肌生成抑制素（MSTN）抗體對肩袖撕裂后肌肉退變的治療效果

林金榕 田家齊 孫亞英 羅家宇 陳聞波 劉少華 陳疾忤

1 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科（上海200040）

2 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院放射科（上海200040）

3 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)（上海200040）

肩袖撕裂是一種導(dǎo)致肩部疼痛、肩關(guān)節(jié)活動范圍受限甚至肢體障礙的常見疾病。關(guān)節(jié)鏡下修復(fù)肩袖撕裂是目前治療的主要手段，取得了較為滿意的臨床療效[1，2]。然而，對于巨大肩袖撕裂（massive rotatorcuff?tear，MRCT）患者，術(shù)后肩袖的愈合和功能恢復(fù)仍然是巨大挑戰(zhàn)。MRCT患者常常伴有肌腱回縮、肌肉退變等多種病理改變[3-5]。在這些因素中，肌肉退變是已經(jīng)明確的導(dǎo)致肩袖再撕裂和術(shù)后不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素[6，7]。肩袖肌肉退變包括肌纖維萎縮、組織纖維化、脂肪浸潤伴肌內(nèi)脂肪細(xì)胞積聚[8]。在晚期病例中，90%的纖維束表現(xiàn)出部分退行性特征，超過一半的活檢樣本完全不含肌纖維[9]。因此，肌肉退變的肩袖術(shù)后功能不佳，并且肌肉退變導(dǎo)致的肌肉高張力使得肩袖再撕裂率較高[10]。

肌生成抑制素（myostatin，MSTN），也被稱為生長分化因子8（growth differentiation factor 8，GDF8），屬于轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成員，于1997年在小鼠體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)[11]。據(jù)報(bào)道，MSTN 對肌肉生長發(fā)育有負(fù)調(diào)控作用，它與肌肉損失和退變密切相關(guān)[12]。MSTN 通過與膜受體結(jié)合，上調(diào)包括肌肉特異性環(huán)指蛋白1（muscle-specif?ic RING finger protein 1，MuRF1）和 肌萎縮蛋 白Fbox-1（muscle atrophy Fbox-1，Atrogin1）在內(nèi)的分解代謝蛋白[13]，下調(diào)包括磷酸化蛋白激酶（phosphorylat?ed AKT，p-Akt）在內(nèi)的合成代謝蛋白[14]，從而導(dǎo)致肌肉損失。

以往有研究報(bào)道拮抗MSTN 策略在肌肉損失相關(guān)疾病中的作用[15，16]，尚未見研究探討拮抗MSTN策略在肌萎縮、纖維化、脂肪浸潤等肌肉退變中的作用。本研究探討MSTN 抗體在小鼠肩袖撕裂模型中對抗肌肉退變的能力。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立

10周齡雄性C57BL/6小鼠18只，體重22.8 ±1.39 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXX（滬）2012-0002。所有動物實(shí)驗(yàn)均按照動物飼養(yǎng)和使用的指導(dǎo)原則進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)當(dāng)?shù)貏游镲曫B(yǎng)委員會批準(zhǔn)。研究設(shè)計(jì)流程如圖1所示。

圖1 研究設(shè)計(jì)流程圖

按照既定方案，建立小鼠MRCT 模型誘導(dǎo)岡上肌退變[17]。在2%異氟醚氧全身麻醉下，用一次性使用解剖器（北京博?？翟瘁t(yī)療器械有限公司）橫切切斷左肩岡上、岡下肌腱和肩胛上神經(jīng)。同時(shí)，對另外6只小鼠的左肩進(jìn)行假手術(shù)。在6 只行假手術(shù)小鼠中，逐層切開皮膚和肌肉，識別岡上、岡下肌腱及肩胛上神經(jīng)，然后縫合關(guān)閉切口[17]。術(shù)后連續(xù)3 天給予0.05 mg/kg 丁丙諾啡控制疼痛。

