徐淮地區(qū)7個(gè)甘薯莖線蟲群體的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

陳晶偉，馬居奎，張成玲，楊冬靜，唐偉，謝逸萍，孫厚俊

摘要：從江蘇省徐淮地區(qū)7個(gè)采集地的甘薯塊根中分離到7個(gè)甘薯莖線蟲群體，通過形態(tài)學(xué)鑒定，其特征與已報(bào)道的腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）基本一致。利用rDNA-內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物、腐爛莖線蟲特異性引物檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)群體JSXZ為B（L）型，其余6個(gè)分離群體均為A（S）型腐爛莖線蟲。結(jié)合ITS-5.8S-ITS2區(qū)序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果進(jìn)一步表明，所獲序列與腐爛莖線蟲相似性最高，且各分離群體與徐淮地區(qū)已報(bào)道的相同基因型的腐爛莖線蟲群體序列相似性均在99%以上。群體JSXZ沒有與腐爛莖線蟲A型、B型群體聚在一起，而是與C型、D型群體聚為1個(gè)分支，且和C型親緣關(guān)系更近，所以群體JSXZ被鑒定為C型腐爛莖線蟲;群體JSWJ、JSYJ、JSGS、JSHW、JSLQ和JSNG與A型腐爛莖線蟲群體聚為1個(gè)分支，均為A型腐爛莖線蟲，且與其他基因型區(qū)分明顯。危害徐淮地區(qū)甘薯的腐爛莖線蟲親緣關(guān)系近，基因型種類多，存在A型、B型和C型，其中A型腐爛莖線蟲為優(yōu)勢(shì)群體。

關(guān)鍵詞：甘薯;腐爛莖線蟲;鑒定;系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號(hào)：S432.4+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2021）06-1409-08

Morphological and molecular biology identification of seven stem nematode populations of sweet potato in Xuhuai area

CHEN Jing-wei，MA Ju-kui，ZHANG Cheng-ling，YANG Dong-jing，TANG Wei，XIE Yi-ping，SUN Hou-jun

（Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area of Jiangsu/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Sweet Potato of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xuzhou 221131， China）

Abstract：Seven populations of sweet potato stem nematodes were isolated from storage roots of sweet potatoes from seven regions in Xuhuai area of Jiangsu province. Characteristics of the stem nematodes were basically identical to Ditylenchus destructor reported previously through morphological identification. By detections using universal primers of rDNA- internal transcribed spacer （ITS） region and specific primers of D. destructor， it was found that population JSXZ belonged to B（L） type of D. destructor， while the other six isolated populations all belonged to A（S） type of D. destructor. The results further suggested that， the sequences of the stem nematodes shared the highest similarity with D. destructor though sequences analysis of ITS-5.8S-ITS2 region and phylogenetic tree construction， and sequence similarity of the separated populations compared with the D. destructor populations carrying the same genotype reported in Xuhuai area were all above 99%. Results of phylogenetic tree analysis showed that population JSXZ did not cluster into one branch with type A and type B populations of D. destructor， but clustered into one branch with type C and type D populations of D. destructor， and had closer affinity with type C. Therefore， JSXZ population from the sweet potato was confirmed as type C of D. destructor. Populations of JSWJ， JSYJ， JSGS， JSHW， JSLQ and JSNG were clustered into one branch with population of type A of D. destructor， which were all confirmed as type A of D. destructor and were clearly distinguished from other genotypes. It was indicated that populations of D. destructor which harmed sweet potatoes in Xuhuai area were closely related and had various genotypes， such as type A， type B and type C， among which type A was the dominant population.

