應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌相關(guān)基因變異

楊德仁,王卓,馬蓉

(江蘇省腫瘤醫(yī)院﹠江蘇省腫瘤防治研究所﹠南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科，b.臨床腫瘤實(shí)驗(yàn)中心，南京 210009)

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率不斷升高[1-2]。其最常見(jiàn)的病理類型為甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)，約占所有甲狀腺癌的85%～90%[3-4]。臨床上通常采用Sanger測(cè)序技術(shù)、免疫組化技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等對(duì)PTC相關(guān)單個(gè)基因，尤其是BRAFp.V600E基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，為輔助鑒別診斷、預(yù)后和治療提供依據(jù)[5-6]。近年來(lái)，與甲狀腺惡性腫瘤的鑒別診斷、預(yù)后與治療密切相關(guān)的新的分子標(biāo)志物不斷涌現(xiàn)[7]。高通量測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)作為新一代測(cè)序技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因的多種變異類型，并可進(jìn)行定量分析[8]。

本研究采用NGS技術(shù)及包含BRAF、HRAS、KRAS、NRAS、TERT、RET、PIK3CA、PTEN、TP53、CTNNB1、AKT1、GNAS、PAX8/PPARγ、NTRK1和TSHR等15個(gè)目標(biāo)基因主要內(nèi)含子和外顯子的引物池對(duì)PTC患者進(jìn)行基因檢測(cè)并分析其結(jié)果。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2019年1月至2020年6月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸科收治且術(shù)后經(jīng)病理診斷為PTC患者的石蠟包埋樣本188例。其中男性66例，女性122例，年齡20～75歲，中位年齡46 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理組織學(xué)明確診斷為PTC；(2)未合并其他腫瘤；(3)分期明確且病例資料完整。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第八版[9]分為Ⅰ期151例，Ⅱ期27例，Ⅲ期3例，Ⅳ期7例。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(南醫(yī)大倫審2020148號(hào))，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Nanodrop2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)， Huber Minichiller 300基因打斷儀(德國(guó)Huber公司)，Biometra TONE PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra公司)，Novaseq 6000 基因測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)。核酸提取試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，德國(guó)凱杰公司)，捕獲磁珠(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.3DNA 提取 按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取188例石蠟包埋樣本的DNA。采用Nanodrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的濃度和純度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的片段化程度。取吸光度(A260/280 nm)值在1.7～1.9之間，DNA濃度大于10 ng/μL的樣本，置于-20 ℃保存。

1.4NGS文庫(kù)構(gòu)建 提取的DNA首先通過(guò)Huber Minichiller 300基因打斷儀進(jìn)行打斷。然后進(jìn)行末端修復(fù)，磷酸化和添加“adaptor”接頭。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增已添加“adaptor”接頭的DNA。利用捕獲磁珠純化擴(kuò)增產(chǎn)物，使用捕獲探針進(jìn)行雜交，利用磁珠進(jìn)行篩選。再次對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并添加單端“index”標(biāo)簽。文庫(kù)混合，利用Novaseq 6000 基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.5生物信息學(xué)分析 通過(guò)BWA Aligner 0.7.10軟件將測(cè)序原始數(shù)據(jù)與人類基因組(hg19)進(jìn)行比對(duì)。利用GATK 4.0.2.0和VarScan.v2.3.9軟件分析基因突變數(shù)據(jù)。利用Factera 1.4.4軟件分析基因融合數(shù)據(jù)。目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度≥500×，目標(biāo)區(qū)域覆蓋率≥99%，目標(biāo)區(qū)域測(cè)序深度均一性≥90%?；蛲蛔冾l率大于1%的樣品視為陽(yáng)性突變。

2 結(jié)果

2.1基因突變?cè)赑TC患者中的分布情況 共計(jì)80.32%(151/188)的標(biāo)本檢出突變，19.68%(37/188)的標(biāo)本未檢出突變。此外，74.47%(140/188)的標(biāo)本檢出1個(gè)點(diǎn)突變或基因融合突變，5.32%(10/188)的標(biāo)本同時(shí)檢出2個(gè)點(diǎn)突變，其中BRAF和TERT基因雙突變 6例，BRAF和CTNNB1基因、GNAS基因、TP53基因、PIK3CA基因雙突變各1例。0.53%(1/188)的標(biāo)本同時(shí)檢出TERT、NRAS和TP53基因3個(gè)點(diǎn)突變。151例突變標(biāo)本中共計(jì)檢出點(diǎn)突變及基因融合突變163個(gè)，其中BRAF基因突變率最高(表1)。BRAF基因突變均為典型的p.V600E位點(diǎn)突變。TERT基因突變以啟動(dòng)子區(qū)C228T位點(diǎn)突變?yōu)橹鳌ET基因融合突變以CCDC6-RET基因融合突變?yōu)橹?。基因融合突變均為?dú)立出現(xiàn)。