在手術(shù)后3周，即出現(xiàn)肌肉萎縮、纖維化和脂肪浸潤時(shí)[17]，將12 只MRCT 老鼠隨機(jī)分為注射MSTN 抗體（AF788，明尼蘇達(dá)州研發(fā)公司，美國）組（抗MSTN 組）和注射磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）組（PBS組）。注射過程中，吸入異氟醚麻醉后，觸診肩胛骨和肩胛脊。抗MSTN 組和PBS 組分別用10 μL 的漢密爾頓注射器和25 號針頭在左岡上肌撕裂部位從前向后三個(gè)點(diǎn)分別注射10 μL的20 mg/kg 的MSTN 抗體溶液和PBS 溶液[18]。注射的程序和劑量參考既往的研究[19]，從術(shù)后第4周第1天至術(shù)后第6周第1天，每周注射1 次（共3 次）。進(jìn)行假手術(shù)的6 只小鼠均未接受注射，設(shè)為正常對照組（假手術(shù)組）。

根據(jù)我們的初步數(shù)據(jù)和已經(jīng)發(fā)表的證據(jù)[20]，基于檢驗(yàn)效能1-β=0.80和檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05的功效分析，每組6 只小鼠足以證明PBS 組和抗MSTN 組預(yù)估的15%的差異。

1.2 磁共振成像（MRI）

術(shù)后第7周第1天，在麻醉狀態(tài)下用3.0T水平磁鐵（Discovery MR750；通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，美國）和60 mm 直徑梯度線圈（江陰萬康醫(yī)療科技，中國）對麻醉下小鼠岡上肌進(jìn)行MRI 測量。采用3D 梯度回波成像序列對所有動物進(jìn)行T1WI 圖像的多片掃描（30 片，1 mm 片厚，1 mm 片間距離）。重復(fù)時(shí)間（TR）和回聲時(shí)間（TE）分別為12 ms 和6 ms。圖像使用6×6 cm 視野大小和256×256 矩陣生成。掃描時(shí)間為3 分鐘。MRI確定肱骨頭后，于第三平面得到岡上肌橫截面（CSA）。使用Image J 軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）對岡上肌橫截面積進(jìn)行定量，并根據(jù)PBS 組結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 肌肉宏觀指標(biāo)測量

MRI檢查后，立即將小鼠頸椎脫臼安樂死，取左肩岡上肌。肌肉分離后立即測定岡上肌的濕重，并根據(jù)術(shù)后第7 周第1 天小鼠體重，標(biāo)化岡上肌重量，得到標(biāo)化后的岡上肌重量。測量岡上肌肌肉的長度（l）、寬度（w）、高度（h）等參數(shù)。岡上肌肌肉體積估計(jì)值（v）假設(shè)為橢球體，計(jì)算公式為[21]：

1.4 組織學(xué)分析

上述觀察后，立即將肌肉組織在4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)乙醇梯度脫水后，將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋，冷卻后將蠟塊置于切片機(jī)上，切成4 μm厚的切片。分別進(jìn)行蘇木精伊紅（HE）染色和馬松（Masson）染色[22，23]。通過倒置光學(xué)顯微鏡（IX71SBF2；Olympus，東京，日本）和DP72 數(shù)碼成像裝置（Olym?pus）觀察組織切片。在同一樣本的5 張HE 切片上測量，得到中位肌纖維橫截面積（CSA）。在HE切片中用總肌纖維面積與脂肪空泡面積的比值計(jì)算相對值，得到脂肪浸潤率。根據(jù)Masson染色上膠原陽性面積與總肌纖維面積的比值計(jì)算相對值，得到反映纖維化的脂肪浸潤率。結(jié)果根據(jù)假手術(shù)組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。使用Image J 軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）對來自同一樣本的5張切片的膠原沉積和脂肪空泡進(jìn)行定量。