Key words：sweet potato;Ditylenchus destructor;identification;phylogenetic tree

莖線蟲病害嚴(yán)重威脅中國(guó)甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其病原物為腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor），最早在馬鈴薯（Solanum tuberosum）上被發(fā)現(xiàn)，故也稱Potato nematode[1]。國(guó)內(nèi)腐爛莖線蟲首先發(fā)現(xiàn)于甘薯（Ipomoea batatas）中，主要侵染貯藏根并引起腐爛，造成糠心或糠皮等癥狀，危害嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致減產(chǎn)80%以上，乃至絕收[2-3]。隨后，又在馬鈴薯及一些中藥材上發(fā)現(xiàn)其危害[4-5]。現(xiàn)已被亞太植物保護(hù)組織及許多國(guó)家和地區(qū)列為植物檢疫性有害生物[6]。

線蟲形態(tài)特征復(fù)雜且有相似的特點(diǎn)，僅依靠形態(tài)學(xué)鑒定，難以在種水平及基因型上進(jìn)行區(qū)分，因此分子生物學(xué)檢測(cè)已成為研究植物寄生線蟲的常用手段[7]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，腐爛莖線蟲存在種內(nèi)分化的現(xiàn)象，如王金成等[8]、黃健等[9]、章淑玲等[10]分析了國(guó)內(nèi)不同腐爛莖線蟲群體的rDNA-內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列后發(fā)現(xiàn)，中國(guó)的腐爛莖線蟲明顯存在2種基因型，即A（S）型和B（L）型。宛菲等[11]根據(jù)腐爛莖線蟲rDNA-ITS區(qū)分別設(shè)計(jì)了針對(duì)這2種基因型的特異性引物，并準(zhǔn)確檢測(cè)出國(guó)內(nèi)6個(gè)省（市、區(qū)）的21個(gè)甘薯腐爛莖線蟲群體的基因型。國(guó)外學(xué)者也深入研究了腐爛莖線蟲群體分化的現(xiàn)象，如Subbotin等[12]對(duì)世界范圍內(nèi)不同寄主植物的腐爛莖線蟲群體的rDNA-ITS區(qū)序列進(jìn)行分析比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，不同線蟲群體之間ITS1-5.8S-ITS2序列長(zhǎng)度的變異源自ITS1區(qū)存在的重復(fù)序列，且該重復(fù)序列能在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成穩(wěn)定的莖環(huán)，在保留A（S）型的基礎(chǔ)上，將B（L）型進(jìn)一步細(xì)分為B～G 6種不同的基因型。Jeszke等[13]結(jié)合NCBI已發(fā)表的腐爛莖線蟲rDNA-ITS區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定出波蘭3個(gè)不同地區(qū)腐爛莖線蟲分離種群均為C基因型?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)危害甘薯的腐爛莖線蟲基因型有A型、B型、C型、E型和F型[10，12，14]。

甘薯對(duì)于帶動(dòng)區(qū)域農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著舉足輕重的作用，且已成為國(guó)內(nèi)許多省份及地區(qū)調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、促進(jìn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展的重要農(nóng)作物之一[15-16]。目前，甘薯莖線蟲病害在中國(guó)北方薯區(qū)春作地發(fā)生嚴(yán)重[2]。江蘇省甘薯產(chǎn)業(yè)總體發(fā)展態(tài)勢(shì)良好，但甘薯莖線蟲病害嚴(yán)重制約甘薯單位面積產(chǎn)量的提升，阻礙甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本研究針對(duì)江蘇省徐淮地區(qū)不同甘薯莖線蟲分離群體進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并基于rDNA-ITS區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以明確線蟲危害種類及系統(tǒng)發(fā)育地位，為甘薯莖線蟲病害的快速診斷和防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2019-2020年，對(duì)江蘇省徐淮地區(qū)7個(gè)線蟲危害嚴(yán)重的薯田進(jìn)行樣品采集，并拍攝記錄田間甘薯受害癥狀。采用隨機(jī)采樣法，將受害薯塊裝入聚乙烯薄膜自封袋內(nèi)，并標(biāo)記采集時(shí)間、地點(diǎn)、前茬作物及土壤類型等信息，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步分離與鑒定。DdSH、DdTS、DdXY、DEsg為江蘇徐淮地區(qū)已報(bào)道的甘薯上的腐爛莖線蟲群體[8，11]（表1）。

