Lactobacillus plantarum M616生長(zhǎng)及代謝特性研究

程 強(qiáng)，陳 迪，王金水

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

傳統(tǒng)酸面團(tuán)在我國(guó)有悠久歷史，又稱(chēng)酵子、面肥、酵頭等，其體系復(fù)雜，包含乳酸菌、醋酸菌、酵母菌等多種微生物[1]。在酸面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中，多菌種相互作用，協(xié)同發(fā)酵，產(chǎn)生豐富的營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味物質(zhì)[2]。相對(duì)于單一的酵母發(fā)酵，酸面團(tuán)具有以下優(yōu)勢(shì)：酸面團(tuán)在發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌會(huì)產(chǎn)生乳酸、甲酸、乙酸等有機(jī)酸，能有效降低酸面團(tuán)體系的pH值，同時(shí)，低pH值環(huán)境能激活面團(tuán)內(nèi)源蛋白酶，促進(jìn)面團(tuán)面筋蛋白的降解，提高面團(tuán)延展性[3]；乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中利用酸面團(tuán)中的麥芽糖產(chǎn)生胞外多糖，提高面團(tuán)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并改善面團(tuán)結(jié)構(gòu)[4]；在酸面團(tuán)體系中，乳酸菌與酵母菌相互作用，發(fā)酵產(chǎn)生酸類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、芳香族化合物等風(fēng)味物質(zhì)，形成了面團(tuán)體系的風(fēng)味豐富性[5]；在酸面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌素、乙醇、過(guò)氧化氫等抑菌物質(zhì)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌具有一定的抑制作用，有利于延長(zhǎng)酸面團(tuán)產(chǎn)品的保質(zhì)期[6]。

在酸面團(tuán)體系眾多的微生物中，植物乳桿菌作為體系中的優(yōu)勢(shì)種群之一，對(duì)酸面團(tuán)的品質(zhì)有著重要貢獻(xiàn)[7]。植物乳桿菌M616為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株，作者對(duì)其生長(zhǎng)及代謝特性展開(kāi)分析，主要研究了植物乳桿菌M616的生長(zhǎng)特性、產(chǎn)酸能力，耐酸、耐鹽、耐膽鹽的能力，以及對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等致病菌的抑制能力，為其在酸面團(tuán)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：植物乳桿菌M616、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌,均為河南工業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.005 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，調(diào)節(jié)pH 6.2～6.7，將培養(yǎng)基分裝入錐形瓶?jī)?nèi)115 ℃滅菌后，冷卻備用[8]。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂15 g/L，調(diào)節(jié)pH 6.2～6.7，將培養(yǎng)基分裝滅菌。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g, 用蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，調(diào)節(jié)pH 7.2～7.6，將培養(yǎng)基分裝入錐形瓶?jī)?nèi)115 ℃滅菌后，冷卻備用， 固體培養(yǎng)基另補(bǔ)加瓊脂粉15.0 g。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，氯化鈉 5.0 g，牛肉膏粉 3.0 g，瓊脂 15.0 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，調(diào)節(jié)pH 7.2～7.3，將培養(yǎng)基分裝入錐形瓶?jī)?nèi)115 ℃滅菌后，冷卻備用。

1.2 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)：蘇州開(kāi)泰實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司；Forma 88000 超低溫冰箱：美國(guó)Thermo 公司；恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平、實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Pekin Elme公司；紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)：廣州步步宏科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)：鄭州金友寧有限公司；QUANTA FEG 250 掃描電鏡：美國(guó)FEI公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作。將植物乳桿菌M616菌種接種至滅菌后的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放置搖床中37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，活化。取1 mL活化好的菌液到已滅過(guò)菌的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，再次放于搖床中37 ℃下培養(yǎng)8 h，使菌株OD600 nm值達(dá)到0.5左右，菌液備用。

1.3.2 菌種形態(tài)觀察

取已經(jīng)活化好的菌液用無(wú)菌水依次稀釋10-1～10-5，然后取1 mL接種至裝有MRS固體培養(yǎng)基的平板中，用玻璃涂布棒輕輕涂抹均勻。將平板倒置，放入培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用接種環(huán)刮取少量菌，進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。