1.5 免疫組織化學(xué)觀察

為了進(jìn)一步分析MSTN 抗體對肌肉萎縮和纖維化的影響，我們利用免疫組化將分解代謝標(biāo)志物（MuRF1和Atrogin1）和合成代謝標(biāo)志物（p-Akt）定位于肌纖維并進(jìn)行定量分析；分別通過Masson染色和α-SMA免疫組化測定膠原沉積程度和肌成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行定量分析。免疫組化分析按照既定的方案進(jìn)行[24]，4 μm石蠟包埋的組織切片在二甲苯-脫蠟，而后在梯度酒精/水中系列中再水化。緊接著用一抗孵育1小時(shí)，用PBS溶液洗滌3 次，用對應(yīng)的結(jié)合辣根過氧化物酶的二抗在室溫下孵育30 分鐘，然后再用PBS 溶液洗滌3 次。使用的抗體包括p-Akt抗體（bs-0876R，博奧森生物，中國）、MuRF1 抗體（bs-2539R，博奧森生物，中國）、Atrogin1 抗體（bs-2591R，博奧森生物，中國）、α-SMA 抗體（ab124964，Abcam，美國）和山羊抗兔IgG H&L（ab6721，Abcam，美國）。使用Image J 軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）對來自同一樣本的5 張切片的免疫組化陽性區(qū)域進(jìn)行灰度值量化分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異通過方差分析確定，然后在Graphpad Prism 5（圣地亞哥，美國）上進(jìn)行事后Bonferroni 檢驗(yàn)。P<0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)結(jié)果

與假手術(shù)組相比，PBS組和抗MSTN組的岡上肌橫截面積均顯著降低（P<0.001），且抗MSTN 組岡上肌橫截面積顯著高于PBS 組（P<0.05）（圖2），說明MSTN 抗體延緩了萎縮的進(jìn)展。

2.2 宏觀觀測結(jié)果

各組岡上肌的代表圖如圖3 所示。3 組的岡上肌形狀有顯著差異。術(shù)后6周，岡上肌重量、標(biāo)化后的重量和體積，PBS 組和抗MSTN 組均顯著低于假手術(shù)組（P<0.001），同時(shí)PBS組顯著低于抗MSTN組（P<0.001）（表1）。

圖2 岡上肌橫截面積磁共振成像結(jié)果

圖3 三組岡上肌的代表性圖像

表1 術(shù)前及術(shù)后6周小鼠體重，術(shù)后6周岡上肌重量、標(biāo)化后的重量和體積

2.3 組織學(xué)和免疫組化結(jié)果

HE 染色顯示，與假手術(shù)組肌纖維相比，PBS 組和抗MSTN 組的岡上肌均有較多的纖維，且纖維區(qū)域不均勻，細(xì)胞核集中，提示肌腱和神經(jīng)切除后發(fā)生肌肉萎縮和生長過程，結(jié)果與既往研究一致[25，26]?？筂STN組中肌纖維橫截面積（1576.40 ± 674.18 μm2）顯著高于PBS 組（1309.91 ± 638.19 μm2，P<0.05），但仍顯著低于假手術(shù)組（1946.37 ± 586.58 μm2，P<0.001）。與之相應(yīng)的，抗MSTN組中的脂肪浸潤面積顯著低于PBS組（P<0.01），但仍然高于假手術(shù)組（P<0.001）（圖4）。

由圖5 可知，與PBS 組相比，MSTN 抗體注射后顯著抑制了MuRF1 和Atrogin1 的上調(diào)表達(dá)（均P<0.001）。另一方面，與PBS組相比，抗MSTN組中p-Akt水平顯著提高（P<0.001），但仍低于假手術(shù)組。結(jié)果表明，注射MSTN 抗體能延緩肌腱和神經(jīng)橫斷后導(dǎo)致的岡上肌萎縮。

由圖6 可知，無論是否注射MSTN 抗體，肌腱和神經(jīng)切除術(shù)后的膠原沉積程度和α-SMA陽性區(qū)域均顯著高于假手術(shù)組。但膠原沉積程度和α-SMA陽性區(qū)域在抗MSTN 組都低于PBS 組（均P<0.001），這一結(jié)果表明MSTN抗體具有抑制纖維化的作用。

3 討論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)是：MSTN抗體注射能有效地阻止肌肉萎縮，抑制MRCT 小鼠模型的肌肉纖維化和脂肪浸潤。