1.2線蟲的分離與純化

將病薯切成碎屑，利用淺盤法分離線蟲[1]。獲得線蟲后，用0.1%青霉素+0.1%鏈霉素浸泡，4 ℃下放置12 h消毒，用無菌水清洗3遍后保存?zhèn)溆谩Ｔ隗w式顯微鏡下挑取已消毒的雌蟲和雄蟲各50頭放入茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）培養(yǎng)皿中進(jìn)行純化培養(yǎng)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3線蟲的形態(tài)觀察和測(cè)量

線蟲的殺死、TAF固定、臨時(shí)玻片制作均參照文獻(xiàn)[17]。通過配備Leica相機(jī)（DFC550）的顯微鏡（Leica DM4000B）觀察制作的線蟲臨時(shí)玻片。使用相機(jī)配套軟件進(jìn)行拍攝并記錄各蟲態(tài)形態(tài)特征圖片;形態(tài)測(cè)量值利用配套軟件，按照De Man公式[17]進(jìn)行測(cè)量計(jì)算，即a=體長(zhǎng)/最大體寬;b=體長(zhǎng)/食道長(zhǎng)度（從頭到食道與腸結(jié)合處）;c=體長(zhǎng)/尾長(zhǎng);V=頭至陰門距離/體長(zhǎng)×100。每個(gè)特征值，觀察20個(gè)標(biāo)本。

1.4線蟲分子生物學(xué)鑒定

1.4.1DNA提取方法參考單條花生莖線蟲（D.arachis） DNA 提取方法[18]，用ddH2O把挑到的線蟲清洗干凈后，轉(zhuǎn)移至裝有8 μl ddH2O、1 μl 10×PCR buffter的PCR管內(nèi)，將PCR管在掌上離心機(jī)中快速離心后，放至液氮中浸泡約30 s，然后加1 μl蛋白酶K（1.2 mg/ml）到管內(nèi)。最后，將PCR管放置于PCR儀中于65 ℃溫育1.5 h，再于95 ℃放置10 min，取出放至室溫即可用于PCR擴(kuò)增或置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2PCR引物擴(kuò)增試驗(yàn)所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系為25.0 μl，其中模板DNA 2.0 μl，上游引物（10 μmol/L）1.0 μl，下游引物（10 μmol/L）1.0 μl，PCR Mix（Premix TaqTM，TaKaRa）12.5 μl，ddH2O 8.5 μl。

（1）rDNA-ITS序列擴(kuò)增。采用引物ITSP1/ITSP2（5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′，5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）擴(kuò)增[8]。反應(yīng)程序：94 ℃，4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

（2）特異性引物擴(kuò)增。A（S）型特異性引物為DdS1/DdS2（5′-TCGTAGATCGATGAAGAACGC-3′，5′-ATTATCTCGAGTGGGAGCGC-3′）;B（L）型特異性引物為DdL1/DdL2（5′-TTGTGTTTGCTGGTGCGCTTGT-3′，5′-GAGTGAGAGCGATGTCAACATTG-3′）[11]。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。

用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳確定目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4.3序列提交、分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建依據(jù)序列提交步驟將本試驗(yàn)所得序列上傳至GenBank，獲得序列號(hào)（表1）。采用MEGA 6.0和DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。采用jModelTest v.2.1.2AIC標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行最佳匹配替代模型估算[19]，采用DAMBE v.7.0.28軟件[20]進(jìn)行基因替代飽和度檢測(cè)。在CIPRES Science Gateway（www.phylo.org）[21]平臺(tái)上進(jìn)行在線序列分析。分別使用MrBayes 3.2.6 on XSEDE[22]和RAxML-HPC2 on XSEDE[23-24]進(jìn)行貝葉斯法與最大似然法分析。貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹分析采用GTR+I+G模式，運(yùn)算5 000 000代，每運(yùn)算100代對(duì)樹形進(jìn)行Markov chains采樣，剔除初始25%采樣;最大似然法分析采用GTRCAT模型，完成1 000次自展重復(fù)。采用Figtree v1.4.3和Adobe Illustrator CC在貝葉斯50%多數(shù)原則一致樹上標(biāo)注自展值和后驗(yàn)概率。

2結(jié)果與分析

2.1甘薯莖線蟲病主要癥狀特點(diǎn)

