建昌幫姜天麻中苯丙素類對小鼠抗暈眩作用的影響*

范暉 王麗華 劉琪琳 吳茜 張霞 簡曉宇 葉喜德#

（1 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌330004；2 江西省高安市人民醫(yī)院藥劑科 高安330800）

天麻來源于蘭科多年生寄生草本植物天麻Gastrodia elata Bl.干燥塊莖，氣微，味甘，歸肝經(jīng)，可息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)[1]，主治肝陽上亢、肝陽化風(fēng)之眩暈頭痛、手足震顫、風(fēng)濕痹痛、小兒驚風(fēng)等。天麻主含天麻素、苯丙素類如β-苯丙烯酸（又名肉桂酸）、巴利森苷類等。天麻與鉤藤、羚羊角等藥對開展研究較多[2]，很少涉及炮制。文獻也以天麻素和巴利森苷類成分研究較多[3]。對于苯丙素類[4]，目前文獻多為其分子結(jié)構(gòu)研究，未見針對天麻中該成分藥理作用的研究。苯丙素類如肉桂酸，可減少大鼠心肌缺血再灌注造成的損傷，起到保護心肌作用[5]。但該作用機理，對機體因心肌缺血狀態(tài)下的眩暈是否產(chǎn)生影響，仍需深入研究。為此，本研究旨在通過采用 Morris（Morris Water Maze）水迷宮實驗方法[6]測試小鼠的逃避潛伏期及小鼠的平臺停留時間來探析姜天麻中苯丙素類對抗眩暈作用的影響。在歷版《中藥炮制學(xué)》教材中，天麻炮制的主要方法仍以清蒸后切薄片為主。雖然也有醫(yī)學(xué)典籍記載過酒制、醋制、刺蒺藜制等炮制法，但并未在臨床推廣應(yīng)用。2008年《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》和2011 年《廣東省中藥飲片炮制規(guī)范》載有姜天麻[7～8]，但未開展現(xiàn)代研究。姜天麻為江西“建昌幫”特色炮制飲片，由于缺乏現(xiàn)代研究，致使其臨床應(yīng)用受限。中藥在應(yīng)用前必須進行炮制，而炮制是通過使藥材成分變化而達到減毒增效目的。天麻除天麻素、巴利森苷類外，苯丙素類中肉桂酸也是其有效成分之一。顯然，天麻經(jīng)過姜制后，肉桂酸勢必會受到影響，但對該方面的報道仍處于空白。本研究從肉桂酸成分變化入手，結(jié)合藥效試驗，探討炮制對其抗眩暈作用的影響，為天麻炮制后藥效增強提供理論依據(jù)。現(xiàn)報道如下：

1 材料

1.1 儀器 OSB-2200 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（廈門精藝興業(yè)科技有限公司）；HH-66 多功能數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；KQ5200 超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Morris 水迷宮硬件與視頻分析系統(tǒng)Xeye（V.3.2）（北京天鳴宏遠科技發(fā)展有限公司）；828L 福意聯(lián)恒溫冰箱（2～20℃，青海海爾股份有限公司）；CFXB30 蒸制容器（電飯鍋廉市博鴻電器廠)；cp214 電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；灌胃針、燒杯。

1.2 試藥 鹽酸地芬尼多片（國藥準字H43020325）；β-苯丙烯酸標準品（批號：201903640，中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（AR）、生理鹽水、雙蒸水（實驗室自制）、苦味酸（AR）。實驗用天麻、生姜購于江西省樟樹中藥材市場，天麻經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為蘭科多年生寄生草本植物天麻Gastrodia elata Bl.干燥塊莖。

1.3 動物 昆明種小鼠SPF 級100 只，體質(zhì)量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SYXK（贛）2014-0008。飼養(yǎng)喂以無菌顆粒飼料，自由飲水，鼠房溫度（24±2）℃。

1.4 動物分組與給藥 動物分組：取篩選后小鼠70 只，隨機分為七組，分別為空白組、模型組、陽性對照組、姜提組、高丙組、中丙組、低丙組。采用苦味酸和標簽紙等做好標記。給藥：造模后，模型組灌胃給予各小鼠0.5 ml 生理鹽水溶液；陽性對照組，按照6 mg/kg 用量灌胃給予0.5 ml 鹽酸地芬尼多片溶液；姜提組灌胃給予0.5 ml 姜天麻提取物（濃度為1 g/ml）；高丙組按照9 mg/kg 用量灌胃給予 0.5 ml 肉桂酸溶液；中丙組按照6 mg/kg 用量灌胃給予0.5 ml 肉桂酸溶液；低丙組按照3 mg/kg 用量灌胃給予0.5 ml 肉桂酸溶液；空白組給予等量生理鹽水溶液。