多種細(xì)胞參與了肌肉退變的過程，包括肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞和纖維脂肪前體細(xì)胞等。并且TGF-β信號通路在各種細(xì)胞類型中均被激活[27]，因此直接拮抗TGF-β信號通路的激活對于肌肉退變具有治療潛力。Davies 等報(bào)道給予TGF-β受體1 抑制劑SB431542 可以預(yù)防肩袖撕裂后肌肉的退變[28]。MSTN屬于TGF-β超家族，與TGF-β共享多個(gè)信使[29]，因此具有治療潛力。本研究證實(shí)了MSTN 抗體注射在治療肌肉萎縮，纖維化和脂肪浸潤中的作用。

既往研究通過切斷肩袖肌腱和肩胛上神經(jīng)，建立小鼠肩袖撕裂后的肌肉退變模型，術(shù)后2 周即出現(xiàn)明顯的萎縮、纖維化和脂肪浸潤[28]。本研究在術(shù)后6周時(shí)也發(fā)現(xiàn)了明顯的肌肉退變。Kuenzler等[10]報(bào)道，在肩袖肌腱和肩胛上神經(jīng)切斷術(shù)后6 周，岡上肌的平均重量降至12.3 mg，本研究中降至11.12 mg。這些結(jié)果表明了該模型建立的可重復(fù)性。

圖4 HE染色及肌纖維平均橫截面積、脂肪浸潤的定量分析結(jié)果

圖5 肌纖維MuRF1、Atrogin1和p-Akt的免疫組化染色及定量分析

圖6 肌纖維Masson染色、α-SMA免疫組化及定量分析

基于該模型的可靠性，我們進(jìn)一步探究了MSTN抗體注射對肌肉退變的影響。影像學(xué)和組織學(xué)檢查結(jié)果表明MSTN 抗體注射可提高岡上肌的橫截面積、肌肉重量和肌肉體積，證實(shí)了其抗萎縮作用。這些結(jié)果與人類組織中觀察到的結(jié)果一致[9，30]。由于肌肉萎縮是蛋白質(zhì)合成與降解之間的失衡，因此我們分析了肌纖維中與萎縮和肥大相關(guān)蛋白的表達(dá)。MSTN 通過叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1（FOXO1）上調(diào)兩個(gè)主要的與萎縮相關(guān)的泛素連接酶MuRF1 和Atrogin1[31，32]。FOXO1 還可以抑制肌肉合成代謝所需的Akt 的激活[33]?？偟膩碚f，MSTN 使合成代謝和分解代謝失衡，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉萎縮。通過本研究的免疫組化結(jié)果可知，MSTN抗體通過增加肌纖維中p-Akt的表達(dá)、降低MuRF1和Atrogin1的表達(dá)，阻止肌肉的萎縮。

除了上述抑制肌肉萎縮的作用，MSTN抗體注射還能影響纖維化的形成[34]。膠原沉積阻礙肌肉再生，并削弱肌肉功能[35]。作為TGF-β超家族的成員，MSTN與受體ActRIIB 結(jié)合并激活下游Smad 蛋白，進(jìn)而通過α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞啟動纖維化過程[36，37]。在本研究中，MSTN抗體注射后，膠原沉積和α-SMA 陽性的面積顯著降低，表明MSTN 抗體具有抑制纖維化的作用。

本研究具有以下優(yōu)點(diǎn)。首先，采用免疫組織化學(xué)染色法，而不是簡單地通過免疫印跡法來測量蛋白的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白的定位。不同的細(xì)胞甚至對同一種蛋白也有不同的反應(yīng)。例如，Akt的激活促進(jìn)了肌纖維的肥大，但在成纖維細(xì)胞中可能起促纖維化的作用[38]，因此，測量整個(gè)組織的蛋白水平并不具有代表性。其次，為了模擬臨床實(shí)踐，本研究用MRI來評估岡上肌的橫截面積。雖然二維MRI在描述肩袖肌肉退變方面的可靠性受到質(zhì)疑[39]，但是本研究進(jìn)一步測量的岡上肌重量和體積等結(jié)果提示本研究的結(jié)果是可靠的。本研究也有一些局限性，例如無法測量小鼠肩袖岡上肌的肌力。MSTN 抗體治療對其他細(xì)胞群的影響還需要進(jìn)一步研究來確定。

4 結(jié)論

MSTN 抗體注射可減輕小鼠巨大肩袖撕裂后的岡上肌萎縮、纖維化和脂肪浸潤。