受病原線蟲危害的大田中，甘薯地上部分在生長(zhǎng)前期癥狀不明顯，癥狀在中后期顯現(xiàn)，薯蔓近地面的主蔓基部縱切后可見髓部呈黑褐色干腐樣，呈糠心狀，而發(fā)病嚴(yán)重的植株糠心可達(dá)薯蔓頂部，葉片逐步發(fā)黃，直至主蔓枯死（圖1A、圖1B、圖1C）。薯塊受害后大多表現(xiàn)為糠皮或糠心，喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值?？菲ば褪韷K表皮褪色泛青，有的還會(huì)出現(xiàn)凹陷或裂口，導(dǎo)致薯皮龜裂?？v切后可見皮下組織干腐變褐，呈圓環(huán)狀（圖1D、圖1E）?？沸男褪韷K的皮層與健康薯塊無差異，但是薯塊質(zhì)量顯著下降，切開后可見薯塊內(nèi)呈褐白相間的干腐癥狀（圖1F）。甘薯受害后期，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，糠皮和糠心會(huì)混合發(fā)生，并常伴隨真菌、細(xì)菌和螨類等二次侵染（圖1G）。

2.2甘薯莖線蟲形態(tài)學(xué)鑒定

雌蟲溫?zé)釟⑺篮罂梢娬麄€(gè)蟲體略向腹面彎曲（圖2A）。蟲體側(cè)區(qū)可見6條清晰側(cè)線（圖2C）。唇區(qū)平滑，頭區(qū)稍有縊縮，口針細(xì)直，口針基部球明顯，中食道球似紡錘形，瓣膜可見，排泄孔位于食道腸道連接處略靠上方，后食道腺覆蓋于腸道背面（圖2D）。陰門明顯，側(cè)面觀可見向外突起，后陰子宮囊明顯，長(zhǎng)約占肛陰距的2/3，尾略向腹面彎曲，末端圓滑（圖2F、圖2G）。

雄蟲溫?zé)釟⑺篮?，蟲體前端較為平直，尾端向腹面彎曲度大（圖2B）。交合刺發(fā)達(dá)，尾部側(cè)面可見交合刺向腹面彎曲，交合傘由交合刺前端延伸至尾長(zhǎng)約3/4處，尾端窄圓（圖2H、圖2I）。其余特征與雌蟲類似。

A：受害大田;B、C：甘薯地上莖部癥狀;D、E：糠皮型薯塊;F：糠心型薯塊;G：線蟲危害后期甘薯。

A：雌蟲蟲體;B：雄蟲蟲體;C：雌蟲側(cè)區(qū);D：雌蟲頭部與食道;E：雄蟲頭部與食道;F：雌蟲尾部腹面觀（箭頭示陰門位置）;G：雌蟲尾部側(cè)面觀;H：雄蟲尾部側(cè)面觀;I：雄蟲尾部腹面觀;標(biāo)尺，A～B：200 μm，C：25 μm，D～I(xiàn)：50 μm。

本研究中分離純化的甘薯線蟲群體的形態(tài)測(cè)量值見表2。由表2可知，部分線蟲分離群體與Thorne[25]記載的腐爛莖線蟲形態(tài)測(cè)量值存在一定差異，但與Goodey[26]的記載相符。根據(jù)主要蟲態(tài)的形態(tài)學(xué)特征和主要形態(tài)測(cè)量值，初步推斷各甘薯線蟲群體均為腐爛莖線蟲。

2.3分子生物學(xué)鑒定

2.3.1甘薯莖線蟲不同分離群體rDNA-ITS通用引物檢測(cè)結(jié)果分別以江蘇徐淮地區(qū)7個(gè)不同的甘薯莖線蟲總DNA為模板，采用通用引物ITSP1/ITSP2擴(kuò)增rDNA-ITS區(qū)序列，電泳結(jié)果表明，7個(gè)分離群體樣本中，除JSXZ群體擴(kuò)增出約1 000 bp條帶外，其余皆擴(kuò)增出約780 bp條帶（圖3），結(jié)合形態(tài)鑒定結(jié)果，推斷JSXZ群體可能為B（L）型腐爛莖線蟲，其余均為A（S）型腐爛莖線蟲。