2 方法

2.1 動物篩選 小鼠于標準條件下飼養(yǎng)，采用自由攝食和飲水的方法，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，對各小鼠進行Morris 試驗，選擇逃避潛伏期約120 s 的小鼠為試驗對象，棄用靈活性過差，有視力障礙的小鼠，去掉不合格動物，從中選擇合格小鼠70 只作為研究對象。

2.2 模型制備 采用水迷宮訓(xùn)練，2 次/d，總共訓(xùn)練7 d，除空白組外，其他各組小鼠采用物理眩暈法[9～10]，均于平衡旋轉(zhuǎn)儀上以350 r/min，旋轉(zhuǎn)1 min 驟停，立即將小鼠放入“電擊反射訓(xùn)練儀”電擊，潛伏期在30～250 min，較穩(wěn)定后用于后續(xù)研究。

2.3 藥物制備

2.3.1 姜天麻飲片粉末的制備 取天麻原藥材，依照“建昌幫”炮制法，置清蒸容器里，隔水加熱，使其受熱變軟，取出，取定量生姜搗汁，潤透，使藥透水盡，于20～30℃烘箱中干燥，然后打成粉末，過60 目篩備用。

2.3.2 姜天麻提取物制備 稱取粉碎后姜天麻飲片粉末10 g，加入10 倍量70%乙醇浸潤約30 min 后，置加熱容器里回流提取1 h，過濾，連續(xù)提取3 次，合并提取液，水浴鍋上濃縮至1 g/ml，待無醇味，備用。

2.3.3 其他藥物制備 陽性對照藥物：取鹽酸地芬尼多片，溶解于生理鹽水中，制成濃度為0.4 mg/ml 的藥液備用。高劑量天麻肉桂酸溶液：取肉桂酸，溶解于生理鹽水中，制成濃度為0.6 mg/ml 的藥液備用。中、低劑量組分別為0.4 mg/ml、0.2 mg/ml 藥液，備用。

2.4 水迷宮訓(xùn)練與實驗 各組試驗小鼠于同一環(huán)境條件下進行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d（室溫：22～25℃，濕度50%～70%），自由飲食喂養(yǎng)隔日后，稱重。對不同組別的小鼠灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)7 d，從給藥后第1天開始水迷宮訓(xùn)練，2 次/d，以建立小鼠對逃避電擊條件反射[11]。選取篩選后的健康小鼠，從f 點進入水迷宮裝置內(nèi)，讓其尋找平臺E，在1 min 內(nèi)找到平臺的即為合格小鼠。未找到者，人為地將其引到平臺E，并讓其等待一段時間，如此一天訓(xùn)練2 次。訓(xùn)練結(jié)束后，灌胃給藥，并于1 h 內(nèi)放入水迷宮中以電刺激的方式強迫小鼠去找到平臺E，并記錄尋找平臺時間，即為逃避潛伏期。通過比較各組小鼠逃避潛伏期長短來判斷天麻中肉桂酸的抗眩暈作用差異。除空白組外，其他各組小鼠均于平衡旋轉(zhuǎn)儀上以350 r/min，旋轉(zhuǎn)1 min 后立即從f 點下，采用物理眩暈法，待小鼠訓(xùn)練3 d 后，其水迷宮的成績大致趨于穩(wěn)定，遂以第4、5、6 天的平均成績?yōu)樽罱K逃避潛伏期。第7 天撤掉水迷宮平臺，并記錄各組小鼠在平臺位置停留時間。水迷宮實俯視簡圖見圖1。

圖1 水迷宮實俯視簡圖

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗，計量資料以（）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩組間采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組小鼠逃避潛伏期比較 與空白組比較，模型組各組小鼠逃避潛伏期明顯延長，組間差異顯著（P＜0.01），說明造模成功；模型組逃避潛伏期較空白組延長，差異顯著（P＜0.01）；陽性對照組、姜提組和高丙組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，差異顯著（P＜0.01）；與模型組相比較，低丙組逃避潛伏期稍有延長和中丙組逃避潛伏期稍有縮短，但均不具統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（）

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（）

注：與空白組相比較，*P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.01。

組別 n 劑量（mg/kg） 逃避潛伏期（s）空白組模型組陽性對照組姜提組低丙組中丙組高丙組10 10 10 10 10 10 10--6 6 3 6 9 10.32±1.65 22.21±1.34*14.65±1.62#15.37±2.23#24.71±2.67 21.76±2.56 12.45±1.52#

