針刺干預(yù)對(duì)大鼠離心運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷后線粒體分裂的影響

白勝超 陳圣菊 尚畫雨 李俊平 周越 王瑞元

1 南京理工大學(xué)體育部（江蘇南京210094）

2 北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院（北京100084）

3 成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院（四川成都610041）

長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行大負(fù)荷或不習(xí)慣的離心運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌會(huì)出現(xiàn)僵硬酸痛、肌力下降、超微結(jié)構(gòu)改變等現(xiàn)象，造成運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力降低，影響正常的生活或運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練[1]。在運(yùn)動(dòng)以及恢復(fù)過(guò)程中，線粒體作為重要的能量代謝細(xì)胞器發(fā)揮著重要作用，因此，本課題組前期對(duì)線粒體的損傷進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)會(huì)引起骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)改變，出現(xiàn)大小不一、嵴稀少或空泡化、肌膜下聚集等現(xiàn)象[2]；大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后會(huì)出現(xiàn)線粒體自噬和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[3-4]。有研究指出，線粒體損傷會(huì)引起線粒體分裂，而線粒體分裂是導(dǎo)致線粒體自噬和細(xì)胞凋亡的重要原因[5-7]，同時(shí)粒體分裂增強(qiáng)會(huì)使網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，片段化線粒體增多，活性氧類物質(zhì)大量產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體功能降低。因此，本研究推測(cè)，在進(jìn)行大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后，骨骼肌線粒體可能會(huì)出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，隨后引起線粒體自噬和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致線粒體功能下降。

針刺作為傳統(tǒng)治療方法，能夠明顯降低運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷程度[8]，促進(jìn)機(jī)能恢復(fù)且治療效果顯著[9]，有效降低運(yùn)動(dòng)后升高的肌張力并改善肌肉疲勞，緩解延遲性肌肉酸痛等運(yùn)動(dòng)后的不良反應(yīng)，促進(jìn)恢復(fù)[10-11]。針刺能夠降低運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體損傷程度，并對(duì)線粒體自噬和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象起到明顯的改善作用[3-4]。這提示：運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行針刺干預(yù)可能影響線粒體的分裂，進(jìn)而降低線粒體自噬和細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)骨骼肌功能的快速恢復(fù)。

運(yùn)動(dòng)后的針刺干預(yù)已有相關(guān)研究，但從骨骼肌線粒體分裂角度進(jìn)行的探討和研究還相對(duì)較少，另外，由于線粒體在運(yùn)動(dòng)后一直處在較高的活動(dòng)水平，有必要進(jìn)行多時(shí)相的檢測(cè)，而目前還缺少對(duì)離心運(yùn)動(dòng)后線粒體多時(shí)間點(diǎn)的連續(xù)監(jiān)測(cè)。線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（trans?locase of outer membrane 20，TOMM20）為線粒體膜的標(biāo)志蛋白，可以定位線粒體位置；線粒體分裂動(dòng)力相關(guān)蛋白1（dynamin-relatedprotein1，DRP1）為線粒體分裂相關(guān)的重要蛋白；FUNDC1 蛋白（FUN14 domain con?taining 1，F(xiàn)UNDC1）為線粒體分裂過(guò)程中的關(guān)鍵作用蛋白。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行一次性大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)并針刺干預(yù)，觀察比目魚(yú)肌線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化，檢測(cè)TOMM20 與DRP1 的共定位、FUNDC1 與DRP1 的相互作用，共同確定線粒體分裂情況，以及檢測(cè)DRP1蛋白表達(dá)水平確定分裂程度，從而探究大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體的分裂情況及針刺作用效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

8周齡雄性SD 大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（使用許可證號(hào)：SCXK 京2012-0001），SPF 級(jí)別，共計(jì)176 只，體重220 ± 9.3g。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度23.5℃± 3.5℃，相對(duì)濕度45%～65%，燈光照射為12 h 明暗交替，所有大鼠均為自由進(jìn)食、飲水。大鼠在北京體育大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)。本研究獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

所有大鼠在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天，之后隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（C 組）、單純針刺組（A 組）、單純運(yùn)動(dòng)組（E 組）、運(yùn)動(dòng)針刺組（EA 組），E、EA 組進(jìn)行一次性下坡跑離心運(yùn)動(dòng)，A、EA 組進(jìn)行針刺干預(yù)。其中A、E、EA 組根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求又分為0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h時(shí)相亞組，每小組8只，詳見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組（n=8）