2.3.2A（S）型和B（L）型特異性引物擴(kuò)增結(jié)果為進(jìn)一步確認(rèn)各分離群體基因型，針對(duì)江蘇徐淮地區(qū)不同甘薯莖線蟲分離群體，分別隨機(jī)挑取單頭成蟲提取DNA，使用特異性引物DdS1/DdS2與DdL1/DdL2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除JSXZ群體擴(kuò)增出485 bp條帶外，其余皆為252 bp，對(duì)照組沒有條帶（圖4），確定JSXZ群體為B（L）型腐爛莖線蟲，其余群體均為A（S）型腐爛莖線蟲。

2.3.3基于rDNA-ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及序列分析對(duì)采自江蘇徐淮地區(qū)甘薯莖線蟲的不同分離群體進(jìn)行靶標(biāo)基因的測(cè)定，通過NCBI中BLAST進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)本研究所有群體與GenBank中江蘇省內(nèi)腐爛莖線蟲群體序列相似性在99%～100%，獲取序列后上傳至GenBank，獲得序列登錄號(hào)，詳細(xì)信息見表1。依據(jù)比對(duì)結(jié)果篩選數(shù)據(jù)庫中17條不同基因型的腐爛莖線蟲序列，2條起絨草莖線蟲（D. dipsaci）序列，加上本試驗(yàn)獲得的7條序列，共26條序列，基于ITS1-5.8S-ITS2基因，采用貝葉斯和最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖5）表明所有D. destructor群體聚為一支，與2條D. dipsaci序列區(qū)分明顯。JSYJ（MW648334）、JSWJ（MW648340）、JSGS（MW648337）、JSHW（MW648338）、JSLQ（MW648339）和JSNG群體（MW648336）與已知A型腐爛莖線蟲群體聚為一支，表明該6個(gè)群體均為A型腐爛莖線蟲，與分子鑒定結(jié)果一致。其中，JSYJ群體與DdXY群體聚為一支，表明兩者遺傳距離較近。

JSXZ群體（MW648335）與A型、B型群體未聚在一起，而是與已知的C型群體（EF208210、EF062574、KX181650）和D型群體（EF208213）聚為一支。通過DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，JSXZ群體與已知的C型群體（EF208210、EF062574、KX181650）相似性均達(dá)99%以上，其中與宿遷市C型甘薯群體EF208210的序列在ITS1區(qū)第193 bp處有1個(gè)堿基替換。與C型馬鈴薯群體EF062574在ITS1區(qū)41 bp和363 bp處各有1個(gè)堿基替換，與C型馬鈴薯群體KX181650在ITS1區(qū)96 bp、126 bp、203 bp、215 bp和227 bp處各存在1個(gè)堿基替換。而與D型群體（EF208213）同源性僅為96%，在ITS區(qū)共存在29個(gè)堿基差異，分別在ITS1區(qū)存在2個(gè)堿基缺失、2個(gè)堿基插入以及25個(gè)堿基的替換。因此，JSXZ群體與3個(gè)C型群體親緣性更近，確定其為C型腐爛莖線蟲。

M：DL2000 DNA Marker;1～3：JSWJ群體;4～6：JSLQ群體;7～9：JSYJ群體;10～12：JSXZ群體;13～15：JSNG群體;16～18：JSGS群體;19～21：JSHW群體;22：清水對(duì)照。JSNG、JSHW、JSGS、JSLQ、JSWJ、JSYJ、JSXZ見表1。

M：DL2000 DNA Marker;1～3：JSWJ群體;4～6：JSLQ群體;7～9：JSYJ群體;10～12：JSXZ群體;13～15：JSNG群體;16～18：JSGS群體;19～21：JSHW群體;22：清水對(duì)照。JSNG、JSHW、JSGS、JSLQ、JSWJ、JSYJ、JSXZ見表1。

JSNG、JSHW、JSGS、JSLQ、JSWJ、JSYJ、JSXZ見表1。分支支持率：BI的后驗(yàn)概率估值/ML分析的自展值;拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不支持的自展值未標(biāo)出。

