]. Nature Methods， 2015， 12（4）： 357-360.

[29]PERTEA M， KIM D， PERTEA G M， et al. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT， StringTie and Ballgown [J]. Nature Protocols， 2016， 11（9）： 1650.

[30]LEI K， YONG Z， ZHI Q Y， et al. CPC： assess the protein-coding potential of transcripts using sequence features and support vector machine [J]. Nucleic Acids Research， 2007， 35： 345.

[31]LANGDON B W. Performance of genetic programming optimised Bowtie2 on genome comparison and analytic testing （GCAT） benchmarks [J]. Biodata Mining， 2015， 8（1）： 1.

[32]MIHAELA P， PERTEA G M， ANTONESCU C M， et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads [J]. Nature Biotechnology， 2015， 33（3）： 290-295.

[33]JIN J P， TIAN F， YANG D C， et al. PlantTFDB 4.0： toward a central hub for transcription factors and regulatory interactions in plants [J]. Nucleic Acids Research， 2017， 45（1） ：1040-1045.

[34]ZHENG Y， JIAO C， SUN H H，et al. iTAK： a program for genome-wide prediction and classification of plant transcription factors， transcriptional regulators， and protein kinases. [J]. Molecular Plant， 2016， 9（12）：1667-1670.

[35]SHIHAO S， JUW WON P， ZHI-XIANG L， et al. rMATS： robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2014， 111（51）： 5593-5601.

[36]劉文靜，傅建煒，何明燕. 福建3類陳年老茶有機酸組分及含量比較分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（20）：224-229.

[37]楊轉(zhuǎn)，劉玉飛，郭桂義，等. 黃金葉與信陽群體種信陽毛尖茶的感官品質(zhì)與化學(xué)成分比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（20）：206-208，217.

[38]馬春雷，陳亮. 茶樹功能基因分離克隆研究進展 [J]. 分子植物育種， 2006， 4（1）： 16-22.

[39]XIONG L G， LI J， LI Y H， et al. Dynamic changes in catechin levels and catechin biosynthesis-related gene expression in albino tea plants （ Camellia sinensis L.） [J]. Plant Physiol Biochem， 2013， 71（71）： 132-143.

（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-08-19

基金項目：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)青年基金項目（2016ZR012）

作者簡介：邰玉玲（1987-），女，山東臨沂人，博士，副教授，主要從事植物次生代謝及分子生物學(xué)研究。（Tel） 13335655226;（E-mail）taiyuling1102@126.com。楊林為共同第一作者。