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

模型的預(yù)適應(yīng)期參照趙曉琴的方案進(jìn)行[4]，為期3天，方式為：?jiǎn)渭冞\(yùn)動(dòng)組大鼠在小動(dòng)物電動(dòng)跑臺(tái)上進(jìn)行規(guī)定速度的運(yùn)動(dòng)，第1 天跑臺(tái)坡度為0°，速度為16 m/min，訓(xùn)練5 min；第2 天跑臺(tái)坡度為0°，速度為16 m/min，訓(xùn)練10 min；第3 天休息。正式實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)方案參照Armstrong[12]經(jīng)典離心運(yùn)動(dòng)方式，并參照文獻(xiàn)[13]，構(gòu)建大鼠比目魚(yú)肌運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷模型，參數(shù)為：坡度－16°，速度16 m/min，時(shí)間90 min。

1.3 針刺方案

具體方案采用丁海麗方法進(jìn)行[14]，單純針刺組、運(yùn)動(dòng)針刺組進(jìn)行比目魚(yú)肌斜刺，其中單純針刺組不進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，直接在安靜狀態(tài)下針刺。將大鼠固定好后，小腿三頭肌位置進(jìn)行消毒，用0.25 mm針灸針[漢醫(yī)牌，津食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2009第2270002號(hào)]從遠(yuǎn)端進(jìn)針，沿比目魚(yú)肌的位置走向進(jìn)行30°斜刺，并在肌腹部位留針2 min。

1.4 樣本采集

在每組相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比目魚(yú)肌取材，每只大鼠電鏡、免疫共沉淀、免疫熒光的樣本均取自同一塊骨骼肌。電鏡樣本：取體積約為1 mm3的比目魚(yú)肌，置于4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中備用。免疫共沉淀樣本：取比目魚(yú)肌錫紙包裹，轉(zhuǎn)移到－80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。免疫熒光樣本：取體積約為16 mm3的比目魚(yú)肌，OCT 包埋后存于－80℃冰箱備用。線粒體樣本：取100 mg比目魚(yú)肌，根據(jù)線粒體分離試劑盒（中國(guó)，碧云天公司）的說(shuō)明書進(jìn)行提取操作，之后加入儲(chǔ)存液轉(zhuǎn)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.5.1 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

磷酸鹽緩沖液沖洗樣品。鋨酸固定后梯度酒精脫水。環(huán)氧樹(shù)脂包埋后切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色液染色。樣本充分干燥后通過(guò)透射電子顯微鏡進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察，電鏡（×2000～8000）隨機(jī)進(jìn)行拍攝，采集圖像。

1.5.2 免疫熒光檢測(cè)骨骼肌線粒體TOMM20/DRP1的共定位

冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片。丙酮液固定。PBS 清洗后滴加5%的羊血清封閉，37℃孵育30 min。滴加5%羊血清稀釋的一抗TOMM20（英國(guó)，Abcam 公司）與DRP1（英國(guó)，Abcam公司），稀釋比例1︰400，4℃冰箱孵育過(guò)夜。移除一抗，PBS 清洗后滴加5%羊血清配制的二抗（中國(guó)，伊萊瑞特生物科技股份有限公司），比例1︰250，室溫避光孵育2 h。移除二抗，PBS 清洗后滴加DAPI 封片。激光共聚焦設(shè)置波長(zhǎng)為488 和555 兩種，隨機(jī)采集視野，IPP6.0軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)兩種蛋白的共定位百分?jǐn)?shù)。

1.5.3 免疫共沉淀測(cè)定骨骼肌FUNDC1/DRP1 等蛋白的相互結(jié)合作用

比目魚(yú)肌加入IP 裂解液，進(jìn)行剪碎勻漿并離心（12000 g、4℃、10 min）。蛋白稀釋至1 μg/μl，將1 ml樣品中加入1 μl的兔IgG抗體，再加入20 μl珠子，4℃環(huán)境下緩慢混勻2 h，使其進(jìn)行均勻結(jié)合。離心（14000 g、4℃、10 min），取上清，棄沉淀。加入FUNDC1 抗體（美國(guó)，Millipore 公司），并設(shè)置陰性對(duì)照組，4℃過(guò)夜。加入30 μl 的protein A/G-beads，4℃冰箱孵育2 h，之后離心（14000 g、4℃、10 min），將離心后的沉淀保留，并進(jìn)行清洗，再加入蛋白上樣緩沖液，95℃煮5 min，保存待測(cè)。Western Blot 檢測(cè)DRP1 蛋白量。