3討論

本研究應(yīng)用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)手段對(duì)江蘇徐淮地區(qū)主要甘薯產(chǎn)區(qū)的病原線蟲進(jìn)行了鑒定，對(duì)采集的7個(gè)甘薯線蟲群體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè)，其形態(tài)特征均與張紹升等[27]對(duì)腐爛莖線蟲的描述一致。部分群體測(cè)量值與Thorne[25]的原定種（正模）的參考值存在一定差異。對(duì)此，Goodey[26]、Wu等[28]認(rèn)為這可能是由于寄主的變化，使得線蟲的各測(cè)量值發(fā)生一定程度的變化，并定出比原定種（正模）測(cè)量數(shù)據(jù)范圍更廣的變異范圍，本研究所有測(cè)量數(shù)據(jù)均在此變異范圍內(nèi)。鑒于寄主或不同地理因素差異會(huì)導(dǎo)致線蟲形態(tài)數(shù)據(jù)的變異，應(yīng)注意每個(gè)測(cè)量值的觀測(cè)線蟲數(shù)目不應(yīng)過少。

目前，諸多研究結(jié)果已表明腐爛莖線蟲具有明顯的種內(nèi)分化現(xiàn)象，如Jones等[29]認(rèn)為腐爛莖線蟲存在寄主?；》N;王金成等[8]對(duì)8個(gè)腐爛莖線蟲種群ITS區(qū)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)腐爛莖線蟲的7個(gè)地理種群可明顯分為A、B 2個(gè)分支，A分支種群在ITS1區(qū)有188 bp片段的缺失，并推測(cè)腐爛莖線蟲在中國(guó)很可能是1個(gè)至少由2種線蟲組成的復(fù)合種。章淑玲等[10]設(shè)計(jì)引物對(duì)甘薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)中國(guó)的腐爛莖線蟲群體的ITS1區(qū)序列分化為短型（S）和長(zhǎng)型（L）2種基因型。宛菲等[11]設(shè)計(jì)并篩選出A（S）型、B（L）型腐爛莖線蟲的2對(duì)特異性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2，對(duì)甘薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行分析比對(duì)，將宿遷市甘薯莖線蟲群體（DdSH）和徐州市銅山區(qū)甘薯莖線蟲群體（DdTS）鑒定為B（L）型腐爛莖線蟲。Subbotin等[12]基于腐爛莖線蟲ITS1區(qū)中重復(fù)序列在RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異，并結(jié)合rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，在前人研究基礎(chǔ)上將腐爛莖線蟲劃分為A～G 7個(gè)基因型，并發(fā)現(xiàn)腐爛莖線蟲A（S）型特異性引物只能檢測(cè)出A基因型，B（L）型特異性引物可檢測(cè)出除A基因型之外的所有基因型，并將群體DdSH鑒定為腐爛莖線蟲C型群體，群體DdTS鑒定為腐爛莖線蟲B型群體。在本研究中，利用ITS通用引物和特異性引物對(duì)徐淮地區(qū)7個(gè)不同的分離種群進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明JSXZ群體為B（L）型腐爛莖線蟲群體，其余6個(gè)均為A（S）型腐爛莖線蟲群體，且各分離群體與徐淮地區(qū)已報(bào)道的相同基因型甘薯腐爛莖線蟲序列相似性均在99%以上。JSXZ群體與C型DdSH群體序列EF208210幾乎一致，僅在ITS1區(qū)有1個(gè)堿基替換。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果進(jìn)一步表明，6個(gè)A型腐爛莖線蟲群體與已知A型群體單獨(dú)聚為一支，JSXZ群體與DdSH群體及其他2個(gè)C型群體（EF062574、KX181650）聚為一支，最終將群體JSXZ鑒定為C型腐爛莖線蟲?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)危害甘薯的腐爛莖線蟲基因型有A型、B型、C型、E型和F型[10，12，14]，本研究結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道表明危害徐淮地區(qū)甘薯的腐爛莖線蟲基因型種類較豐富，存在A～C 3種基因型，A型為優(yōu)勢(shì)種群。這與于海英等[30]調(diào)查發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)危害甘薯的腐爛莖線蟲中A型群體占大多數(shù)且分布廣泛的結(jié)果一致。而就目前的發(fā)現(xiàn)來看，A型腐爛莖線蟲僅在中國(guó)出現(xiàn)，且只危害甘薯，這表明中國(guó)腐爛莖線蟲可能存在寄主專化性。

