固相透明質(zhì)酸-單精子選擇裝置在卵胞漿單精子注射術(shù)中的應(yīng)用研究*

方東 董波 林悠悠 宋焱鑫

（河南省洛陽市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)研究所 洛陽471000）

透明質(zhì)酸（Hyaluronic-Acid,HA）是人類卵子和透明帶黏液基質(zhì)的主要成分[1]。有學(xué)者研究表明，人類精子可產(chǎn)生至少兩個能與HA 特異結(jié)合的蛋白位點(diǎn)。這種結(jié)合位點(diǎn)只存在于成熟后期的精子中，不成熟的精子缺乏HA 受體，不具備與HA 結(jié)合的能力[2～5]。在人類輔助生殖技術(shù)中，常利用卵胞漿單精子注射術(shù)（ICSI）治療因重度少、弱、畸精子癥等引起的不孕癥。本研究探討固相透明質(zhì)酸-單精子選擇裝置在卵胞漿單精子注射術(shù)中的應(yīng)用。現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2018 年4 月～2020 年1月收治的不孕不育夫婦90 對為研究對象。均行ICSI 治療，40 對采用固相透明質(zhì)酸-單精子選擇裝置進(jìn)行單精子顯微注射術(shù)助孕治療為HA-ICSI 組，50 對采用常規(guī)單精子顯微注射術(shù)助孕治療為常規(guī)ICSI 組。HA-ICSI 組男年齡 21～38 歲，平均（29.63±3.26）歲；女年齡 20～37 歲，平均（28.96±3.41）歲；睪丸體積 26～34 ml，平均（30.26±1.25）ml；睪酮水平354～679 ng/ml，平均（516.53±60.32）ng/ml；獲卵數(shù)4～12 個，平均（8.26±1.03）個。常規(guī) ICSI 組男年齡20～39 歲，平均（28.95±3.30）歲；女年齡 21～38 歲，平均（28.36±3.12）歲；睪丸體積25～35ml，平均（30.57±1.08）ml；睪酮水平 349～685 ng/ml，平均（521.31±58.74）ng/ml；獲卵數(shù) 5～13 個，平均（8.45±0.97）個。兩組基線資料（男女方年齡、睪丸體積、睪酮水平、獲卵數(shù)）均衡可比（P＞0.05）。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn) （1）納入標(biāo)準(zhǔn)：女方性激素水平正常，且經(jīng)B 超檢查顯示卵巢功能正常；男方病理檢查結(jié)果重度少精、弱精子癥；知情本研究并簽署知情同意書。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：男方合并睪丸萎縮等先天性疾?。话樾詡鞑ゼ膊。幻谀蛏诚到y(tǒng)感染；女方合并輸卵管積水等致不孕癥的疾病。

1.3 研究方法

1.3.1 收集精子 （1）射出精子。男方禁欲3～7 d，于取精日清潔外陰及雙手，手淫法獲取精液，留取精液于無菌容器內(nèi)，放置于37℃水浴箱進(jìn)行液化。14 ml 錐形管中自下而上依次加入1 ml 濃度為90%、45%的Spermgrad 梯度離心液，最后在最上層加入2 ml 液化的精液，離心 30 min（1 600 r/min），上層精漿去除，留取離心管底部沉淀0.3 ml，加入G-IVF（VitroLife 公司培養(yǎng)液）精子洗滌液3 ml，重懸離心洗滌 1 次，離心 10 min（1 600 r/min），棄上清，再加入2 ml G-IVF 混勻，放入培養(yǎng)箱中備用。（2）附睪精子。對術(shù)野進(jìn)行常規(guī)消毒鋪巾，采用5 ml 注射器先吸取GMOPS-PLUS 精子洗滌液1 ml，對附睪頭部固定后直接穿刺進(jìn)入，保持負(fù)壓后退出，于顯微鏡下（×400）對抽吸出含附睪液的培養(yǎng)液進(jìn)行精子尋找。對于多次抽吸未發(fā)現(xiàn)精子者，改為睪丸穿刺取精。（3）睪丸精子。對術(shù)野進(jìn)行常規(guī)消毒鋪巾，1%利多卡因局部麻醉。選用12 號針經(jīng)皮穿刺進(jìn)入睪丸內(nèi)，采用50 ml 注射器保持負(fù)壓后退出，吸出的生精小管移至GMOPS-PLUS 精子洗滌液中，將曲細(xì)精管磨碎后倒置顯微鏡下（×400）進(jìn)行精子尋找。見活動精子后將標(biāo)本吸入錐形管，加入3 ml GMOPS-PLUS混勻，室溫靜止15 min 后將上清吸出，只留下少許曲細(xì)精管沉渣。吸出的上清移入14 ml 離心管離心10 min（1 600 r/min），棄上清，沉淀物加入2 ml G-IVF 混勻，放入培養(yǎng)箱中備用。