1.5.4 Western Blot測(cè)定線粒體DRP1

比目魚(yú)肌剪碎勻漿并離心（12000 g、4℃、10 min），上清液和線粒體樣品分別用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入樣品緩沖液，煮沸5 min 保存。加入樣品。電泳80 V恒壓。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。5%BSA室溫?fù)u床封閉2.5 h。滴加封閉液稀釋的一抗，稀釋比例為DRP1（1︰800）（英國(guó)，Abcam 公司），線粒體內(nèi)參COXⅣ（1︰2000），4℃過(guò)夜。TBST 清洗后滴加對(duì)應(yīng)的二抗（中國(guó)，中衫金橋），濃度均為1︰6000，孵育2 h。TBST清洗后滴加發(fā)光液放入成像系統(tǒng)采集圖片。Gel-pro軟件進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對(duì)處理方式（運(yùn)動(dòng)、針刺）和時(shí)相因素（0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h）采用雙因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，若處理方式的主效應(yīng)顯著則進(jìn)一步執(zhí)行安靜對(duì)照組、單純針刺組、單純運(yùn)動(dòng)組、運(yùn)動(dòng)針刺組等組間的事后多重檢驗(yàn)。各因素內(nèi)的各個(gè)亞組比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)及針刺干預(yù)后不同時(shí)相骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化

骨骼肌線粒體微觀結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)果詳見(jiàn)圖1。安靜對(duì)照組（圖a、b）骨骼肌線粒體均勻分布于“Z”線兩側(cè)，通過(guò)電子密度體銜接，呈串狀分布于肌原纖維之間，線粒體形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)，未見(jiàn)明顯的損傷情況和線粒體片段。單純針刺組（圖A0～A72）線粒體在針刺后的0～72 h 并未見(jiàn)明顯變化，形態(tài)完整。單純運(yùn)動(dòng)組（圖E0～E72）線粒體在E2組和E6組中結(jié)構(gòu)出現(xiàn)腫脹，已有少量的線粒體細(xì)小片段；E12組明顯增多，存在較多大小不一的線粒體片段，部分線粒體膜結(jié)構(gòu)模糊，并出現(xiàn)大量積聚；E24組細(xì)小線粒體數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)不清晰且腫脹；E48 組線粒體細(xì)小片段數(shù)量減少；E72 組略有缺失，但結(jié)構(gòu)已趨于完整。運(yùn)動(dòng)針刺組（圖EA0～EA72）線粒體EA2、EA6組分別與E2、E6組的變化類似，EA12組線粒體同樣出現(xiàn)較多細(xì)小片段，但程度明顯要小于E12組，EA24 組線粒體片段化數(shù)量要少于E24 組，EA48 組僅有少量的線粒體片段存在，且結(jié)構(gòu)已逐漸恢復(fù)，EA72組與安靜對(duì)照組相似。

圖1 運(yùn)動(dòng)及針刺后不同時(shí)相線粒體變化情況

2.2 運(yùn)動(dòng)及針刺干預(yù)后不同時(shí)相下TOMM20/DRP1共定位變化

見(jiàn)圖2。使用激光共聚焦顯微鏡采集圖像，TOMM20為線粒體膜的標(biāo)志蛋白，DRP1為線粒體分裂的標(biāo)志蛋白，TOMM20 和DRP1 發(fā)生共定位呈黃色，說(shuō)明DRP1 蛋白從胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體。安靜對(duì)照組（圖C）未見(jiàn)明顯的黃色熒光。單純針刺組（圖A0～A72）與安靜對(duì)照組相比，未見(jiàn)明顯區(qū)別，在A12組偶見(jiàn)黃色熒光顆粒。單純運(yùn)動(dòng)組（圖E0～E72）運(yùn)動(dòng)后黃色熒光逐漸增多增亮，并在12～24 h 達(dá)到峰值，之后開(kāi)始減少，在E72 組尚能見(jiàn)到黃色熒光。運(yùn)動(dòng)針刺組（圖EA0～EA72）變化趨勢(shì)與單純運(yùn)動(dòng)組相似，但在峰值12～24 h 能明顯發(fā)現(xiàn)黃色熒光弱于單純運(yùn)動(dòng)組的12～24 h，在EA72組幾乎未見(jiàn)明顯的黃色熒光結(jié)合點(diǎn)。