腐爛莖線蟲不同地區(qū)群體的差異明顯，說明其正處于快速進(jìn)化過程中，且不同地理來源的線蟲種群在形態(tài)特征[9]、致病力[31]、對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制劑的敏感性[32]和抗藥性[33]等方面存在一定差異。徐振等[34]的研究結(jié)果表明甘薯腐爛莖線蟲在南方薯區(qū)存在較大的定殖風(fēng)險(xiǎn)。江蘇省內(nèi)甘薯腐爛莖線蟲群體是否還存在其他不同基因型，各基因型腐爛莖線蟲生態(tài)適應(yīng)性、寄主范圍、生物學(xué)特性等是否有差異，還需進(jìn)一步調(diào)查研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉維志. 植物病原線蟲學(xué) [M]. 1版.北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 1999.

[2]周忠，馬代夫. 甘薯莖線蟲病的研究現(xiàn)狀和展望[J]. 園藝與種苗， 2003， 23（5）：288-290.

[3]朱秀珍，田希武， 王隨保，等. 甘薯莖線蟲病發(fā)病規(guī)律及綜合防治[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2004， 32（3）：54-57.

[4]丁再福，林茂松. 甘薯、馬鈴薯和薄荷上的莖線蟲的鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 1982， 9（3）：169-172.

[5]陳品三，鄭經(jīng)武. 當(dāng)歸麻口病中致病莖線蟲的鑒定研究[J]. 植物保護(hù)， 1988， 14（6）：12-14.

[6]HOOPER D J. Ditylenchus destructor CIH description of plant parasitic nematodes No.21[M].UK：CAB International Wallingford， 1973.

[7]YAGHOUBI A， POURJAM E， YE W， et al. Description and molecular phylogeny of Ditylenchus gilanicus n. sp. （Nematoda： Anguinidae） from northern forests of Iran[J]. European Journal of Plant Pathology，2018，152（3）：735-746.

[8]王金成，季鐳，黃國(guó)明，等. 腐爛莖線蟲不同地理群體ITS區(qū)序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 30（5）： 79-83.

[9]黃健，戚龍君，王金成，等. 腐爛莖線蟲種內(nèi)不同群體形態(tài)及遺傳分析[J].植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（2）：125-131.

[10]章淑玲，張紹升. 甘薯莖線蟲rDNA-ITS1區(qū)的PCR擴(kuò)增與序列分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2008， 38（2）：132-135.

[11]宛菲，彭德良，楊玉文，等. 馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性分子檢測(cè)技術(shù)研究[J].植物病理學(xué)報(bào)， 2008， 38（3）：263-270.

[12]SUBBOTIN S A，MOHAMMAD D A，ZHENG J Z，et al. Length variation and repetitive sequences of internal transcribed spacer of ribosomal RNA gene， diagnostics and relationships of populations of potato rot nematode， Ditylenchus destructor Thorne， 1945 （Tylenchida： Anguinidae）[J]. Nematology， 2011， 13（7）：773-785.

[13]JESZKE A， BUDZISZEWSKA M， DOBOSZ R， et al. A comparative and phylogenetic study of the Ditylenchus dipsaci， Ditylenchus destructorand and Ditylenchus gigas populations occurring in Poland[J]. Journal of Phytopathology， 2014， 162（1）：61-67.

[14]劉晨，楊藝煒，王家哲，等. 陜西不同地區(qū)馬鈴薯腐爛莖線蟲的分離鑒定及同源性分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2020， 29（5）：793-800.

[15]劉中華，林志堅(jiān)，李華偉，等.甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，50（11）：2392-2400.