3.2 各自小鼠平臺停留時間比較 與空白組比較，模型組各組小鼠平臺停留時間明顯縮短，差異顯著（P＜0.01），說明造模成功；模型組平臺停留時間與空白組比較，明顯縮短（P＜0.01）；陽性對照組、姜提組和高丙組平臺停留時間較模型組延長，差異顯著（P＜0.01），低丙組和中丙組平臺停留時間較模型組稍有縮短，但均不具統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各自小鼠平臺停留時間比較（）

表2 各自小鼠平臺停留時間比較（）

注：與空白組相比較，*P＜0.05；與模型組相比較，#P＜0.01。

組別 n 劑量（mg/kg） 平臺停留時間（s）空白組模型組陽性對照組姜提組低丙組中丙組高丙組10 10 10 10 10 10 10--6 6 3 6 9 10.37±1.59 4.65±1.37*6.54±1.22#7.01±1.69#*4.29±1.12 3.99±1.03 7.56±1.38#

4 討論

苯丙素是一類含有苯環(huán)與三個直鏈碳連接（C6-C3基團）結(jié)構(gòu)的化合物[12]，包括香豆素、木脂素等，一般具有苯酚結(jié)構(gòu)，是酚性物質(zhì)。苯丙素類化合物廣泛存在于植物中，其中許多化合物為親脂性成分。肉桂酸（Cinnnamic Acid）[13]化學(xué)名為3-苯基-2-丙烯酸或β-苯基丙烯酸，為苯丙素類化合物，具親脂性，也是天麻化學(xué)成分之一。肉桂酸常用于合成治療冠心病的重要藥物，如心痛平、肉桂苯哌嗪、乳酸可心定等，主要用于治療腦血栓、冠狀動脈硬化、腦動脈等疾病[14]。天麻常用于肝陽上亢之頭目眩暈、頭痛，為治偏頭痛之要藥，而血管痙攣或動脈血管硬化等常常是眩暈、偏頭痛發(fā)病的重要因素。建昌幫姜天麻以生姜為輔料炮制天麻，前期預(yù)試驗表明，天麻經(jīng)姜汁制后，其所含的肉桂酸含量升高。同時，輔料生姜為辛溫之品，具有溫中散寒、祛風(fēng)止痛之效，而姜所含的化學(xué)成分如姜酮和姜烯酮等，能促進血液循環(huán)，并對呼吸和血管運動中樞有興奮作用。生姜單用或與其他溫中散寒藥合用，可緩解眩暈和偏頭痛癥狀[15]。天麻經(jīng)姜制后可提高肉桂酸含量，并與生姜產(chǎn)生協(xié)同作用，這為本研究提供了理論基礎(chǔ)。

抗眩暈是天麻的主要藥效之一。采用水迷宮開展中藥對抗眩暈研究[16]，主要是通過強迫動物游泳或造模眩暈后的小鼠，讓其尋找平臺的一種試驗方法。目的是測試受試小鼠對空間位置的學(xué)習(xí)記憶功能或抗眩暈作用。電擊復(fù)制小鼠眩暈?zāi)Ｐ蚚17]，是研究眩暈的一種常用方法。小鼠被電擊后出現(xiàn)眩暈癥狀，在這種狀況下，會造成小鼠短暫性學(xué)習(xí)記憶喪失。采用水迷宮實驗，通過尋找平臺來比較不同組別小鼠的逃避潛伏期和尋找平臺時間，以判斷藥物對受試動物的抗眩暈作用。該模型復(fù)制及相關(guān)試驗，已應(yīng)用于天麻素抗眩暈作用研究[18]。天麻中肉桂酸、生育酚等苯丙素類成分[19]，雖有抗眩暈作用，但姜制后是否能使其藥效增強，仍需有待驗證。基于此，本研究探討了天麻中的苯丙素類成分肉桂酸對抗眩暈作用的影響。結(jié)果表明，與模型組相比，陽性對照組、姜提組和高丙組，逃避潛伏期明顯縮短，組間差異顯著（P＜0.01），說明天麻經(jīng)姜制后，可提高天麻抗眩暈作用；而低丙組逃避潛伏期稍有延長，以及中丙組逃避潛伏期稍有縮短，但兩者與模型組相比，組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明天麻苯丙素類成分雖然對抗眩暈產(chǎn)生影響，但與其用量有關(guān)，其中高丙組抗眩暈作用明顯，該研究結(jié)果也與考察小鼠逃避潛伏期的結(jié)果一致，在低于一定劑量后抗眩暈作用減少。這種作用機理，可能是由于受試小鼠在通過一定程度量物理旋轉(zhuǎn)后，使其腦部血液循環(huán)發(fā)生障礙，導(dǎo)致一過性腦部供血不足，從而產(chǎn)生頭暈、眼花、腿軟、運動障礙等眩暈癥狀。但其分子作用機制，仍需有待研究。