表1 高通量測(cè)序法檢測(cè)PTC患者基因突變種類匯總

2.2基因突變豐度比較 結(jié)果表明，基因點(diǎn)突變等位基因突變豐度范圍為1.10%～48.04%。基因融合突變讀長(zhǎng)(reads)比例范圍為2.30%～55.52%。在雙突變的標(biāo)本中，2個(gè)不同突變等位基因突變豐度基本一致。此外，在TERT、NRAS和TP533個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變的標(biāo)本中，TERT和NRAS基因等位基因突變豐度基本一致(分別為33.62%和39.67%)，而TP53基因等位基因突變豐度僅為4.13%。

2.3PTC患者基因突變與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 Pearsonχ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，PTC患者基因突變與性別(χ2=0.585，P>0.05)、年齡(χ2=0.575，P>0.05)及臨床分期(χ2=0.711，P>0.05)均無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表2。

表2 PTC患者基因突變與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

3 討論

以NGS技術(shù)為基礎(chǔ)的基因檢測(cè)在PTC患者中的應(yīng)用已見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)對(duì)PTC患者基因突變進(jìn)行高通量分析，可為全面了解PTC相關(guān)腫瘤生物學(xué)特性提供技術(shù)支持。近年來(lái)研究表明，除BRAF基因外,HRAS、KRAS、NRAS、TERT、RET、PIK3CA、PTEN、TP53、CTNNB1,AKT1、GNAS、PAX8/PPARγ、NTRK1和TSHR等基因也被臨床上用于甲狀腺惡性腫瘤的鑒別診斷，并證實(shí)與患者預(yù)后及治療密切相關(guān)[7,10-18]。故而本研究選擇了上述15個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行NGS檢測(cè)，分析其在PTC患者中的變異情況。

本研究結(jié)果證實(shí)，TSHR、AKT1、PETN、KRAS和PAX8基因未檢出突變，這與一些國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道的結(jié)果不一致[7,10,19]。Ke等[19]研究指出，甲狀腺腫瘤患者基因突變類型包括點(diǎn)突變、插入/缺失突變、基因融合突變等多種類型，并進(jìn)一步證實(shí)插入/缺失突變存在于甲狀腺髓樣癌中，插入/缺失突變可能是甲狀腺髓樣癌特有的突變類型，卻不存在于乳頭狀癌中。而本研究?jī)H發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變和基因融合突變兩種類型。

趙競(jìng)等[7]研究指出，BRAF基因p.V600E位點(diǎn)突變發(fā)生于36%～83%的病例中，且通常是獨(dú)立出現(xiàn)，不與RET/PTC重組或RAS突變同時(shí)存在。BRAF基因p.V600E位點(diǎn)突變?yōu)楸狙芯恐凶钪饕耐蛔冾愋?，并證實(shí)其不與RET/PTC重組或RAS突變同時(shí)存在。但本研究發(fā)現(xiàn)14例標(biāo)本發(fā)生了含有BRAF基因p.V600E位點(diǎn)突變的雙突變事件，具體原因尚需進(jìn)一步分析。TP53基因作為重要的抑癌基因，通常認(rèn)為僅發(fā)生在未分化的甲狀腺癌中，但近期研究[7]表明，乳頭狀癌和濾泡狀癌中也存在TP53基因突變，且通常預(yù)后很差。本研究中也檢測(cè)出1例PTC患者存在TP53基因突變，進(jìn)一步證實(shí)了TP53基因并不局限存在于未分化的甲狀腺癌中。

本研究發(fā)現(xiàn)的雙突變的標(biāo)本中，2個(gè)不同突變等位基因突變豐度基本一致，這表明突變均來(lái)源于相同的細(xì)胞克隆群。但在1例3個(gè)基因同時(shí)發(fā)生突變的標(biāo)本中，TP53基因的等位基因突變豐度顯著低于其他2個(gè)基因，推測(cè)原因可能是TP53基因突變是此腫瘤克隆進(jìn)展的晚期事件。

本研究也存在以下不足之處：(1)樣本量偏少且來(lái)源單一，本研究188例標(biāo)本均為手術(shù)后癌組織石蠟包埋標(biāo)本，并未涉及細(xì)針穿刺活檢及空芯針穿刺活檢標(biāo)本；(2)本研究?jī)H檢測(cè)DNA突變及RNA融合突變，并未將非編碼單鏈RNA分子(miRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)等腫瘤領(lǐng)域熱門的分子標(biāo)志物納入研究范圍。下一步的研究將加大樣本量及樣本類型，并擴(kuò)大檢測(cè)研究的范圍。

綜上所述，利用NGS技術(shù)檢測(cè)具有通量高、經(jīng)濟(jì)、效率高和可定量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，對(duì)甲狀腺腫瘤15個(gè)相關(guān)基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，可進(jìn)一步全面理解PTC相關(guān)腫瘤生物學(xué)特性，為患者的診斷、預(yù)后和個(gè)體化治療提供依據(jù)。