2.5%戊二醛配制：將0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)50 mL與25%戊二醛水溶液10 mL混合，用蒸餾水定容至1 000 mL。固定：挑取固體培養(yǎng)基表面菌體少許，加入到含有2.5%戊二醛固定液的離心管中，振蕩至分散均勻，固定2～4 h，然后3 000 r/min離心15 min，去除上清液。漂洗：在離心管中加入PBS緩沖液清洗3次，再用超純水清洗2次，每步均在3 000 r/min下離心15 min，去除上清液。脫水：在離心管中依次加入30%、50%、70%、90%乙醇脫水15 min，離心后用乙醇、叔丁醇各自置換10 min，每一步驟后均需離心棄去上清液，最后制成叔丁醇菌懸液。取叔丁醇菌懸液1 mL滴加在錫箔紙上，-20 ℃預(yù)凍后放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。干燥完成后噴金并進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

在超凈工作臺(tái)上，取活化后的菌懸液1 mL至滅過(guò)菌的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放至37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔3 h取樣，以沒(méi)有加入活化菌株的液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，在600 nm處測(cè)定其光密度OD600 nm。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的光密度為縱坐標(biāo)繪制菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.4 產(chǎn)酸性能測(cè)定

在超凈工作臺(tái)上，取活化后的菌液2 mL至100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放至37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取出菌液，用pH計(jì)測(cè)量菌液的pH值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的pH值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的產(chǎn)酸特性曲線(xiàn)。

1.3.5 耐酸性能測(cè)定

在超凈工作臺(tái)上，分別取活化過(guò)的菌液1 mL至用鹽酸分別調(diào)至pH值為2.0、3.0、4.0 的100 mL MRS培養(yǎng)基中。37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取出菌液，取至第6小時(shí)。以未添加鹽酸的菌懸液培養(yǎng)基為對(duì)照，在600 nm處測(cè)定菌液的光密度。

1.3.6 耐鹽性能測(cè)定

在超凈工作臺(tái)上，分別取活化后的菌液1 mL至NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放置于搖床中37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，以沒(méi)有加入NaCl的液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，24 h后測(cè)定600 nm下的發(fā)酵液光密度。

1.3.7 耐膽鹽性能測(cè)定

在超凈工作臺(tái)上，分別取活化后的菌液1 mL至分別加有0.03、0.1、0.2、0.3 g牛膽鹽滅過(guò)菌的100 mL MRS培養(yǎng)基中，放置在搖床中37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔1 h取出菌液，取至第4小時(shí),在600 nm處測(cè)定菌液的光密度。

1.3.8 抑菌性測(cè)定

1.3.8.1 指示菌的活化

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌3種致病菌分別接種至滅過(guò)菌的100 mL LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)16～20 h。

1.3.8.2 雙層平皿的制備

取滅菌過(guò)的培養(yǎng)皿，分別對(duì)平皿傾注固體LB培養(yǎng)基20 mL，在平皿內(nèi)均勻攤鋪，水平放置使冷卻凝固作為底層備用。然后另取滅過(guò)菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至48～50 ℃，每100 mL加入40 μL活化好的致病菌菌懸液，混勻后取5 mL倒入凝固的底層培養(yǎng)基上，并使其均勻分開(kāi)，作為培養(yǎng)基的第2層。最后，取滅過(guò)菌的牛津杯4個(gè)，保持間隔距離相同，放置平板中，使其自然沉降，待第2層凝固，備用。

1.3.8.3 植物乳桿菌M616抑菌實(shí)驗(yàn)

取活化好的乳酸菌發(fā)酵液，6 000 r/min離心15 min，把上清液梯度稀釋?zhuān)謩e為1×稀釋、5×稀釋、10×稀釋?zhuān)诿總€(gè)雙層平皿中的牛津杯中分別用移液槍滴裝200 μL稀釋液，封口，放入冰箱4 ℃靜置3 min，取出放入生化培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)16～20 h，測(cè)量各個(gè)抑菌圈直徑。牛津杯外徑為8 mm，抑菌圈C=8 mm為無(wú)抑菌活性，8 mm15 mm為高度抑菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌M616形態(tài)觀察