采用IPP6.0 軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)兩種蛋白的共定位百分?jǐn)?shù)（表2）。通過(guò)雙因素方差分析對(duì)處理因素（運(yùn)動(dòng)、針刺）進(jìn)行主效應(yīng)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示存在顯著影響（P<0.01）。事后多重檢驗(yàn)結(jié)果顯示，安靜對(duì)照組和單純針刺組無(wú)顯著性差異（P>0.05）；單純運(yùn)動(dòng)組高于安靜對(duì)照組（P<0.05）；運(yùn)動(dòng)針刺組高于安靜對(duì)照組和單純針刺組（P<0.05），但顯著低于單純運(yùn)動(dòng)組（P<0.05）。

單純針刺組組內(nèi)各時(shí)相點(diǎn)之間相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）；組間相比，各時(shí)相點(diǎn)與安靜對(duì)照組相比未見(jiàn)顯著性差異（P>0.05）。

單純運(yùn)動(dòng)組組內(nèi)各時(shí)相比較：運(yùn)動(dòng)后0 h、2 h 分別與6 h、12 h、24 h、48 h 等相比，具有顯著性差異（P<0.01）。運(yùn)動(dòng)后6 h、12 h、24 h、48 h 分別與72 h相比，具有顯著性差異（P<0.01），其余時(shí)相間相比均無(wú)顯著性差異（P>0.05）；組間比較：與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 均具有顯著性差異（P<0.01）。

運(yùn)動(dòng)針刺組組內(nèi)各時(shí)相比較：運(yùn)動(dòng)后0 h 與6 h、12 h、24 h、48 h，2 h 與6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，6 h 與12 h、72 h，24 h 與48 h、72 h，以及48 h 與72 h等相比均具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）；組間比較：與安靜對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 等時(shí)相比值均有顯著性差異（P<0.05），與單純針刺組相比除72 h 外其余所有時(shí)相均具有顯著性差異（P<0.05），與單純運(yùn)動(dòng)組相比各時(shí)相無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

表2 運(yùn)動(dòng)及針刺后不同時(shí)相線粒體TOMM20/DRP1共定位比值（n=8）

2.3 運(yùn)動(dòng)及針刺干預(yù)后不同時(shí)相FUNDC1/DRP1 結(jié)合的變化

FUNDC1 為線粒體蛋白，能夠與胞漿中的線粒體分裂蛋白DRP1 發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致線粒體分裂，采用Gelpro分析軟件對(duì)蛋白圖像進(jìn)行分析，兩者出現(xiàn)共沉淀說(shuō)明轉(zhuǎn)位到線粒體上的DRP1 蛋白發(fā)揮了分裂作用。不同時(shí)相FUNDC1與DRP1結(jié)合的比值變化見(jiàn)表3。

通過(guò)雙因素方差分析對(duì)處理因素（運(yùn)動(dòng)、針刺）進(jìn)行主效應(yīng)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示存在顯著影響（P<0.01）。事后多重檢驗(yàn)表明，單純針刺組與安靜對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）；單純運(yùn)動(dòng)組高于安靜對(duì)照組（P<0.05）；運(yùn)動(dòng)針刺組明顯高于安靜對(duì)照組和單純針刺組（P<0.05），但顯著低于運(yùn)動(dòng)組（P<0.05）。

圖2 各組不同時(shí)相下骨骼肌TOMM20/DRP1共定位

單純針刺組組內(nèi)各時(shí)相比較，2 h 和12 h 具有顯著性差異（P<0.05），其余均無(wú)顯著性差異；組間比較，各時(shí)相與安靜對(duì)照組相比也未表現(xiàn)出差異（P>0.05）。

單純運(yùn)動(dòng)組組內(nèi)各時(shí)相比較：運(yùn)動(dòng)后0 h、2 h 分別與6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相比具有顯著性差異（P<0.05 或P<0.01），運(yùn)動(dòng)后6 h 分別與12 h、24 h、48 h、72 h 相比具有顯著性差異（P<0.01），運(yùn)動(dòng)后12 h、24 h、48 h、72 h 相互比較均具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），其余時(shí)相間相比均無(wú)顯著性差異（P>0.05）；組間比較，運(yùn)動(dòng)后6 h、12 h、48 h、72 h 顯著高于安靜對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）。