1.3.2 促排卵方案 采用促卵泡生成素、促性腺激素激動劑、絨毛膜促性腺激素（HCG）、人絕經(jīng)期促性腺激素長方案超促排卵。促性腺激素應(yīng)用4 d 后，利用B 超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)2 個卵泡直徑＞18 mm 時，于當(dāng)晚9:00 進(jìn)行HCG 肌肉注射，劑量10 000 IU，36 h 后取卵。取出卵子置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.3 ICSI 操作 取卵后4～6 h 利用透明質(zhì)酸酶消化卵子顆粒細(xì)胞，之后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min 后選擇見到極體的MⅡ卵進(jìn)行顯微注射。HA-ICSI 組：選用深圳博瑞德公司生產(chǎn)的固相透明質(zhì)酸-單精子選擇裝置進(jìn)行顯微注射。首先將HA-ICSI 裝置從4℃冰箱中取出平衡至室溫。吸取20～30 μl 經(jīng)步驟1.3.1分離后的精子至HA-ICSI 裝置中心小槽內(nèi)（透明質(zhì)酸包被區(qū)域），使精子懸液盡可能布滿小槽，在小槽外區(qū)域制作PVP 和GMOPS-PLUS 微滴，之后裝置覆蓋礦物油。裝置加蓋后在ICSI 熱臺反應(yīng)1～10 min。顯微鏡下挑選被透明質(zhì)酸結(jié)合的精子。結(jié)合精子表現(xiàn)為：精子頭部被結(jié)合至固相表面難以前向運(yùn)動，但尾部鞭打劇烈。吸取被透明質(zhì)酸結(jié)合的精子至PVP 液滴制動。選擇形態(tài)好的已制動精子進(jìn)行傳統(tǒng)ICSI 操作。常規(guī)ICSI 組：在普通ICSI 皿中分別制 作 PVP 滴 、 若 干 GMOPS-PLUS 微 滴 、GMOPS-PLUS 長條。將洗滌處理后的精子加入GMOPS-PLUS 長條，用顯微注射針吸取活力和形態(tài)正常的精子進(jìn)入PVP 微滴制動，然后挑選成熟的MⅡ卵子進(jìn)行顯微注射。完成顯微注射的MⅡ卵子轉(zhuǎn)入G1-PLUS 培養(yǎng)微滴皿，放入三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。注射16～18 h 后查看受精情況，以見到雙原核（2 pn）為正常受精。48 h 后查看卵裂情況，48～72 h后選擇性移植優(yōu)質(zhì)胚胎。注射后第5、6 天觀察有無囊胚形成。自取卵日開始進(jìn)行黃體酮肌肉注射，于胚胎移植后14 d 進(jìn)行尿常規(guī)檢查，HCG 陽性者20 d后行B 超檢查，宮腔內(nèi)見孕囊、胎心搏動者診斷為臨床妊娠。

1.3.4 胚胎評分 利用形態(tài)學(xué)評估判斷胚胎質(zhì)量，根據(jù)卵裂速度、均勻度以及分裂產(chǎn)生碎片比例等進(jìn)行評分。其中卵裂速度正常，胞質(zhì)均勻，無空泡、碎片，卵裂球大小均一為1 級；卵裂速度正常，胞質(zhì)均勻，無空泡，碎片≤10%，卵裂球均勻或大致均勻為2 級；卵裂速度基本正常，細(xì)胞質(zhì)中有少量空泡，碎片11%～19%，卵裂球均勻或不均勻為3 級；卵裂速度異常，胞質(zhì)不均，有大量空泡，卵裂球不均勻，且碎片≥20%為4 級。4 級胚胎不具有發(fā)育潛能；1～3 級為可移植胚胎；1 級、2 級為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.4 觀察指標(biāo) 分析HA-ICSI 組和常規(guī)ICSI 組的卵子正常受精率、可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、臨床妊娠率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，計量資料以（）表示，采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

HA-ICSI 組卵子正常受精率、可用胚胎率高于常規(guī) ICSI 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HA-ICSI 組與常規(guī)ICSI 組的優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、臨床妊娠率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 助孕相關(guān)結(jié)局[%（例/例）]

3 討論

有學(xué)者研究顯示，精子與透明質(zhì)酸結(jié)合能力下降是精子不成熟的一種表現(xiàn)形式。頭部是否具有透明質(zhì)酸受體可作為判斷精子是否發(fā)育成熟的標(biāo)志[6]。精子發(fā)育成熟需要經(jīng)歷胞質(zhì)膨出、胞質(zhì)殘余體丟失、質(zhì)膜重塑、頭部形成透明帶和透明質(zhì)酸結(jié)合位點(diǎn)（受體）等過程。檀大羨等[7]對精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗（HBA）檢測結(jié)果與體外授精-胚胎移植術(shù)（IVF）受精結(jié)局進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)HBA 與IVF 受精率呈顯著正相關(guān)，但與ICSI 受精率無關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)和HA 結(jié)合的精子數(shù)目與IVF 受精率相關(guān)，但不能預(yù)測IVF 結(jié)局[8～9]。但該受體的存在與精子的哪些結(jié)構(gòu)成熟度有關(guān)? 具有透明質(zhì)酸受體的精子其授精能力究竟如何?目前關(guān)于此方面的研究較少。

本研究通過運(yùn)用固相透明質(zhì)酸-單精子選擇裝置進(jìn)行HA-ICSI，與常規(guī)ICSI 技術(shù)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，HA-ICSI 組正常受精率、可用胚胎率較常規(guī)ICSI 組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HA-ICSI 組優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、臨床妊娠率與常規(guī)ICSI 組比較無顯著性差異，提示具有透明質(zhì)酸受體的成熟精子其授精能力較缺少透明質(zhì)酸受體的非成熟精子更高。兩組優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、臨床妊娠率沒有明顯差異，表明胚胎后續(xù)發(fā)育能力和著床能力可能與該受體無關(guān)，提示胚胎的發(fā)育潛能可能不僅僅取決于精子的成熟度，更與卵母細(xì)胞的成熟度相關(guān)。但該結(jié)論可能與本研究樣本量較小有關(guān)，期待在該方向后續(xù)有更大樣本量的研究。綜上所述，固相透明質(zhì)酸-單精子選擇裝置可通過與具有透明質(zhì)酸受體的精子結(jié)合，從而在進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射時挑選出具有透明質(zhì)酸受體的成熟精子，提高單精子顯微注射技術(shù)的正常受精率和可用胚胎率，對提高ICSI 治療效率有一定的幫助。