[16]趙冬蘭，周志林，唐君，等. 不同基因型甘薯的耐瘠性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：74-78.

[17]張紹升.植物線蟲病害診斷與治理[M]. 福州： 福建科學(xué)技術(shù)出版社， 1999.

[18]ZHANG S L， LIU G K， JANSSEN T， et al. A new stem nematode associated with peanut pod rot in China： morphological and molecular characterization of Ditylenchus arachis n. sp. （Nematoda： Anguinidae） [J].Plant Pathology，2014，63（7）：1197-1206.

[19]DARRIBA D， TABOADA G L， DOALLO R， et al. jModelTest 2： more models， new heuristics and parallel computing[J]. Nature Methods， 2012， 9（8）： 772.

[20]XIA X， XIE Z. DAMBE： software package for data analysis in molecular biology and evolution[J]. Journal of Heredity， 2001， 30（7）： 1720-1728.

[21]QIAO K， BAI M， HE Y， et al. Description of Labrys fuzhouensis sp.n. and first record of Coslenchus rafiqi （Nematoda： Tylenchidae） from China[J]. Nematology， 2019， 21（7）：693-708.

[22]RONQUIST F， HUELSENBECK J P. MrBayes 3： bayesian phylogenetic inference under mixed models[J]. Bioinformatics， 2003， 19（12）： 1572-1574.

[23]FELSENSTEIN J. Evolutionary trees from DNA sequences： a maximum likelihood approach[J]. Journal of Molecular Evolution， 1981， 17（6）： 368-376.

[24]STAMATAKIS A， HOOVER P， ROUGEMONT J. A rapid bootstrap algorithm for the RAxML web servers[J]. Systematic Biology， 2017， 57（5）： 758-771.

[25]THORNE G. Ditylenchus destructor n.sp. the potato rot nematode， and Ditylenchus dipsaci （Kühn， 1857） Filipjev， 1936， the teasel nematode （Nematoda： Tylenchidae）.[J].Proceedings of the Helminthological Society of Washington， 1945， 12（2） ：27-33.

[26]GOODEY J B. Investigations into the host ranges of Ditylenchus destructor and D. dipsaci[J]. Annals of Applied Biology， 1952，39（2）：221-228.

[27] 張紹升，章淑玲，王宏毅，等. 甘薯莖線蟲的形態(tài)特征[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2006， 36（1）：22-27.

[28]WU L Y. Comparative study of Ditylenchus destructor thorne， 1945 （Nematoda：Tylenchidae）， from potato， bulbous iris， and dahlia， with a discussion of de Man’s ratios[J]. Canadian Journal of Zoology， 1960， 38（6）：1175-1187.

[29]JONES B L. First report of Ditylenchus destructor in pods and seeds of peanut [J]. Plant Disease， 1988， 72（5）：453-453.

[30]于海英，彭德良，胡先奇，等. 馬鈴薯腐爛莖線蟲28S rDNA-D2/D3區(qū)序列分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2009， 39（3）：254-261.

[31]王宏寶，毛佳，李茹，等. 不同地理來源腐爛莖線蟲種群雜交后代致病力測(cè)定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2011， 26（6）：212-216.

[32]丁中，彭德良，高必達(dá). 不同地理種群甘薯莖線蟲乙酰膽堿酯酶對(duì)抑制劑的敏感性[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2007， 34（4）：410-414.

[33]丁中，彭德良，何旭峰，等. 不同地理種群甘薯莖線蟲對(duì)不同類型殺線劑的敏感性[J]. 農(nóng)藥， 2007， 46 （12）：63-65.

[34]徐振，孫厚俊，楊冬靜，等. 甘薯莖線蟲在南方薯區(qū)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及影響因素研究[J]. 廣西農(nóng)學(xué)報(bào)， 2017， 32（3）：26-29.

（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-04-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-10-B15）;徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院基金項(xiàng)目（RC2019002）

作者簡(jiǎn)介：陳晶偉（1993-）， 男， 陜西漢中人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，從事甘薯病蟲害防治研究。（Email）ibcjw0825@126.com

通訊作者：孫厚俊，（Email）sunhouj1980@163.com