運(yùn)動(dòng)針刺組組內(nèi)各時(shí)相比較：運(yùn)動(dòng)后0 h、2 h 與6 h、12 h、24 h、48 h相比有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），6 h與12 h、24 h，12 h、24 h與48 h、72 h以及48 h 與72 h 相比也均有顯著性差異（P<0.05 或P<0.01）；組間比較：6 h、12 h、24 h、48 h、72 h比值均顯著高于安靜對(duì)照組（P<0.05），2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 比值均顯著高于單純針刺組（P<0.01），2 h、6 h、12 h、24 h、72 時(shí)相比值與單純運(yùn)動(dòng)組相比具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）。

表3 不同時(shí)相FUNDC1與DRP1結(jié)合的比值變化（n=8）

2.4 運(yùn)動(dòng)及針刺干預(yù)后不同時(shí)相線粒體DRP1的變化

采用Gel-pro分析軟件對(duì)蛋白圖像進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，線粒體DRP1 蛋白的表達(dá)量是檢測(cè)線粒體分裂程度的重要指標(biāo)。不同時(shí)相線粒體DRP1的變化見(jiàn)表4。

通過(guò)雙因素方差分析對(duì)處理因素（運(yùn)動(dòng)、針刺）進(jìn)行主效應(yīng)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示存在顯著影響（P<0.01）。事后多重檢驗(yàn)表明，單純針刺組與安靜對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P>0.05）；單純運(yùn)動(dòng)組高于安靜對(duì)照組（P<0.05）；運(yùn)動(dòng)針刺組明顯高于安靜對(duì)照組和單純針刺組（P<0.05），但與單純運(yùn)動(dòng)組相比明顯較低（P<0.05）。

單純針刺組組內(nèi)各時(shí)相比較，運(yùn)動(dòng)后12 h與0 h、2 h、6 h、48 h、72 h有顯著性差異（P<0.05），其余未見(jiàn)明顯差異（P>0.05）；組間比較，運(yùn)動(dòng)后12 h與安靜對(duì)照組有顯著性差異（P<0.05）。

單純運(yùn)動(dòng)組組內(nèi)各時(shí)相比較：運(yùn)動(dòng)后0 h 與6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，2 h 與6 h、12 h、24 h、48 h，6 h與12 h、24 h，12 h、24 h與48 h、72 h相比有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）；組間比較：運(yùn)動(dòng)后0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 比值均顯著高于安靜對(duì)照組（P<0.05或P<0.01）。

運(yùn)動(dòng)針刺組組內(nèi)各時(shí)相比較：運(yùn)動(dòng)后0 h、2 h 與6 h、12 h、24 h、48 h相比有顯著性差異（P<0.05），6 h與12 h、24 h、72 h，12 h、24 h與48 h、72 h以及48 h與72 h相比也均有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）；組間比較：運(yùn)動(dòng)后0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h比值均顯著高于安靜對(duì)照組（P<0.05 或P<0.01），所有時(shí)相均顯著高于單純針刺組（P<0.05或P<0.01），24 h、72 h顯著低于單純運(yùn)動(dòng)組（P<0.05）。