植物乳桿菌M616的形態(tài)觀察結(jié)果如圖1所示。從圖1a可以看出，乳酸菌在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h后，MRS固體平板上長(zhǎng)出許多乳白色光滑的菌落，呈圓形，表面凸起，濕潤(rùn)易挑起。從圖1b可以看出，經(jīng)過(guò)革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到植物乳桿M616呈紫色，由此可判斷植物乳桿菌M616是革蘭氏陽(yáng)性菌。用掃描電鏡觀察植物乳桿菌M616的形態(tài)如圖1c所示，該菌呈直或彎的短桿狀，菌體大小約為2.0 μm×0.4 μm，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，單個(gè)或成對(duì)、成鏈狀排列。

圖1 植物乳桿菌M616的形態(tài)觀察結(jié)果Fig.1 Morphology of Lactobacillus plantarum M616

2.2 植物乳桿菌M616的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和產(chǎn)酸曲線(xiàn)

植物乳桿菌M616生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖2所示，在0～3 h內(nèi)菌體增長(zhǎng)緩慢，處于生長(zhǎng)延遲期；4 h后，菌株快速增殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在20 h后曲線(xiàn)趨于平緩，此階段活菌數(shù)變化不大，生長(zhǎng)與死亡菌體數(shù)量達(dá)到平衡。

圖2 植物乳桿菌M616的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.2 Growth curve of Lactobacillus plantarum M616

產(chǎn)酸曲線(xiàn)如圖3所示，植物乳桿菌M616可在較短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)酸，使菌液pH值迅速下降。在前15 h，pH值由初始6.07下降至4.48，經(jīng)過(guò)30 h后下降到了3.89，顯示了菌株良好的產(chǎn)酸能力。pH值判斷法是評(píng)價(jià)乳酸桿菌的產(chǎn)酸性能方法之一[9]。張艷萍等[10]在篩選乳酸菌抑菌作用的研究中，從88株乳酸菌中篩選出29株產(chǎn)酸能力較好的菌株，其pH值在4.50～4.65之間。

圖3 植物乳桿菌M616的產(chǎn)酸能力Fig.3 Acid production ability of Lactobacillus plantarum M616

與之相比，植物乳桿菌M616生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)4 h即可進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，同時(shí)菌株還具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，在進(jìn)入穩(wěn)定期后，產(chǎn)酸仍在繼續(xù)。由此可見(jiàn)，植物乳桿菌M616具有良好的生長(zhǎng)活性，可初步判斷該菌株具有潛在的發(fā)酵性能。

2.3 植物乳桿菌M616耐酸性能

植物乳桿菌M616在pH值為2.0、3.0、4.0時(shí)的生長(zhǎng)情況如圖4所示。

圖4 不同pH值對(duì)植物乳桿菌M616生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different pH values on the growth of Lactobacillus plantarum M616

圖4表明，不同的pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不同，植物乳桿菌M616在接種初期的6 h內(nèi)，隨著pH值升高，生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì)，pH 4.0時(shí)菌株生長(zhǎng)最快。在pH 2.0和pH 3.0的液體培養(yǎng)基中，菌株生長(zhǎng)緩慢。在3 h后植物乳桿菌在pH 3.0的環(huán)境下較pH 2.0生長(zhǎng)速率快，表明低pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)有抑制作用。在pH 4.0條件下，菌株在2 h之后逐漸適應(yīng)了酸性環(huán)境，生長(zhǎng)速率快速增長(zhǎng)，OD600 nm由2 h的0.05快速增長(zhǎng)至6 h的0.25，而在pH 2.0、3.0條件下，變化不明顯。

2.4 植物乳桿菌M616耐鹽性能

植物乳桿菌M616在NaCl不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的生長(zhǎng)情況如圖5所示。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl對(duì)植物乳桿菌M616生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different mass fractions of NaCl on the growth of Lactobacillus plantarum M616

由圖5可知，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，菌體的生長(zhǎng)速率持續(xù)降低。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于4%時(shí)其生長(zhǎng)速率下降緩慢，抑制作用較弱；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～8%時(shí)生長(zhǎng)速率快速下降，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于8%時(shí)菌株生長(zhǎng)緩慢，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，菌體生長(zhǎng)抑制效應(yīng)愈明顯，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到8%以上時(shí)菌株幾乎不能生長(zhǎng)。由此可見(jiàn)，菌株生長(zhǎng)速率和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，環(huán)境中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，菌體生長(zhǎng)越受抑制。對(duì)比湯偉等[11]分離的消化乳桿菌W639 菌株的耐鹽試驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%條件下仍然可以生長(zhǎng)，可判斷出M616的耐鹽性能一般。植物乳桿菌在泡菜以及肉制品中發(fā)酵的條件是在不低于5%的鹽水條件下仍然可以正常存活。由此可見(jiàn)，植物乳桿菌M616具有一定的耐鹽性，可適用于食品發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)。