表4 不同時(shí)相線粒體DRP1蛋白表達(dá)量（相對(duì)于C組）（n=8）

3 討論

線粒體是重要的細(xì)胞器，具有外膜、內(nèi)膜雙層膜結(jié)構(gòu)，能夠合成ATP為細(xì)胞提供能量[15]，并且與生物體的發(fā)育、凋亡、能量代謝等許多生命活動(dòng)都具有重要關(guān)系[16]，維持著生物體眾多的生理活動(dòng)。線粒體作為一種動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器，不斷通過(guò)分裂和融合進(jìn)行信息交流，保持自身結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定，以此來(lái)實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，維持自身動(dòng)力學(xué)的平衡[17]，其中線粒體分裂決定線粒體形態(tài)、數(shù)量及分布，是影響其功能的重要原因[18]。在大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)過(guò)程中以及運(yùn)動(dòng)后的恢復(fù)期，骨骼肌線粒體會(huì)出現(xiàn)不同程度的變化。有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)后骨骼肌肌漿網(wǎng)腫脹，誘導(dǎo)微管解聚，影響線粒體形態(tài)，表現(xiàn)為出現(xiàn)嚴(yán)重的線粒體損傷，隨后經(jīng)初步檢測(cè)DRP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DRP1 蛋白在運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)時(shí)相性變化[19]，提示骨骼肌線粒體可能發(fā)生分裂現(xiàn)象。本研究從線粒體分裂的角度進(jìn)一步探究大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后針刺干預(yù)的作用機(jī)制，能夠?qū)ξ⒂^層面有更為全面的了解，并對(duì)針刺在離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體損傷、分裂、自噬以及細(xì)胞凋亡方面的研究進(jìn)行補(bǔ)充，形成系統(tǒng)的修復(fù)理論，提高對(duì)骨骼肌線粒體功能恢復(fù)和針刺作用機(jī)制的深層認(rèn)識(shí)。

透射電鏡能夠觀察到骨骼肌線粒體的超微形態(tài)，線粒體具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在透射電鏡下呈長(zhǎng)條狀或卵圓形[20]，長(zhǎng)條狀結(jié)構(gòu)完整均勻，粗細(xì)一致，膜結(jié)構(gòu)清晰完整；卵圓形則飽滿規(guī)則，對(duì)稱分布在“Z”線兩側(cè)。若在肌原纖維間出現(xiàn)大量的細(xì)小點(diǎn)狀線粒體，為線粒體完整網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中分裂下來(lái)的片段，說(shuō)明線粒體已發(fā)生分裂現(xiàn)象，可以作為線粒體分裂的直觀證據(jù)[21，22]。在運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體的透射電鏡研究中，孫良[23]對(duì)大鼠進(jìn)行一次性力竭運(yùn)動(dòng)干預(yù)，并在不同時(shí)刻觀察肱三頭肌的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)骨骼肌線粒體發(fā)生了不同程度的病理學(xué)變化，出現(xiàn)腫脹、空泡化、嵴模糊甚至消失等現(xiàn)象，但該研究未對(duì)運(yùn)動(dòng)后線粒體片段化進(jìn)行觀察。

本研究首先通過(guò)透射電鏡對(duì)運(yùn)動(dòng)及針刺后的比目魚(yú)肌線粒體進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，驗(yàn)證是否存在片段化現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，單純針刺并未引起線粒體數(shù)量明顯的變化，而大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)能夠造成線粒體片段化，出現(xiàn)分裂現(xiàn)象，細(xì)小線粒體數(shù)目明顯增多，12 h、24 h 達(dá)到峰值，并持續(xù)到運(yùn)動(dòng)后48 h，表明離心運(yùn)動(dòng)對(duì)線粒體形態(tài)和數(shù)量的影響至少持續(xù)至48 h；在運(yùn)動(dòng)后72 h出現(xiàn)明顯恢復(fù)，但線粒體略有缺失，可能是由于后續(xù)線粒體自噬或線粒體的融合過(guò)程高于分裂過(guò)程所致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證透射電鏡結(jié)果，本研究采用蛋白TOMM20與DRP1 進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)，蛋白FUNDC1 與DRP1 進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。TOMM20 是典型的線粒體定位標(biāo)志蛋白，DRP1是引起線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白[24]，也是評(píng)價(jià)線粒體分裂的重要指標(biāo)[25]，兩種蛋白的共定位百分比增多表明線粒體分裂加強(qiáng)。FUNDC1 是一種在哺乳動(dòng)物中高度保守的跨膜蛋白，定位于線粒體[26]，磷酸化的FUNDC1與DRP1結(jié)合介導(dǎo)了線粒體分裂和自噬的發(fā)生[27]，兩種蛋白共沉淀增多說(shuō)明線粒體分裂加強(qiáng)。兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化趨勢(shì)均表明，單純進(jìn)行針刺組未發(fā)現(xiàn)骨骼肌線粒體明顯分裂，單純進(jìn)行運(yùn)動(dòng)組可見(jiàn)分裂現(xiàn)象在運(yùn)動(dòng)后0 h 即逐漸增多，在運(yùn)動(dòng)后12 h 達(dá)到峰值，并持續(xù)至24 h，在48 h、72 h 明顯降低。為了確定各組分裂程度，本研究對(duì)線粒體DRP1蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。DRP1蛋白作為線粒體分裂的重要蛋白，大量存在于胞漿，通過(guò)與其他蛋白的相互作用轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體外膜上并聚集成點(diǎn)，在三磷酸鳥(niǎo)苷驅(qū)動(dòng)下形成螺旋狀結(jié)構(gòu)，最終收縮線粒體進(jìn)行切割，導(dǎo)致線粒體分裂，出現(xiàn)片段化[28]。Jamart 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在禁食狀態(tài)下令小鼠以10 m/min速度進(jìn)行90 min的低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，在腓腸肌中發(fā)現(xiàn)ULK1、AMPK 磷酸化均未在運(yùn)動(dòng)后禁食和喂養(yǎng)兩種條件下出現(xiàn)變化，由于ULK1、AMPK 為DRP1 上游蛋白，其磷酸化影響DRP1的表達(dá)，該研究也發(fā)現(xiàn)線粒體分裂標(biāo)記蛋白DRP1在運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)明顯增加。Ding 等[30]令大鼠進(jìn)行150 min 的劇烈運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后即刻或恢復(fù)期，骨骼肌細(xì)胞中線粒體融合蛋白mRNA 的表達(dá)顯著降低，線粒體分裂相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加。劉慧君[31]令小鼠進(jìn)行一次性中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)蛋白DRP1 在運(yùn)動(dòng)后的60 min、90 min，其mRNA 水平以及蛋白的最終表達(dá)水平都升高，提示運(yùn)動(dòng)以及運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體有分裂趨勢(shì)。以上研究皆表明，進(jìn)行一定程度的運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致線粒體分裂。本研究提取了骨骼肌線粒體，并進(jìn)行了蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。DRP1變化趨勢(shì)與透射電鏡、免疫熒光共定位、免疫共沉淀結(jié)果一致，單純進(jìn)行針刺未引起線粒體明顯分裂，進(jìn)行大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體出現(xiàn)分裂現(xiàn)象；在12 h、24 h達(dá)到峰值，之后逐漸降低并持續(xù)到48 h，72 h已顯著降低。

大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后針刺骨骼肌進(jìn)行干預(yù)會(huì)對(duì)線粒體產(chǎn)生一定的影響。尚畫雨[3]令大鼠進(jìn)行一次性離心運(yùn)動(dòng)，并在運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行針刺干預(yù)，透射電鏡下可明顯觀察到運(yùn)動(dòng)后線粒體損傷嚴(yán)重，自噬體增多，而進(jìn)行針刺干預(yù)后自噬體顯著降低，損傷較輕，并促進(jìn)了線粒體的結(jié)構(gòu)恢復(fù)。在本研究的透射電鏡結(jié)果中，離心運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行針刺干預(yù)能夠降低峰值時(shí)相線粒體的分裂程度，細(xì)小線粒體數(shù)量減少，且在12 h、24 h 峰值時(shí)相更為明顯；同時(shí)在運(yùn)動(dòng)針刺后72 h 恢復(fù)效果更為顯著，形態(tài)上與正常狀態(tài)無(wú)異，說(shuō)明針刺干預(yù)可促進(jìn)線粒體結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，能夠直接反映在微觀結(jié)構(gòu)上。TOMM20 與DRP1 的免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)，蛋白FUNDC1 與DRP1 的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行針刺干預(yù)，總體變化趨勢(shì)與單純運(yùn)動(dòng)組基本一致，同樣在12 h、24 h達(dá)到峰值，但整體來(lái)看線粒體的分裂現(xiàn)象得到明顯改善，尤其是在峰值的時(shí)相點(diǎn)分裂明顯降低。兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果與透射電鏡下的觀察結(jié)果一致，說(shuō)明針刺干預(yù)可以改善運(yùn)動(dòng)所致的線粒體分裂現(xiàn)象。但需要指出的是，在單純運(yùn)動(dòng)組和運(yùn)動(dòng)針刺組的結(jié)果統(tǒng)計(jì)上兩種實(shí)驗(yàn)方法并不完全相同，免疫熒光共定位反映蛋白位置共存，而免疫共沉淀反映的是兩蛋白有無(wú)相互結(jié)合，二者所針對(duì)問(wèn)題不同，但均不能進(jìn)行準(zhǔn)確的半定量分析。從本研究中蛋白定量檢測(cè)線粒體分裂程度的結(jié)果看，針刺干預(yù)能夠降低線粒體分裂程度，尤其在12 h、24 h 的峰值量更為明顯，在72 h 已接近正常狀態(tài)，并且分裂程度已經(jīng)顯著低于單純運(yùn)動(dòng)組，二者共同說(shuō)明針刺能夠改善離心運(yùn)動(dòng)所致的線粒體分裂現(xiàn)象，有利于線粒體結(jié)構(gòu)恢復(fù)。