2.5 植物乳桿菌M616耐膽鹽性能

研究了植物乳桿菌M616在4種不同膽鹽質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，其生長(zhǎng)的變化情況如圖6所示。

圖6 不同質(zhì)量濃度的牛膽鹽對(duì)植物乳桿菌M616生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different mass concentrations of bile salt on the growth of Lactobacillus plantarum M616

圖6顯示，在膽鹽質(zhì)量濃度為0.03 g/100 mL的條件下，植物乳桿菌M616的生長(zhǎng)受抑制較小，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，其光密度呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，說(shuō)明在0.03 g/100 mL的低膽鹽質(zhì)量濃度環(huán)境中菌株的生長(zhǎng)幾乎不受影響。菌株在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3 g/100 mL條件下，其生長(zhǎng)速率均緩慢地上升，其中在0.3 g/100 mL的條件下生長(zhǎng)最慢。4 h時(shí)，菌株在0.3 g/100 mL條件下的生長(zhǎng)速率略微降低。對(duì)比蒙月月等[12]的植物乳桿菌KLDS1.0318的耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果，植物乳桿菌M616在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.03、0.1、0.2 g/100 mL時(shí)的生長(zhǎng)速率均超過(guò)KLDS1.0318，表明植物乳桿菌M616具有良好的耐膽鹽能力。

2.6 植物乳桿菌M616的抑菌性

對(duì)植物乳酸桿菌M616發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌性測(cè)試，選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌作為測(cè)試菌，結(jié)果如圖7、圖8 所示。

圖8 植物乳桿菌M616的抑菌圈直徑Fig.8 Diameter of inhibition zone of Lactobacillus plantarum M616

圖7顯示，植物乳桿菌M616發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌均有一定的抑制作用。發(fā)酵液10倍稀釋?zhuān)詫?duì)3種測(cè)試菌表現(xiàn)出抑菌效果，隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的降低，抑菌圈直徑逐漸變大。從圖8可看出，對(duì)大腸桿菌的抑菌直徑由10倍稀釋的10 mm增加到14 mm，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌直徑由10倍稀釋的11 mm增加到15 mm，其中對(duì)單增李斯特菌的抑菌效果最為明顯，由最小的11 mm增加到最大的17 mm，增加了54.5%。陸春波等[13]通過(guò)對(duì)植物乳桿菌DY6發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)做初步分離研究，發(fā)現(xiàn)主要抑菌物質(zhì)為小分子有機(jī)酸和脂肪酸。乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生多種抑菌成分，如有機(jī)酸(乳酸、甲酸、乙酸等)、乙醇、細(xì)菌素等[14]。有機(jī)酸對(duì)有害菌的抑制機(jī)制最常見(jiàn)有兩種：一是有機(jī)酸通過(guò)與細(xì)菌細(xì)胞膜上脂多糖等成分結(jié)合，破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，降低了細(xì)胞的活性，從而達(dá)到抑菌效果；二是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸降低了細(xì)菌胞內(nèi)的pH值，影響了細(xì)菌的代謝活動(dòng)，從而達(dá)到抑制作用[15]。

3 結(jié)論

以植物乳桿菌M616作為研究對(duì)象，對(duì)其基本形態(tài)、生長(zhǎng)曲線(xiàn)、產(chǎn)酸能力、耐酸、耐鹽、耐膽鹽及抑菌能力進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：植物乳桿菌M616為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌株呈直或彎曲的桿狀，無(wú)芽孢；植物乳桿菌M616生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)4 h后，開(kāi)始進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；植物乳桿菌M616在37 ℃ MRS搖瓶中發(fā)酵30 h,pH值達(dá)3.89；該菌株能耐受pH 3.0的酸度和8%的NaCl及0.2%的牛膽鹽；植物乳桿菌M616的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及單增李斯特菌具有抑制作用，其中對(duì)單增李斯特菌的抑制效果最好。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可為此菌株在酸面團(tuán)發(fā)酵中的應(yīng)用奠定一定的生物學(xué)基礎(chǔ)。