線粒體通過(guò)分裂和融合過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制，而大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后0 h～72 h 是骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的關(guān)鍵時(shí)間。作為重要的供能細(xì)胞器，線粒體在此期間也不斷進(jìn)行分裂、融合、自噬，甚至引起細(xì)胞凋亡。尚畫雨[3]、于瀅[2]、趙曉琴[4]等通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行一次性的大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，并進(jìn)行針刺干預(yù)研究，發(fā)現(xiàn)大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致骨骼肌線粒體出現(xiàn)損傷，也會(huì)引起線粒體自噬，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而在運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行針刺干預(yù)能夠明顯緩解以上情況。許多研究均指出，線粒體損傷會(huì)引起線粒體分裂，而線粒體分裂是導(dǎo)致線粒體自噬和細(xì)胞凋亡的重要原因[5，6]。本研究透射電鏡、免疫熒光共定位、免疫共沉淀、DRP1蛋白表達(dá)結(jié)果均顯示，運(yùn)動(dòng)及針刺后0 h～48 h線粒體均發(fā)生明顯分裂，形成了不同大小的線粒體片段；在峰值變化點(diǎn)上，12 h、24 h 等時(shí)相更是變化的關(guān)鍵時(shí)相點(diǎn)。綜合本研究的結(jié)果以及以往研究，可見(jiàn)：大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體出現(xiàn)損傷，之后線粒體發(fā)生分裂，并通過(guò)線粒體自噬清除分裂下的損傷線粒體；對(duì)于損傷較為嚴(yán)重的線粒體，通過(guò)分裂直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生；而在離心運(yùn)動(dòng)后對(duì)骨骼肌進(jìn)行針刺干預(yù)，在一定程度上可降低線粒體損傷，緩解線粒體分裂程度，最終降低線粒體的過(guò)度自噬和細(xì)胞凋亡，促進(jìn)線粒體形態(tài)、功能以及骨骼肌機(jī)能的恢復(fù)。在離心運(yùn)動(dòng)及針刺干預(yù)后的整個(gè)過(guò)程中，骨骼肌線粒體并不是靜止不變的，而是處在高度活躍中，結(jié)合以往研究可見(jiàn)，大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后線粒體損傷最嚴(yán)重的時(shí)相點(diǎn)出現(xiàn)在12～24 h[2，3]，而此時(shí)間段也是骨骼肌清除碎片的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，需要線粒體將受損部位分裂下來(lái)用于后續(xù)修復(fù)，因此離心運(yùn)動(dòng)后及針刺干預(yù)下線粒體分裂的峰值也同樣出現(xiàn)在12～24 h時(shí)間段。

需要指出的是，由于離心運(yùn)動(dòng)及針刺干預(yù)后線粒體的動(dòng)態(tài)變化較為明顯，進(jìn)行前后多時(shí)間點(diǎn)的連續(xù)研究顯得尤為重要，建議后續(xù)進(jìn)行線粒體分裂方面的相關(guān)研究時(shí)，若只能取單一時(shí)間點(diǎn)時(shí)，最好選在運(yùn)動(dòng)后12 h，可能會(huì)更為準(zhǔn)確。本研究還存在一定不足，線粒體分裂-融合是其動(dòng)力學(xué)的重要過(guò)程，線粒體的融合與線粒體功能恢復(fù)密不可分，因此檢測(cè)線粒體的融合現(xiàn)象也是非常重要的，本課題組將進(jìn)行相關(guān)后續(xù)研究。

4 結(jié)論

單純針刺未引起線粒體明顯分裂，大負(fù)荷離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌線粒體出現(xiàn)明顯的分裂現(xiàn)象，并在12 h、24 h 達(dá)到峰值，針刺干預(yù)可有效改善運(yùn)動(dòng)所致的線粒體片段化，降低了線粒體分裂程度，有利于線粒體的功能恢復(fù)。